可吸收内固定材料L/DL-聚乳酸的体外生物学评价
作者：张力 吕春堂 周树夏 熊成东
单位：张力 吕春堂 周树夏(第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科)；熊成东(中科院成都有机化学研究所)
关键词：骨折内固定术；可吸收；聚乳酸；生物相容性材料
实用口腔医学杂志000510
〔摘要〕 目的：对自行研制的医用可吸收内固定材料L/DL-聚乳酸〔P(L/DL)LA〕的体外生物相容性进行评价。方法：使用细胞毒性试验、溶血试验和热原试验等3种方法。结果：①培养的L929小鼠成纤维细胞经P(L/DL)LA浸提液或降解液处理后形态良好，增殖旺盛，材料毒性评级为0～1级；②溶血率为2.65%(小于5%)，符合溶血试验标准要求；③无热原反应。结论：P(L/DL)LA具有良好的生物相容性。
中图分类号：R782.4 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0363-03
, 百拇医药
Biocompatibility of bioabsorbable fracture-fixation materials of poly(L/DL-lactide) in vitro
Zhang Li Lu Chuntang Zhou Shuxia
(Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an,710032)
〔Abstract〕Objective:To evaluate the biocompatibility of absorbable P(L/DL)LA in vitro.Methods:The cytotoxicity,hemolysis and pyrogen were tested with standard method.Results:①There was no obvious change of cells attachment,morphology,and proliferation after L929 mouse fibroblasts had been treated by extracts or degradation products.The toxicity gradation of the material was 0～1,measured by A value of MTT assay;②hemolysis ratio was 2.65%;③there was no pyrogen reaction.Conclusion:The P(L/DL)LA is biocompatible to cultured cells.
, 百拇医药
Key words Internal fractare fixation; Absorbable;Polylactic acid;Biocompatible materials
生物降解材料作为骨折内固定物的研究应用有三十多年的历史，国外已有商品投入临床应用〔1〕，但其体内降解时间过长，可能发生迟发性异物反应等并发症，并且价格昂贵，使其临床应用受到一定限制。国内尚处于材料研制和实验阶段。为此，我们与中科院成都有机化学研究所合作研制了超高分子量的P(L/DL)LA。该材料为低结晶度、无定形物质，以期在保证一定机械强度的前提下，缩短降解时间，减少并发症，应用于颌面外科领域。本文对其体外生物相容性进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 受试材料 P(L/DL)LA平均分子量(Mw)=7.0×105，PLLA∶PDLLA为65∶35。用氯仿将L/DL-聚乳酸材料溶化，制成膜材(厚度<0.5 mm)，超声清洗，真空干燥，并经60Co照射消毒。计算材料表面积，每1 cm2材料(双面)置入10 ml培养液中，37 ℃下保持24 h，作为标准浸提液浓度，按材料面积与液体比例，制得10、2、1倍标准浓度浸提液。取材料5 g放入30 ml蒸馏水和NaOH 10 ml(6.25 mol/L)中，100 ℃水浴48 h，用HCl 3 ml(12 mol/L)进行中和(pH7.4)，再加蒸馏水至50 ml，制得10%降解液。浸提液和降解液消毒备用。
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1.1.2 细胞 L929小鼠成纤维细胞，培养于常规条件。
1.1.3 新鲜抗凝兔血 取10 ml新鲜兔血加入20 g/L草酸钾0.5 ml，然后每8 ml加入10 ml生理盐水稀释。
1.1.4 鲎试剂 福建省福州东方试剂厂产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞毒性试验
1.2.1.1 MTT法 试验在4块96孔培养板中进行。每孔接种L929细胞0.1 ml，细胞浓度1×103个/ml，常规培养24 h后加入不同浓度的浸提液或降解液0.1 ml，使终浓度分别达到5、1、0.2倍标准浓度浸提液和1%、0.2%、0.04%浓度降解液。每浓度组加4孔，空白对照组加入0.1 ml培养液，阳性对照组加入工业用聚氯乙烯标准浸提液。继续培养，分别于1、3、5、7 d各取出一块培养板，用常规MTT法测定A值。数据经统计学处理，并按6级毒性分级法(表1)计算相对增殖度(RGR)、毒级。
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表1 毒性分级 相对增殖度(RGR)
毒性评级
≥100
0
75～99
1
50～74
2
25～49
3
1～24
4
0
, 百拇医药
5
1.2.1.2 形态观察法 取2 mm×5 mm×10 mm L/DL-聚乳酸板材及1 cm2盖玻片，超声清洁，60Co照射消毒后平置于直径为35 mm的培养皿内，加入细胞浓度为3×104/ml的L929细胞悬液5 ml，培养5 d后倒置显微镜观察并照相。
1.2.2 溶血试验 取试验材料5 g放入10 ml生理盐水中，置于37 ℃的水浴箱中30 min，随后加入0.2 ml已制备好的混合血液，在37 ℃水浴中60 min。阴性对照采用10 ml生理盐水加入0.2 ml稀释兔血，阳性对照采用10 ml蒸馏水加入0.2 ml稀释兔血。750 r/min离心5 min后取上清液在540 nm测量吸光度。每组3个样本，计算平均值。溶血率按以下公式计算：
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1.2.3 热原试验 采用鲎试验法。L/DL-聚乳酸材料研成细粉末，取0.5 g材料加注射用生理盐水5 ml浸泡48 h后300 r/min离心，取上清液加入溶解后的鲎试剂0.1 ml，混匀后置37 ℃水浴1 h，观察结果。阴性对照加生理盐水1 ml，阳性对照加大肠杆菌菌液1 ml，其余同实验组。结果判定:阳性形成坚实凝胶。
2 结 果
2.1 细胞毒性试验
2.1.1 MTT试验 根据检测数据计算细胞相对增殖度及毒性评级见表2。统计分析结果，除1 d组外，阳性对照组与各浓度组间均相差显著(P<0.01)。5、7 d组1%降解液与各浓度组相差显著(P<0.05)。其余各时间点、各浓度组间均无显著差别(P>0.05)。
表2 光吸收值(A)、相对增值度(RGR)及材料毒性评级 检测组
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浓度
1 d
3 d
5 d
7 d
A值
RGR
毒级
A值
RGR
毒级
A值
RGR
, http://www.100md.com 毒级
A值
RGR
毒级
浸提液
5
0.18±0.03
94.7
1
0.33±0.04
97.1
1
1.04±0.03
, 百拇医药
100.9
0
1.77±0.02
100.0
0
1
0.20±0.02
105.2
0
0.35±0.02
102.9
0
1.02±0.04
, http://www.100md.com
98.1
1
1.77±0.01
100.0
0
0.2
0.20±0.04
105.2
0
0.34±0.05
100.0
0
1.05±0.06
, 百拇医药
101.9
0
1.81±0.03
102.3
0
降解液
1%
0.19±0.03
100.0
0
0.32±0.02
94.1
1
, 百拇医药
0.92±0.03①
89.3
1
1.65±0.06①
93.2
1
0.2%
0.20±0.02
105.3
0
0.33±0.08
97.1
, http://www.100md.com
1
1.03±0.05
100.0
0
1.77±0.02
100.0
0
0.04%
0.20±0.03
105.3
0
0.34±0.03
100.0
, 百拇医药
0
1.05±0.02
101.9
0
1.79±0.03
100.6
0
空白
0.19±0.03
0.34±0.02
1.03±0.05
1.77±0.02
, 百拇医药 阳性
0.18±0.05
0.21±0.04②
0.40±0.03②
0.57±0.08②
①P<0.05，②P<0.01
2.1.2 形态观察 倒置显微镜观察见大量细胞附着于L/DL-聚乳酸及生物盖玻片表面，细胞呈梭形，形态良好，细胞突充分伸展，与L/DL-聚乳酸板材表面紧密贴合，并可见大量分裂细胞。细胞数量及形态二者无明显差别(见图1，2)。
2.2 溶血试验
见表3。溶血率<5%为合格，本实验溶血率为2.65%，符合要求
, 百拇医药
2.3 热原试验
实验组与阴性对照组未见形成凝胶，阳性对照组形成坚实凝胶。说明L/DL-聚乳酸材料符合热原检查要求。
表3 吸光度值及溶血率
试管1
试管2
试管3
均数
溶血率(%)
实验组
0.015
0.015
0.008
, http://www.100md.com
0.0127
2.65
阴性对照组
0.000
0.000
0.003
0.0010
阳性对照组
0.440
0.440
0.450
0.4433
3 讨 论
, 百拇医药
医用材料生物学评价方法，大多是根据不同的临床应用，推荐规定不同的生物相容性试验。随着科学技术的发展，新的生物相容性评价方法不断出现，已被各国药典、ISO、ASTM等有关标准中收入的方法有40多种。总的归纳为体外试验、动物体内试验和临床应用试验三部分。本实验参照上海标准进行〔2〕，该标准多参照国外ISO和ASTM等标准制定，根据本国具体情况作了一些改动，方法是可靠的。
MTT试验是一种检测细胞生长、存活情况的新方法，现已广泛应用于免疫学、肿瘤学研究和医用材料的生物学评价〔3〕，其原理是活细胞中的线粒体脱氢酶将MTT分子还原，产生紫色结晶物，用DMSO溶解结晶后，在酶联免疫检测仪上测吸光度，即可代表细胞数量。该方法较以往人工计算细胞数的方法更为准确、快速和简便。
人工合成的超高分子量P(L/DL)LA是PLLA及PDLLA的共聚物，在体内可生物降解为乳酸分子，最终以H2O和CO2的形式排出体外〔4〕。但在降解过程中可在局部产生大量乳酸，易引起各种并发症。为了较全面地评价其毒性，本实验除采用上海标准中的浸提液外，还对其降解液进行了检测，并且每种溶液采用了3种不同浓度。结果发现按六级毒性分级法评级，本材料毒级为0～1级，并且可见细胞附着于P(L/DL)LA材料表面，形态良好并可见大量分裂细胞，说明材料对细胞无明显毒性。但结合数据看，高浓度降解液对细胞生长可能仍有一定影响。考虑到体内、外环境不同，体内存在微循环中介机制，因而不能轻易将体外毒性试验结论推理到体内〔5〕。
, 百拇医药
在溶血试验和热原试验中，我们也发现本材料符合生物材料的标准要求，综合这三部分的试验结果，可以认为P(L/DL)LA具有良好的生物相容性。
参考文献
1，Bos RR,Boeing G,Rozema FR,et al.Resorbable poly(L-lactide)plates and screws for the fixation of zygomatic fractures.J Oral Maxillofac Surg,1987,45:751
2，上海第二医科大学生物材料研究室编.非直接接触血液的医用生物材料生物性能测试标准.上海市试行规格，1985
3，吕晓迎,Kappert HF.牙科材料细胞毒性评定的新方法(MTT试验).中华口腔医学杂志，1995，30(6)：377
, 百拇医药
4，Hollinger JO.Preliminary report on the osteogenic potential of a biodegradable copolymer of polylactide (PLA) and polyglycolide(PGA).J Biomed Mater Res,1983,17:71
5，Ignatius AA,Claes LE.In vitro biocompatibility of bioresorbable polymers:Poly(L,DL-lactide) and poly(L-lactide-co-glycolide).Biomaterials,1996,17(8):831
(收稿：1999-06-28修回：2000-03-09), 百拇医药
单位：张力 吕春堂 周树夏(第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科)；熊成东(中科院成都有机化学研究所)
关键词：骨折内固定术；可吸收；聚乳酸；生物相容性材料
实用口腔医学杂志000510
〔摘要〕 目的：对自行研制的医用可吸收内固定材料L/DL-聚乳酸〔P(L/DL)LA〕的体外生物相容性进行评价。方法：使用细胞毒性试验、溶血试验和热原试验等3种方法。结果：①培养的L929小鼠成纤维细胞经P(L/DL)LA浸提液或降解液处理后形态良好，增殖旺盛，材料毒性评级为0～1级；②溶血率为2.65%(小于5%)，符合溶血试验标准要求；③无热原反应。结论：P(L/DL)LA具有良好的生物相容性。
中图分类号：R782.4 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0363-03
, 百拇医药
Biocompatibility of bioabsorbable fracture-fixation materials of poly(L/DL-lactide) in vitro
Zhang Li Lu Chuntang Zhou Shuxia
(Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an,710032)
〔Abstract〕Objective:To evaluate the biocompatibility of absorbable P(L/DL)LA in vitro.Methods:The cytotoxicity,hemolysis and pyrogen were tested with standard method.Results:①There was no obvious change of cells attachment,morphology,and proliferation after L929 mouse fibroblasts had been treated by extracts or degradation products.The toxicity gradation of the material was 0～1,measured by A value of MTT assay;②hemolysis ratio was 2.65%;③there was no pyrogen reaction.Conclusion:The P(L/DL)LA is biocompatible to cultured cells.
, 百拇医药
Key words Internal fractare fixation; Absorbable;Polylactic acid;Biocompatible materials
生物降解材料作为骨折内固定物的研究应用有三十多年的历史，国外已有商品投入临床应用〔1〕，但其体内降解时间过长，可能发生迟发性异物反应等并发症，并且价格昂贵，使其临床应用受到一定限制。国内尚处于材料研制和实验阶段。为此，我们与中科院成都有机化学研究所合作研制了超高分子量的P(L/DL)LA。该材料为低结晶度、无定形物质，以期在保证一定机械强度的前提下，缩短降解时间，减少并发症，应用于颌面外科领域。本文对其体外生物相容性进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 受试材料 P(L/DL)LA平均分子量(Mw)=7.0×105，PLLA∶PDLLA为65∶35。用氯仿将L/DL-聚乳酸材料溶化，制成膜材(厚度<0.5 mm)，超声清洗，真空干燥，并经60Co照射消毒。计算材料表面积，每1 cm2材料(双面)置入10 ml培养液中，37 ℃下保持24 h，作为标准浸提液浓度，按材料面积与液体比例，制得10、2、1倍标准浓度浸提液。取材料5 g放入30 ml蒸馏水和NaOH 10 ml(6.25 mol/L)中，100 ℃水浴48 h，用HCl 3 ml(12 mol/L)进行中和(pH7.4)，再加蒸馏水至50 ml，制得10%降解液。浸提液和降解液消毒备用。
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1.1.2 细胞 L929小鼠成纤维细胞，培养于常规条件。
1.1.3 新鲜抗凝兔血 取10 ml新鲜兔血加入20 g/L草酸钾0.5 ml，然后每8 ml加入10 ml生理盐水稀释。
1.1.4 鲎试剂 福建省福州东方试剂厂产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞毒性试验
1.2.1.1 MTT法 试验在4块96孔培养板中进行。每孔接种L929细胞0.1 ml，细胞浓度1×103个/ml，常规培养24 h后加入不同浓度的浸提液或降解液0.1 ml，使终浓度分别达到5、1、0.2倍标准浓度浸提液和1%、0.2%、0.04%浓度降解液。每浓度组加4孔，空白对照组加入0.1 ml培养液，阳性对照组加入工业用聚氯乙烯标准浸提液。继续培养，分别于1、3、5、7 d各取出一块培养板，用常规MTT法测定A值。数据经统计学处理，并按6级毒性分级法(表1)计算相对增殖度(RGR)、毒级。
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表1 毒性分级 相对增殖度(RGR)
毒性评级
≥100
0
75～99
1
50～74
2
25～49
3
1～24
4
0
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5
1.2.1.2 形态观察法 取2 mm×5 mm×10 mm L/DL-聚乳酸板材及1 cm2盖玻片，超声清洁，60Co照射消毒后平置于直径为35 mm的培养皿内，加入细胞浓度为3×104/ml的L929细胞悬液5 ml，培养5 d后倒置显微镜观察并照相。
1.2.2 溶血试验 取试验材料5 g放入10 ml生理盐水中，置于37 ℃的水浴箱中30 min，随后加入0.2 ml已制备好的混合血液，在37 ℃水浴中60 min。阴性对照采用10 ml生理盐水加入0.2 ml稀释兔血，阳性对照采用10 ml蒸馏水加入0.2 ml稀释兔血。750 r/min离心5 min后取上清液在540 nm测量吸光度。每组3个样本，计算平均值。溶血率按以下公式计算：
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1.2.3 热原试验 采用鲎试验法。L/DL-聚乳酸材料研成细粉末，取0.5 g材料加注射用生理盐水5 ml浸泡48 h后300 r/min离心，取上清液加入溶解后的鲎试剂0.1 ml，混匀后置37 ℃水浴1 h，观察结果。阴性对照加生理盐水1 ml，阳性对照加大肠杆菌菌液1 ml，其余同实验组。结果判定:阳性形成坚实凝胶。
2 结 果
2.1 细胞毒性试验
2.1.1 MTT试验 根据检测数据计算细胞相对增殖度及毒性评级见表2。统计分析结果，除1 d组外，阳性对照组与各浓度组间均相差显著(P<0.01)。5、7 d组1%降解液与各浓度组相差显著(P<0.05)。其余各时间点、各浓度组间均无显著差别(P>0.05)。
表2 光吸收值(A)、相对增值度(RGR)及材料毒性评级 检测组
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浓度
1 d
3 d
5 d
7 d
A值
RGR
毒级
A值
RGR
毒级
A值
RGR
, http://www.100md.com 毒级
A值
RGR
毒级
浸提液
5
0.18±0.03
94.7
1
0.33±0.04
97.1
1
1.04±0.03
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100.9
0
1.77±0.02
100.0
0
1
0.20±0.02
105.2
0
0.35±0.02
102.9
0
1.02±0.04
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98.1
1
1.77±0.01
100.0
0
0.2
0.20±0.04
105.2
0
0.34±0.05
100.0
0
1.05±0.06
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101.9
0
1.81±0.03
102.3
0
降解液
1%
0.19±0.03
100.0
0
0.32±0.02
94.1
1
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0.92±0.03①
89.3
1
1.65±0.06①
93.2
1
0.2%
0.20±0.02
105.3
0
0.33±0.08
97.1
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1
1.03±0.05
100.0
0
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100.0
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0.04%
0.20±0.03
105.3
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0.34±0.03
100.0
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1.05±0.02
101.9
0
1.79±0.03
100.6
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空白
0.19±0.03
0.34±0.02
1.03±0.05
1.77±0.02
, 百拇医药 阳性
0.18±0.05
0.21±0.04②
0.40±0.03②
0.57±0.08②
①P<0.05，②P<0.01
2.1.2 形态观察 倒置显微镜观察见大量细胞附着于L/DL-聚乳酸及生物盖玻片表面，细胞呈梭形，形态良好，细胞突充分伸展，与L/DL-聚乳酸板材表面紧密贴合，并可见大量分裂细胞。细胞数量及形态二者无明显差别(见图1，2)。
2.2 溶血试验
见表3。溶血率<5%为合格，本实验溶血率为2.65%，符合要求
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2.3 热原试验
实验组与阴性对照组未见形成凝胶，阳性对照组形成坚实凝胶。说明L/DL-聚乳酸材料符合热原检查要求。
表3 吸光度值及溶血率
试管1
试管2
试管3
均数
溶血率(%)
实验组
0.015
0.015
0.008
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0.0127
2.65
阴性对照组
0.000
0.000
0.003
0.0010
阳性对照组
0.440
0.440
0.450
0.4433
3 讨 论
, 百拇医药
医用材料生物学评价方法，大多是根据不同的临床应用，推荐规定不同的生物相容性试验。随着科学技术的发展，新的生物相容性评价方法不断出现，已被各国药典、ISO、ASTM等有关标准中收入的方法有40多种。总的归纳为体外试验、动物体内试验和临床应用试验三部分。本实验参照上海标准进行〔2〕，该标准多参照国外ISO和ASTM等标准制定，根据本国具体情况作了一些改动，方法是可靠的。
MTT试验是一种检测细胞生长、存活情况的新方法，现已广泛应用于免疫学、肿瘤学研究和医用材料的生物学评价〔3〕，其原理是活细胞中的线粒体脱氢酶将MTT分子还原，产生紫色结晶物，用DMSO溶解结晶后，在酶联免疫检测仪上测吸光度，即可代表细胞数量。该方法较以往人工计算细胞数的方法更为准确、快速和简便。
人工合成的超高分子量P(L/DL)LA是PLLA及PDLLA的共聚物，在体内可生物降解为乳酸分子，最终以H2O和CO2的形式排出体外〔4〕。但在降解过程中可在局部产生大量乳酸，易引起各种并发症。为了较全面地评价其毒性，本实验除采用上海标准中的浸提液外，还对其降解液进行了检测，并且每种溶液采用了3种不同浓度。结果发现按六级毒性分级法评级，本材料毒级为0～1级，并且可见细胞附着于P(L/DL)LA材料表面，形态良好并可见大量分裂细胞，说明材料对细胞无明显毒性。但结合数据看，高浓度降解液对细胞生长可能仍有一定影响。考虑到体内、外环境不同，体内存在微循环中介机制，因而不能轻易将体外毒性试验结论推理到体内〔5〕。
, 百拇医药
在溶血试验和热原试验中，我们也发现本材料符合生物材料的标准要求，综合这三部分的试验结果，可以认为P(L/DL)LA具有良好的生物相容性。
参考文献
1，Bos RR,Boeing G,Rozema FR,et al.Resorbable poly(L-lactide)plates and screws for the fixation of zygomatic fractures.J Oral Maxillofac Surg,1987,45:751
2，上海第二医科大学生物材料研究室编.非直接接触血液的医用生物材料生物性能测试标准.上海市试行规格，1985
3，吕晓迎,Kappert HF.牙科材料细胞毒性评定的新方法(MTT试验).中华口腔医学杂志，1995，30(6)：377
, 百拇医药
4，Hollinger JO.Preliminary report on the osteogenic potential of a biodegradable copolymer of polylactide (PLA) and polyglycolide(PGA).J Biomed Mater Res,1983,17:71
5，Ignatius AA,Claes LE.In vitro biocompatibility of bioresorbable polymers:Poly(L,DL-lactide) and poly(L-lactide-co-glycolide).Biomaterials,1996,17(8):831
(收稿：1999-06-28修回：2000-03-09), 百拇医药