两种种植材料对龈下优势菌粘附的影响
作者：柴枫 鲜苏琴 高宁 肖晓蓉 朱硃 刘豫蓉
单位：柴枫 鲜苏琴 高宁(华西医科大学口腔医学院修复科 610041)；肖晓蓉 朱硃 刘豫蓉(华西医科大学口腔医学院卫生部生物医学工程重点实验室)
关键词：牙种植体；钛；钛-6铝-4钒合金；粘附；龈下优势菌
实用口腔医学杂志000401〔摘要〕目的：研究不同龈下优势菌在种植材料表面的粘附特征。方法：通过将两种种植材料纯钛(TA2)及钛-6铝-4钒合金(TC4)试件分别与3种单一龈下优势菌S.s、F.n、P.g及其混合菌共同厌氧孵育，采用菌落形成单位(CFU)计数法量化测定培养试件表面的细菌粘附量，同时用扫描电镜观察材料表面形貌及细菌粘附情况。结果：TC4表面的各单一细菌及混合菌粘附量均少于TA2。结论：从微生态学角度而言，TC4作为种植材料应当比TA2更有利于种植体周的菌斑控制和种植的远期成功。
, 百拇医药
中图分类号：R780.2 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)04-0253-04
The influence of two lmplant materials on the adhesion of three subgingival pred ominant bacteria
Chai Feng,Xian Suqin,Gao Ning,et al.
(Department of Prosthodontics,College of Stom atology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
〔Abstracts〕Objective:To study the adhesion of subgingival predominant bacteria on implant materials.Methods:Under continual anaerobic inc ubation,the in vitro a dhesion of three subgingival predominant bacteria,Streptococcus sanguis (S.s),Porphyromanus gingivalis (P.g),Fusobacterium nucleatum(F.n) or their mixture,to two widely used implant materials Titanium (TA2) and Ti-6Al-4V alloy (TC4) plates were investigated respectively.The quantification of the attached bacteria on the sur faces of the material was assayed by means of clone forming unit (CFU)method 2,7 and 14 days after the bacteria were seeded onto the meterials;the morphology of bacterial adhered to the materials was examined by scanning electron microscopy (SEM).Results:Under both individual & mixed bacterial culture conditions,the amount of bacteria attached to the surface of TC4 were less than that of TA2 (P<0.05),given that their surface roughness was almost the same.Conclusion:As far as the microecologic aspects are concerned,TC4 as implant material is more beneficial than TA2 to the plaque control around the implant and to long-term success of the implant therapy.
, 百拇医药
Key words Endossous dental Implantation;Titanum;Ti-6Al-4V alloy;Adhesions;Subgingival predominant bacteria
口腔微生物因素是造成种植体周围炎发病进而异致种植失败的要素之一〔1〕，而微生物在种植材料表面的粘附是其定植甚至致病的首要步骤和前提条件〔2〕。长期以来，此方面的体内外研究开展较少，并且由于实验设计、检测手段等方面的缺陷，造成实验结果差异较大，尤其是缺乏令人信服的客观量化资料。
本研究采用试验效率高、节省样本量的配伍组设计，独创性应用菌落形成单位计数法量化测定了不同培养时间段内，两种常用金属种植材料表面单一或混合龈下优势菌的粘附量，另外采用扫描电镜观察材料表面形貌及细菌的粘附情况，获取相关检测指标的量化资料及图象资料，旨在探索从微生态学角度评价种植材料的基本标准和方法。
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1 材料和方法
1.1 材料及试件
两种种植材料商业纯钛(TA2)及钛-6铝-4钒合金(TC4)均系宝鸡有色金属研究院研制，并通过四川联大分析测试中心鉴定。两种材料试件各25个，分别为TA2：15 mm×5.4 mm× 0.9 m m(表面积为198.22 mm2和TC4:14.6 mm×6.0 mm×1.3 mm(表面积为228.46 mm2的长方形片状，经机械及化学抛光方法处理后，表面粗糙度达GB11级以上〔3〕。经蒸馏水、超声振荡洗涤，高压蒸气灭菌后，保持清洁无菌备用。
1.2 实验菌株及实验菌液
血链球菌(Streptococcus sanguis,S.s)ATCC 10556，具核酸杆菌(Fusobacteriumnu cleatum,F.n)ATCC 10953及牙龈卟啉单胞菌(Porphyromanus gingivalis,P.g)ATCC 33 277,以上菌株均由华西医科大学口腔医学院卫生部生物医学工种重点实验室提供。各菌经厌氧复苏、纯化后制成吸光度(A)(α=540 nm，UV-1601型全自动分光光度计)为1.0的PBS菌悬液(菌量约为9×1011 CFU/L)作为单一菌的实验菌液；根据预实验结果，将P.g、F.n、S.s 3种单一菌液按4∶3∶2的体积比混合后作为混合菌的实验菌液备用。
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1.3 试件与细菌的孵育
两种材料与3种单一龈下优势菌及其混合菌间每种实验组合各备3支培养试管，每管内置入2个完全相同的试件及无菌BHI液体培养基5 ml，相应实验菌液0.5 ml，封好管口后连续厌氧培养〔37 ℃，φ(N2)=80%，φ(CO2)=10%，φ(H2)=10%〕2、7、14 d后分别依次取出待测。
1.4 测试方法
孵育后取出试件，冲洗表面残留的培养液及非附着菌块，其中一个放入1 ml无菌PBS液中超声振荡洗涤1 min，洗涤液进行10倍系列稀释后，选择能准确计数的最佳稀释度样液10μl滴于BHI琼脂平板表面，均匀涂布开后厌氧培养48 h，进行菌落形成单位计数，并将计数结果换算成材料单位表面积内的细菌粘附量；对混合菌粘附量的测定根据平板上其各组成菌菌落的特征差异进行分别计数。
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另一个试件则放入2.4 mol/L戊二醛液中固定3 h，经乙醇逐级脱水，自然干燥后作扫描电镜(J840A，Jeol，Japan)观察。
1.5 统计分析方法
采用PEMS统计软件包(第2版)对于细菌粘附量数据进行方差分析(ANOVA)及Newman-Keuls法检验组间差异，对混合菌中各组成菌构成比资料采用χ2检验比较分析。
2 结 果
2.1 材料表面细菌粘附量的CFU计数(结果见表1、2)。
表1 单一菌培养环境中的试件表面细菌粘附量测定结果 (×107 CFU/L) 材料
培养时间
, 百拇医药
2 d
7 d
14 d
S.s
F.n
P.g
S.s
F.n
P.g
S.s
F.n
P.g
TA2
, 百拇医药
1.057
0.377
0.811
1.812
0.805
1.258
2.063
1.208
1.560
TC4
0.656
0.219
, 百拇医药 0.590
1.399
0.525
0.830
1.487
0.787
1.049
表2 混合菌培养环境中试件表面各菌粘附量的测定结果 (×107CFU/L) 材料
培养时间
2 d
7 d
14 d
, 百拇医药
S.s
F.n
P.g
S.s
F.n
P.g
S.s
F .n
P.g
TA2
1.258
0.115
0.010
, 百拇医药
1.510
0.201
0.020
1.610
0.226
0.060
TC4
0.568
0.052
0.008
1.093
0.102
, http://www.100md.com 0.021
1.301
0.135
0.066
统计分析结果表明：各培养时间段内，两种材料组间的单一菌及混合菌中各组成菌(除P.g外)粘附量差异均有统计学意义(P<0.05)，可见在实验期内，无论是单一或混合龈下优势菌在纯钛表面的粘附量均明显高于钛合金；此外各材料组内，不同培养时间段间的细菌粘附量差异亦有统计学意义(P<0.05)，即细菌在材料表面的粘附量随培养时间的延长而增加。
2.2 孵育后试件表面的扫描电镜观察(见图1～10)
图1 TA2表面S.s的粘附情况(培养2 d)，SEM×3000
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图2 TA2表面S.s的粘附情况(培养14 d)，SEM×5000
图3 TC4表面P.g的粘附情况(培养7 d)，SEM×4000
图4 TC4表面P.g的粘附情况(培养14 d)，SEM×4000
图5 TC4表面F.n的粘附情况(培养2 d)，SEM×5000
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图6 TC4表面F.n的粘附情况(培养7 d)，SEM×5000
图7 TA2表面混合菌的粘附情况(培养2 d)，SEM×3000
图8 TA2表面混合菌的粘附情况(培养7 d)，SEM×6000
图9 TC4表面混合菌的粘附情况(培养2 d)，SEM×6000
, 百拇医药
图10 TC4表面混合菌的粘附情况(培养7 d)，SEM×5000
电镜观察发现，两种种植材料的表面形貌相似，均存留机械打磨的划痕。单一培养条件下，可见S.s、F.n、P.g的菌体形态分别为球状、球杆状及杆状(图1、3、5)；随培养时间的延长，细菌粘附密度增大，且在材料表面的缺陷部位如划痕、凹陷处，细菌聚集更为显著(图2、4)；杆菌呈现出以与划痕垂直方向粘附的独特方式排列(图5、6)。混合培养条件下，可见孵育2 d后的材料表面已有球杆菌附着(图7、9)；孵育7 d后细菌粘附密度增大，各菌间的集聚现象更为普遍，球菌有以杆菌为核心包绕分布的趋势(图8、10)。
3 讨 论
3.1 龈下优势菌在钛种植材料表面的粘附
粘附是细菌成为口腔固有菌群甚至致病的前提条件，该过程机制虽复杂，但本质仍是被粘附基质表面与细菌表面间的相互作用，因此基质及细菌表面的化学成分和物理特性是决定材料表面所粘附微生物的种类、数量及部位的重要因素〔2〕。钛及钛合金种植材料表面通常均存在一层钛氧化膜，物化性能较稳定，但在体液环境中可因发生水化作用而形成富羟基外层，对于唾液及龈沟液中的一些生物活性大分子有选择性吸附作用；另一方面许多细菌表面均有被称为“粘结素”的表面立体化学结构，如S.s表面有能结合唾液酸的蛋白，P.g表面的菌毛、细菌血凝集素等，基质表面所吸附的大分子与细菌表面的粘结素之间可通过 “受体—配体”作用模式相互结合，成为介导细菌特异性粘附于种植材料表面的分子基础〔4〕。本研究结果表明，在实验程期内，无论是单一或混合龈下优势菌培养环境中，各菌在钛合金表面的粘附量均明显低于纯钛。由于采取批量加工试件、扫描电镜定性观察等措施可以较好地保证两种材料的表面粗糙度等物理特性的一致性，因此材料表面层的化学组分差异可能与之有关。虽然钛种植材料均有氧化膜外层，但钛合层(TC4)表面的氧化膜中除含氧化钛外，还含有氧化铝、氧化钒，后两者化学稳定性更强，不易水化形成富羟基区，从而影响材料表面对龈沟液中生物大分子的吸附，故介导细菌粘附的作用相对较弱，造成细菌粘附量降低。另外材料基体组成及晶格排列的差异，亦使其对表面层的电场效应亦有所不同〔5〕，可能致使材料表面特性变化而影响细菌粘附。同时也提示，钛合金作为种 植材料应比纯钛更利于种植体周菌斑控制。
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3.2 牙菌斑与钛种植材料表面菌斑的形成
体内牙菌斑的成熟有一定的时间规律性〔6〕，最初粘附于牙面的多是G+球菌，2 d时菌斑仍以球菌为主，3 d后菌斑中丝、杆菌含量增高，排列方式亦由疏松无序趋于紧密有序。一般7～14d方可形成含基底层、中间层和外层三层基本结构的成熟菌斑。本研究正是选择了2、7、14 d这几个菌斑形成过程中较关键的时间点进行观察，以动态考察种植材料表面菌斑的形成情况，也便于与体内牙菌斑比较。
扫描电镜观察单一或混合培养环境中孵育后试件表面，发现材料表面粘附细菌的凝聚现象(coaggregation)随着培养时间的延长而趋显著。由于体外培养环境与体内环境的差异以及种植材料表面物化特性与牙体组织的显著不同，不难理解钛种植材料表面菌斑形成的时间规律性与牙菌斑有所不同，例如培养2 d时材料表面就同时有球、杆菌粘附，然而凝聚现象〔7〕作为不同类型细菌表面分子间相互识别的结果，则是任何基质表面菌斑形成所必需的。通常介导细菌间凝聚的多系植物凝集素样成分和碳氢化合物的相互作用，早期定植菌如链球菌、放线菌间的相互凝聚，而晚期定植菌如放线杆菌，卟啉单胞菌等的相互凝聚，但早期定植菌不识别晚期定植菌，成为这两组细菌的粘结桥。因此它无论在健康或病变部位均是优势菌，而且细菌凝聚的外形也凝聚菌间的含量比例有一定关系。Kolenbrander等的研究结果发现F.n与P.g以等比例混合时凝聚最强；以1∶80混合时，P.g沿F.n长轴排列成玉米棒状；以1∶10混合时，P.g与F.n形成网状结构样凝聚，其中存在玉米棒样结构，这与本研究中所观察到的情况有相似之处，但因混合比例上的不同，造成了细菌凝聚形态上亦有一定差异。由于菌斑是微生物定植的基本结构，菌斑积滞是局部软、硬组织健康的危险因素之一，因此对于细菌间凝聚机制及抑制方式的深入探讨，可望成为菌斑控制的另一途径 。
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3.3 关于本研究混合菌液中各组成菌混合比例的选择
不同微生物对于生长环境的适应能力及营养要求不尽相同，混合培养条件下各组成菌之间可能存在竞争或拮抗等相互作用，因此在相同培养环境、培养条件下不同微生物的生长情况差异很大，通过研究作者发现本实验条件下相同环境中的混合菌各组成菌构成比在短期内(2 d)即发生显著变化，S.s的生长量远高于F.n及P.g(P<0.02)。多次预实验结果 证明本研究条件下采用天然口腔菌群构成比或各菌等比例混合都无法在较长实验程期(7 d或14 d)内，保证各组成菌的存留，难以连续动态地观察到各菌生长粘附特点。同时却发现采用S.s、F.n：P.g=2∶3∶4的比例混合各菌时，有意识提高生长能力相对较弱的P.g及F.n在其中的比例，以期弥补其在本实验条件下与S.s在生长能力上的差异，能够保证整个实验程期内始终有足够达到可检出浓度的3种组成菌存在，更有利于观察其彼此间相互关系受到实验暴露因素影响与否。
本课题由国家自然科学基金资助 39600166
, 百拇医药
参考文献
1，Mombelli A,Van Oosten MAC,Schurrch E,et al.The microbiota associated with successful or failing osseo-integrated implants.J Oral Microbiol Immunol,1987,2(1):145
2，Quirynen M,Bollen CML.The influence of surface roughness and surface free energy on supra and subgingival plaque formation in man.J Clin Periodontol,1995,22(1):1
3，吕碧昌,刘国栋,秦红主编.机电基础标准实用简明手册.贵阳:贵州人民出版社,1991.134～135
, http://www.100md.com
4，David K,Klinger A,Steiberg D,et al.Adsorption of salivary proteins onto prosthetic Ti components.J Prosthet Dent,1995,74(6):531
5，欧国敏.界面形成过程中硬组织替代材料表面化学变化的研究进展.国外医学口腔分册,199 7，24(4)：231
6，岳松龄主编.现代龋病学.北京:北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社，1993.45～101
7，陆卫青.牙周微生态研究进展.国外医学口腔分册,1998，25(3)：145
收稿：1999-09-14
修回：2000-01-08, http://www.100md.com
单位：柴枫 鲜苏琴 高宁(华西医科大学口腔医学院修复科 610041)；肖晓蓉 朱硃 刘豫蓉(华西医科大学口腔医学院卫生部生物医学工程重点实验室)
关键词：牙种植体；钛；钛-6铝-4钒合金；粘附；龈下优势菌
实用口腔医学杂志000401〔摘要〕目的：研究不同龈下优势菌在种植材料表面的粘附特征。方法：通过将两种种植材料纯钛(TA2)及钛-6铝-4钒合金(TC4)试件分别与3种单一龈下优势菌S.s、F.n、P.g及其混合菌共同厌氧孵育，采用菌落形成单位(CFU)计数法量化测定培养试件表面的细菌粘附量，同时用扫描电镜观察材料表面形貌及细菌粘附情况。结果：TC4表面的各单一细菌及混合菌粘附量均少于TA2。结论：从微生态学角度而言，TC4作为种植材料应当比TA2更有利于种植体周的菌斑控制和种植的远期成功。
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中图分类号：R780.2 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)04-0253-04
The influence of two lmplant materials on the adhesion of three subgingival pred ominant bacteria
Chai Feng,Xian Suqin,Gao Ning,et al.
(Department of Prosthodontics,College of Stom atology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
〔Abstracts〕Objective:To study the adhesion of subgingival predominant bacteria on implant materials.Methods:Under continual anaerobic inc ubation,the in vitro a dhesion of three subgingival predominant bacteria,Streptococcus sanguis (S.s),Porphyromanus gingivalis (P.g),Fusobacterium nucleatum(F.n) or their mixture,to two widely used implant materials Titanium (TA2) and Ti-6Al-4V alloy (TC4) plates were investigated respectively.The quantification of the attached bacteria on the sur faces of the material was assayed by means of clone forming unit (CFU)method 2,7 and 14 days after the bacteria were seeded onto the meterials;the morphology of bacterial adhered to the materials was examined by scanning electron microscopy (SEM).Results:Under both individual & mixed bacterial culture conditions,the amount of bacteria attached to the surface of TC4 were less than that of TA2 (P<0.05),given that their surface roughness was almost the same.Conclusion:As far as the microecologic aspects are concerned,TC4 as implant material is more beneficial than TA2 to the plaque control around the implant and to long-term success of the implant therapy.
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Key words Endossous dental Implantation;Titanum;Ti-6Al-4V alloy;Adhesions;Subgingival predominant bacteria
口腔微生物因素是造成种植体周围炎发病进而异致种植失败的要素之一〔1〕，而微生物在种植材料表面的粘附是其定植甚至致病的首要步骤和前提条件〔2〕。长期以来，此方面的体内外研究开展较少，并且由于实验设计、检测手段等方面的缺陷，造成实验结果差异较大，尤其是缺乏令人信服的客观量化资料。
本研究采用试验效率高、节省样本量的配伍组设计，独创性应用菌落形成单位计数法量化测定了不同培养时间段内，两种常用金属种植材料表面单一或混合龈下优势菌的粘附量，另外采用扫描电镜观察材料表面形貌及细菌的粘附情况，获取相关检测指标的量化资料及图象资料，旨在探索从微生态学角度评价种植材料的基本标准和方法。
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1 材料和方法
1.1 材料及试件
两种种植材料商业纯钛(TA2)及钛-6铝-4钒合金(TC4)均系宝鸡有色金属研究院研制，并通过四川联大分析测试中心鉴定。两种材料试件各25个，分别为TA2：15 mm×5.4 mm× 0.9 m m(表面积为198.22 mm2和TC4:14.6 mm×6.0 mm×1.3 mm(表面积为228.46 mm2的长方形片状，经机械及化学抛光方法处理后，表面粗糙度达GB11级以上〔3〕。经蒸馏水、超声振荡洗涤，高压蒸气灭菌后，保持清洁无菌备用。
1.2 实验菌株及实验菌液
血链球菌(Streptococcus sanguis,S.s)ATCC 10556，具核酸杆菌(Fusobacteriumnu cleatum,F.n)ATCC 10953及牙龈卟啉单胞菌(Porphyromanus gingivalis,P.g)ATCC 33 277,以上菌株均由华西医科大学口腔医学院卫生部生物医学工种重点实验室提供。各菌经厌氧复苏、纯化后制成吸光度(A)(α=540 nm，UV-1601型全自动分光光度计)为1.0的PBS菌悬液(菌量约为9×1011 CFU/L)作为单一菌的实验菌液；根据预实验结果，将P.g、F.n、S.s 3种单一菌液按4∶3∶2的体积比混合后作为混合菌的实验菌液备用。
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1.3 试件与细菌的孵育
两种材料与3种单一龈下优势菌及其混合菌间每种实验组合各备3支培养试管，每管内置入2个完全相同的试件及无菌BHI液体培养基5 ml，相应实验菌液0.5 ml，封好管口后连续厌氧培养〔37 ℃，φ(N2)=80%，φ(CO2)=10%，φ(H2)=10%〕2、7、14 d后分别依次取出待测。
1.4 测试方法
孵育后取出试件，冲洗表面残留的培养液及非附着菌块，其中一个放入1 ml无菌PBS液中超声振荡洗涤1 min，洗涤液进行10倍系列稀释后，选择能准确计数的最佳稀释度样液10μl滴于BHI琼脂平板表面，均匀涂布开后厌氧培养48 h，进行菌落形成单位计数，并将计数结果换算成材料单位表面积内的细菌粘附量；对混合菌粘附量的测定根据平板上其各组成菌菌落的特征差异进行分别计数。
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另一个试件则放入2.4 mol/L戊二醛液中固定3 h，经乙醇逐级脱水，自然干燥后作扫描电镜(J840A，Jeol，Japan)观察。
1.5 统计分析方法
采用PEMS统计软件包(第2版)对于细菌粘附量数据进行方差分析(ANOVA)及Newman-Keuls法检验组间差异，对混合菌中各组成菌构成比资料采用χ2检验比较分析。
2 结 果
2.1 材料表面细菌粘附量的CFU计数(结果见表1、2)。
表1 单一菌培养环境中的试件表面细菌粘附量测定结果 (×107 CFU/L) 材料
培养时间
, 百拇医药
2 d
7 d
14 d
S.s
F.n
P.g
S.s
F.n
P.g
S.s
F.n
P.g
TA2
, 百拇医药
1.057
0.377
0.811
1.812
0.805
1.258
2.063
1.208
1.560
TC4
0.656
0.219
, 百拇医药 0.590
1.399
0.525
0.830
1.487
0.787
1.049
表2 混合菌培养环境中试件表面各菌粘附量的测定结果 (×107CFU/L) 材料
培养时间
2 d
7 d
14 d
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S.s
F.n
P.g
S.s
F.n
P.g
S.s
F .n
P.g
TA2
1.258
0.115
0.010
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1.510
0.201
0.020
1.610
0.226
0.060
TC4
0.568
0.052
0.008
1.093
0.102
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1.301
0.135
0.066
统计分析结果表明：各培养时间段内，两种材料组间的单一菌及混合菌中各组成菌(除P.g外)粘附量差异均有统计学意义(P<0.05)，可见在实验期内，无论是单一或混合龈下优势菌在纯钛表面的粘附量均明显高于钛合金；此外各材料组内，不同培养时间段间的细菌粘附量差异亦有统计学意义(P<0.05)，即细菌在材料表面的粘附量随培养时间的延长而增加。
2.2 孵育后试件表面的扫描电镜观察(见图1～10)
图1 TA2表面S.s的粘附情况(培养2 d)，SEM×3000
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图2 TA2表面S.s的粘附情况(培养14 d)，SEM×5000
图3 TC4表面P.g的粘附情况(培养7 d)，SEM×4000
图4 TC4表面P.g的粘附情况(培养14 d)，SEM×4000
图5 TC4表面F.n的粘附情况(培养2 d)，SEM×5000
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图6 TC4表面F.n的粘附情况(培养7 d)，SEM×5000
图7 TA2表面混合菌的粘附情况(培养2 d)，SEM×3000
图8 TA2表面混合菌的粘附情况(培养7 d)，SEM×6000
图9 TC4表面混合菌的粘附情况(培养2 d)，SEM×6000
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图10 TC4表面混合菌的粘附情况(培养7 d)，SEM×5000
电镜观察发现，两种种植材料的表面形貌相似，均存留机械打磨的划痕。单一培养条件下，可见S.s、F.n、P.g的菌体形态分别为球状、球杆状及杆状(图1、3、5)；随培养时间的延长，细菌粘附密度增大，且在材料表面的缺陷部位如划痕、凹陷处，细菌聚集更为显著(图2、4)；杆菌呈现出以与划痕垂直方向粘附的独特方式排列(图5、6)。混合培养条件下，可见孵育2 d后的材料表面已有球杆菌附着(图7、9)；孵育7 d后细菌粘附密度增大，各菌间的集聚现象更为普遍，球菌有以杆菌为核心包绕分布的趋势(图8、10)。
3 讨 论
3.1 龈下优势菌在钛种植材料表面的粘附
粘附是细菌成为口腔固有菌群甚至致病的前提条件，该过程机制虽复杂，但本质仍是被粘附基质表面与细菌表面间的相互作用，因此基质及细菌表面的化学成分和物理特性是决定材料表面所粘附微生物的种类、数量及部位的重要因素〔2〕。钛及钛合金种植材料表面通常均存在一层钛氧化膜，物化性能较稳定，但在体液环境中可因发生水化作用而形成富羟基外层，对于唾液及龈沟液中的一些生物活性大分子有选择性吸附作用；另一方面许多细菌表面均有被称为“粘结素”的表面立体化学结构，如S.s表面有能结合唾液酸的蛋白，P.g表面的菌毛、细菌血凝集素等，基质表面所吸附的大分子与细菌表面的粘结素之间可通过 “受体—配体”作用模式相互结合，成为介导细菌特异性粘附于种植材料表面的分子基础〔4〕。本研究结果表明，在实验程期内，无论是单一或混合龈下优势菌培养环境中，各菌在钛合金表面的粘附量均明显低于纯钛。由于采取批量加工试件、扫描电镜定性观察等措施可以较好地保证两种材料的表面粗糙度等物理特性的一致性，因此材料表面层的化学组分差异可能与之有关。虽然钛种植材料均有氧化膜外层，但钛合层(TC4)表面的氧化膜中除含氧化钛外，还含有氧化铝、氧化钒，后两者化学稳定性更强，不易水化形成富羟基区，从而影响材料表面对龈沟液中生物大分子的吸附，故介导细菌粘附的作用相对较弱，造成细菌粘附量降低。另外材料基体组成及晶格排列的差异，亦使其对表面层的电场效应亦有所不同〔5〕，可能致使材料表面特性变化而影响细菌粘附。同时也提示，钛合金作为种 植材料应比纯钛更利于种植体周菌斑控制。
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3.2 牙菌斑与钛种植材料表面菌斑的形成
体内牙菌斑的成熟有一定的时间规律性〔6〕，最初粘附于牙面的多是G+球菌，2 d时菌斑仍以球菌为主，3 d后菌斑中丝、杆菌含量增高，排列方式亦由疏松无序趋于紧密有序。一般7～14d方可形成含基底层、中间层和外层三层基本结构的成熟菌斑。本研究正是选择了2、7、14 d这几个菌斑形成过程中较关键的时间点进行观察，以动态考察种植材料表面菌斑的形成情况，也便于与体内牙菌斑比较。
扫描电镜观察单一或混合培养环境中孵育后试件表面，发现材料表面粘附细菌的凝聚现象(coaggregation)随着培养时间的延长而趋显著。由于体外培养环境与体内环境的差异以及种植材料表面物化特性与牙体组织的显著不同，不难理解钛种植材料表面菌斑形成的时间规律性与牙菌斑有所不同，例如培养2 d时材料表面就同时有球、杆菌粘附，然而凝聚现象〔7〕作为不同类型细菌表面分子间相互识别的结果，则是任何基质表面菌斑形成所必需的。通常介导细菌间凝聚的多系植物凝集素样成分和碳氢化合物的相互作用，早期定植菌如链球菌、放线菌间的相互凝聚，而晚期定植菌如放线杆菌，卟啉单胞菌等的相互凝聚，但早期定植菌不识别晚期定植菌，成为这两组细菌的粘结桥。因此它无论在健康或病变部位均是优势菌，而且细菌凝聚的外形也凝聚菌间的含量比例有一定关系。Kolenbrander等的研究结果发现F.n与P.g以等比例混合时凝聚最强；以1∶80混合时，P.g沿F.n长轴排列成玉米棒状；以1∶10混合时，P.g与F.n形成网状结构样凝聚，其中存在玉米棒样结构，这与本研究中所观察到的情况有相似之处，但因混合比例上的不同，造成了细菌凝聚形态上亦有一定差异。由于菌斑是微生物定植的基本结构，菌斑积滞是局部软、硬组织健康的危险因素之一，因此对于细菌间凝聚机制及抑制方式的深入探讨，可望成为菌斑控制的另一途径 。
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3.3 关于本研究混合菌液中各组成菌混合比例的选择
不同微生物对于生长环境的适应能力及营养要求不尽相同，混合培养条件下各组成菌之间可能存在竞争或拮抗等相互作用，因此在相同培养环境、培养条件下不同微生物的生长情况差异很大，通过研究作者发现本实验条件下相同环境中的混合菌各组成菌构成比在短期内(2 d)即发生显著变化，S.s的生长量远高于F.n及P.g(P<0.02)。多次预实验结果 证明本研究条件下采用天然口腔菌群构成比或各菌等比例混合都无法在较长实验程期(7 d或14 d)内，保证各组成菌的存留，难以连续动态地观察到各菌生长粘附特点。同时却发现采用S.s、F.n：P.g=2∶3∶4的比例混合各菌时，有意识提高生长能力相对较弱的P.g及F.n在其中的比例，以期弥补其在本实验条件下与S.s在生长能力上的差异，能够保证整个实验程期内始终有足够达到可检出浓度的3种组成菌存在，更有利于观察其彼此间相互关系受到实验暴露因素影响与否。
本课题由国家自然科学基金资助 39600166
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参考文献
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7，陆卫青.牙周微生态研究进展.国外医学口腔分册,1998，25(3)：145
收稿：1999-09-14
修回：2000-01-08, http://www.100md.com