胶质细胞源性的神经营养因子促进面神经损伤后再生的实验研究
作者：王琛 周树夏 李媛 邱建勇
单位：王琛 周树夏 李媛(第四军医大学口腔医学院 710032)；邱建勇(第四军医大学神经生物研究所)
关键词：神经营养因子；面神经；再生
实用口腔医学杂志000506
〔摘要〕 目的：研究胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)对面神经损伤后的促再生作用。方法：家兔面神经双侧造成5 mm神经缺损，以硅胶管套接后将硅胶管与神经外膜缝合固定。一侧硅胶管内注入纯化GDNF，另一侧注入等量生理盐水对照。于不同时间段取材，切片行甲苯胺兰、HE、Bielschowsky银染改良法染色观察面神经元细胞体及再生神经结构。图像分析测量再生神经轴突直径及单位面积轴突数量、再生轴突恢复率。60 d及90 d作透射电镜观察轴突及髓鞘超微结构并测定神经传导速度(NCV)。结果：与对照组相比， GDNF可以：①保护面神经元细胞，减少面神经元的死亡数目；②提高轴突再生的数量及质量，并可早期恢复神经传导速度。结论：面神经损伤后应用外源性GDNF可促进面神经的再生。
, http://www.100md.com
中图分类号：R782.4 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0351-03
The effect of glial cell-line derived neurotrophic factor on facial nerve regeneration following injury
Wang Chen Zhou Shuxia Li Yuan
(Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
〔Abstract〕 Objective: To study the effect of glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF) on facial nerve regeneration after injury.Methods:Defect of 5 mm was made in each facial nerve on both sides in 32 rabbits.Silicon tubes were used to bridge the defects.Pure GDNF (15 μg in 30 μl silane) was injected into silicon tube on one side and saline (30 μl) on the other side as the control.Nerve regeneration was studied by morphological observation with HE and Bielschowsky stainning,counting of nerve neurons and axon and measuring of motor nerve conduction velocity.The rest 3 rabbits was as blank contol. Results:7 d and 17 d after operation ,the neuron number in GDNF treated and control groups were 39.2±2.3 and 28.4±1.9,and 33.6±2.1 and 27.1±1.4,respectively (P<0.01).90 d after operation the axon number in the two groups were 2 836±621 and 1 564±386,respectively (P<0.01),the motor nerve conduction velocities were 28.4±3.2 and 21.5±2.8, respectively (P<0.01). Conclusion: GDNF can enhance the regeneration of facial nerve injured.
, 百拇医药
Key words Neurotrophic factor; Facial nerve; Regeneration
因外伤所致的面神经损伤在临床上非常多见,目前主要采用显微外科手术进行治疗,但治疗效果尚不满意。随着分子生物学的发展，多种神经营养因子被克隆和提纯，其中部分神经营养因子被发现对运动神经元具有强大的营养及保护作用。本文将纯化的胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)注入桥接面神经缺损的硅胶管内，探讨GDNF对面神经损伤后再生的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选用成年长耳白毛家兔31只，由四医大动物中心提供，5～6月龄，体重2.0～2.5 kg。
1.2 实验方法
, 百拇医药 35只实验动物，其中3只动物共6侧作为空白对照，剩余32只共64侧再分为实验侧及对照侧。每只动物为同体对照，双侧面神经切断后造成5 mm神经缺损，缺损以硅胶管桥接，神经外膜缝合固定于硅胶管上，于左侧硅胶管内注入GDNF30 μl，含GDNF15 μg，右侧为对照侧，硅胶管内注入生理盐水30 μl。将其中8只动物分两组于术后7 、14 d取脑组织行双侧面神经核甲苯胺兰染色，观察面神经元形态，每只家兔随机抽取10张切片，分别计数对照侧及给药侧面神经元数量，行统计学分析并计算神经元存活率；18只动物再分为3组于30 、60 、90 d取标本，中段再生神经干纵切，横切后作HE、Bielschowsky银染改良法染色观察再生神经结构。以HPIAS-1000型图像分析系统测量单位面积轴突数量，计算再生轴突恢复率，90 d取标本前先行面神经传导速度测定(NCV)；剩余6只动物于60 d及90 d取标本制作超薄切片，透射电镜观察轴突及髓鞘超微结构。3只空白对照物取面神经核及周围面神经计数正常面神经元数量及轴突数目。实验数据采用SPSS软件系统进行统计学分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 大体及光镜观察
术后30 d可见硅胶管外有结缔组织包绕，再生轴突已达神经远端，再生神经干与硅胶管间有少量淡黄色液体。GDNF组再生神经较生理盐水组粗大。光镜下见GDNF组再生轴突数目多，多数轴突有完整的髓鞘。对照侧再生轴突则细小，不规则。术后60 d可见再生神经表面有小血管走行，GDNF组神经更显粗大，光镜下见再生轴突数目多且粗大，髓鞘成熟，可见郎飞节，雪旺细胞数量较多；对照组的再生轴突细且少，髓鞘薄，未见明显的郎飞节，雪旺细胞数量少。90 d时见硅胶管外结缔组织被膜厚，再生小血管多，GDNF组再生神经均匀，再生轴突多，髓鞘厚，可见典型的朗飞节，而对照组则轴突细小，髓鞘薄，朗飞节不典型。
图1 对照组 面神经核尼氏体染色，示面神元细胞大量呈空泡样溶解，部分正常形态已消失，×160
, http://www.100md.com
图2 GDNF给药组 面神经核尼氏体染色示给药组面神经元细胞少量呈空泡样改变，大部分仍保持形态，可见轴突突起，×160
2.2 面神经核观察及计数
术后7 d及14 dGDNF组面神经元细胞存活数量多，可见树突形态，细胞核体积增大，尼氏体深染。对照组存活细胞少，较多神经元细胞呈空泡样崩解，细胞形态消失。面神经元细胞计数结果如下，结果行随机独立样本t检验：
表1 不同时间面神经元细胞数量(
±s)
7 d
14 d
GDNF侧
, http://www.100md.com
39.2±2.3
33.6±2.1
对照侧
28.4±1.9
27.1±1.4
P值
<0.01
<0.01
2.3 透射电镜观察
术后30 d及90 d标本，透射电镜下见GDNF组再生神经干中髓轴突数目多，髓鞘厚，呈较成熟的板层样结构。对照组髓轴突数目少，髓鞘薄。
2.4 神经纤维图像分析
, 百拇医药
在相同放大倍数下随机选取5个视野，测定每个视野的神经轴突数，计算单位面积的神经轴突数。以正常神经轴突数目为基数计算再生轴突恢复率，并行t检验。结果如表2。表2 术后90 d再生轴突数目及恢复率(±s)
GDNF侧
对照侧
数目
2 836±621
1 564±386
恢复率
43.63±5.41
23.75±4.64
, http://www.100md.com
P值
<0.01
<0.01
2.5 神经传导速度测定
术后90 d测神经传导速度(NCV)，结果见表3。数据行成对资料样本均数t检验，结果有显著性差异，(P<0.01)。表3 术后90 d面神经传导速度 (±s)
GDNF侧
对照侧
传导速度(m/s)
28.4±3.2
, http://www.100md.com 21.5±2.8
P值
<0.01
3 讨 论
外源性GDNF对面神经元具有强大的营养及保护作用已被很多学者所证实〔1,2〕。硅胶管套接研究外源性物质对面神经损伤后再生的影响是一种经典的研究方法。本文应用此方法探讨了GDNF在面神经损伤后再生过程中的作用，结果表明：GDNF可促进面神经再生，并可减少面神经损伤后面神经元细胞的死亡数目。
GDNF促进面神经损伤后再生表现在以下几方面：(1)保护面神经元，减少面神经元的死亡数目。有文献报道新生鼠面神经切断后，90%的面神经元细胞死亡〔2〕。本试验结果显示：给以GDNF后，面神经元细胞存活数量明显高于对照组。由于损伤部位释放的物质可以通过逆行运输至神经元细胞体而导致细胞死亡，而外源性GDNF也可逆行运输至神经元细胞体发挥其营养及保护作用从而减轻了神经元细胞的反应性。面神经元细胞存活数量的提高其意义在于可以大大增加轴突的数量，从而缩短轴突再生时间，恢复神经支配功能。(2)提高轴突再生的数量及质量并促进面神经传导速度的恢复。本试验结果显示：GDNF组在轴突再生数量、轴突恢复率、神经传导速度及形态学上的恢复都优于对照组，这一结果的可能解释为：由于GDNF是一种可由靶器官释放的NTF〔3〕，当运动神经受损后， GDNFmRNA或其受体mRNA在神经及神经靶器官中的表达均增加〔4〕，在损伤部位给以外源性GDNF可以提高局部的GDNF浓度，诱导轴突的再生。此外，面神经元存活数量的增多使得更多的轴突得以保存，再生轴突可以更快的速度进入靶肌肉与之建立功能联系，促进了神经元细胞的生长及分化，而神经元细胞的生长及分化反过来又加速了轴突的再生速度，二者互相促进。
, 百拇医药
目前对于GDNF的研究主要集中于对培养的运动神经元及新生小鼠面神经损伤后的营养及保护作用等方面，对于是否能促进成熟面神经损伤后的再生及功能恢复尚未见报道。本试验在这一方面作了一些初步探讨。由于面神经损伤后的功能恢复主要取决于肌肉功能的恢复，因此有必要继续研究GDNF对靶器官功能恢复所起的作用。此外，由于不同家族的神经营养因子(NTF)作用机制不同，因子间存在网络调控效应，联合应用不同亚类的NTF往往可起到协同作用〔5〕，因此，还应在联合应用NTF方面作深入的研究。
参考文献
1，Henderson CE,Phillips HS,Pollock RA et al.GDNF: A potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.Science,1994,266(5181):1062
, 百拇医药
2，Yan Q, Matheson C, Lopez TD. In vivo neurotrophic effects of GDNF on neonatal and adult facial motor neurons.Nature,1995,373:341
3，Suzuki H，Hase A，Miyata Y, et al.Prominent expression of glial cell line-derived nearotrophic factor in human skeletal muscle.J Comp Neurol,1998,402(3):303
4，Naveilhan P,Elshamy M A, Emfors P. Differential regulation of mRNAs for GDNF and its receptors Ret and GDNFR alpha after sciatic nerve lesion in the mouse. Eur J Neurosci,1997,9(7):1450
5，何成，王成海，敖世洲.神经营养因子.生命科学，1996,8：32
(收稿：1999-12-01修回：2000-04-05), 百拇医药
单位：王琛 周树夏 李媛(第四军医大学口腔医学院 710032)；邱建勇(第四军医大学神经生物研究所)
关键词：神经营养因子；面神经；再生
实用口腔医学杂志000506
〔摘要〕 目的：研究胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)对面神经损伤后的促再生作用。方法：家兔面神经双侧造成5 mm神经缺损，以硅胶管套接后将硅胶管与神经外膜缝合固定。一侧硅胶管内注入纯化GDNF，另一侧注入等量生理盐水对照。于不同时间段取材，切片行甲苯胺兰、HE、Bielschowsky银染改良法染色观察面神经元细胞体及再生神经结构。图像分析测量再生神经轴突直径及单位面积轴突数量、再生轴突恢复率。60 d及90 d作透射电镜观察轴突及髓鞘超微结构并测定神经传导速度(NCV)。结果：与对照组相比， GDNF可以：①保护面神经元细胞，减少面神经元的死亡数目；②提高轴突再生的数量及质量，并可早期恢复神经传导速度。结论：面神经损伤后应用外源性GDNF可促进面神经的再生。
, http://www.100md.com
中图分类号：R782.4 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0351-03
The effect of glial cell-line derived neurotrophic factor on facial nerve regeneration following injury
Wang Chen Zhou Shuxia Li Yuan
(Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032)
〔Abstract〕 Objective: To study the effect of glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF) on facial nerve regeneration after injury.Methods:Defect of 5 mm was made in each facial nerve on both sides in 32 rabbits.Silicon tubes were used to bridge the defects.Pure GDNF (15 μg in 30 μl silane) was injected into silicon tube on one side and saline (30 μl) on the other side as the control.Nerve regeneration was studied by morphological observation with HE and Bielschowsky stainning,counting of nerve neurons and axon and measuring of motor nerve conduction velocity.The rest 3 rabbits was as blank contol. Results:7 d and 17 d after operation ,the neuron number in GDNF treated and control groups were 39.2±2.3 and 28.4±1.9,and 33.6±2.1 and 27.1±1.4,respectively (P<0.01).90 d after operation the axon number in the two groups were 2 836±621 and 1 564±386,respectively (P<0.01),the motor nerve conduction velocities were 28.4±3.2 and 21.5±2.8, respectively (P<0.01). Conclusion: GDNF can enhance the regeneration of facial nerve injured.
, 百拇医药
Key words Neurotrophic factor; Facial nerve; Regeneration
因外伤所致的面神经损伤在临床上非常多见,目前主要采用显微外科手术进行治疗,但治疗效果尚不满意。随着分子生物学的发展，多种神经营养因子被克隆和提纯，其中部分神经营养因子被发现对运动神经元具有强大的营养及保护作用。本文将纯化的胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)注入桥接面神经缺损的硅胶管内，探讨GDNF对面神经损伤后再生的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选用成年长耳白毛家兔31只，由四医大动物中心提供，5～6月龄，体重2.0～2.5 kg。
1.2 实验方法
, 百拇医药 35只实验动物，其中3只动物共6侧作为空白对照，剩余32只共64侧再分为实验侧及对照侧。每只动物为同体对照，双侧面神经切断后造成5 mm神经缺损，缺损以硅胶管桥接，神经外膜缝合固定于硅胶管上，于左侧硅胶管内注入GDNF30 μl，含GDNF15 μg，右侧为对照侧，硅胶管内注入生理盐水30 μl。将其中8只动物分两组于术后7 、14 d取脑组织行双侧面神经核甲苯胺兰染色，观察面神经元形态，每只家兔随机抽取10张切片，分别计数对照侧及给药侧面神经元数量，行统计学分析并计算神经元存活率；18只动物再分为3组于30 、60 、90 d取标本，中段再生神经干纵切，横切后作HE、Bielschowsky银染改良法染色观察再生神经结构。以HPIAS-1000型图像分析系统测量单位面积轴突数量，计算再生轴突恢复率，90 d取标本前先行面神经传导速度测定(NCV)；剩余6只动物于60 d及90 d取标本制作超薄切片，透射电镜观察轴突及髓鞘超微结构。3只空白对照物取面神经核及周围面神经计数正常面神经元数量及轴突数目。实验数据采用SPSS软件系统进行统计学分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 大体及光镜观察
术后30 d可见硅胶管外有结缔组织包绕，再生轴突已达神经远端，再生神经干与硅胶管间有少量淡黄色液体。GDNF组再生神经较生理盐水组粗大。光镜下见GDNF组再生轴突数目多，多数轴突有完整的髓鞘。对照侧再生轴突则细小，不规则。术后60 d可见再生神经表面有小血管走行，GDNF组神经更显粗大，光镜下见再生轴突数目多且粗大，髓鞘成熟，可见郎飞节，雪旺细胞数量较多；对照组的再生轴突细且少，髓鞘薄，未见明显的郎飞节，雪旺细胞数量少。90 d时见硅胶管外结缔组织被膜厚，再生小血管多，GDNF组再生神经均匀，再生轴突多，髓鞘厚，可见典型的朗飞节，而对照组则轴突细小，髓鞘薄，朗飞节不典型。
图1 对照组 面神经核尼氏体染色，示面神元细胞大量呈空泡样溶解，部分正常形态已消失，×160
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图2 GDNF给药组 面神经核尼氏体染色示给药组面神经元细胞少量呈空泡样改变，大部分仍保持形态，可见轴突突起，×160
2.2 面神经核观察及计数
术后7 d及14 dGDNF组面神经元细胞存活数量多，可见树突形态，细胞核体积增大，尼氏体深染。对照组存活细胞少，较多神经元细胞呈空泡样崩解，细胞形态消失。面神经元细胞计数结果如下，结果行随机独立样本t检验：
表1 不同时间面神经元细胞数量(
±s)7 d
14 d
GDNF侧
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39.2±2.3
33.6±2.1
对照侧
28.4±1.9
27.1±1.4
P值
<0.01
<0.01
2.3 透射电镜观察
术后30 d及90 d标本，透射电镜下见GDNF组再生神经干中髓轴突数目多，髓鞘厚，呈较成熟的板层样结构。对照组髓轴突数目少，髓鞘薄。
2.4 神经纤维图像分析
, 百拇医药
在相同放大倍数下随机选取5个视野，测定每个视野的神经轴突数，计算单位面积的神经轴突数。以正常神经轴突数目为基数计算再生轴突恢复率，并行t检验。结果如表2。表2 术后90 d再生轴突数目及恢复率(
±s)GDNF侧
对照侧
数目
2 836±621
1 564±386
恢复率
43.63±5.41
23.75±4.64
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P值
<0.01
<0.01
2.5 神经传导速度测定
术后90 d测神经传导速度(NCV)，结果见表3。数据行成对资料样本均数t检验，结果有显著性差异，(P<0.01)。表3 术后90 d面神经传导速度 (
±s)GDNF侧
对照侧
传导速度(m/s)
28.4±3.2
, http://www.100md.com 21.5±2.8
P值
<0.01
3 讨 论
外源性GDNF对面神经元具有强大的营养及保护作用已被很多学者所证实〔1,2〕。硅胶管套接研究外源性物质对面神经损伤后再生的影响是一种经典的研究方法。本文应用此方法探讨了GDNF在面神经损伤后再生过程中的作用，结果表明：GDNF可促进面神经再生，并可减少面神经损伤后面神经元细胞的死亡数目。
GDNF促进面神经损伤后再生表现在以下几方面：(1)保护面神经元，减少面神经元的死亡数目。有文献报道新生鼠面神经切断后，90%的面神经元细胞死亡〔2〕。本试验结果显示：给以GDNF后，面神经元细胞存活数量明显高于对照组。由于损伤部位释放的物质可以通过逆行运输至神经元细胞体而导致细胞死亡，而外源性GDNF也可逆行运输至神经元细胞体发挥其营养及保护作用从而减轻了神经元细胞的反应性。面神经元细胞存活数量的提高其意义在于可以大大增加轴突的数量，从而缩短轴突再生时间，恢复神经支配功能。(2)提高轴突再生的数量及质量并促进面神经传导速度的恢复。本试验结果显示：GDNF组在轴突再生数量、轴突恢复率、神经传导速度及形态学上的恢复都优于对照组，这一结果的可能解释为：由于GDNF是一种可由靶器官释放的NTF〔3〕，当运动神经受损后， GDNFmRNA或其受体mRNA在神经及神经靶器官中的表达均增加〔4〕，在损伤部位给以外源性GDNF可以提高局部的GDNF浓度，诱导轴突的再生。此外，面神经元存活数量的增多使得更多的轴突得以保存，再生轴突可以更快的速度进入靶肌肉与之建立功能联系，促进了神经元细胞的生长及分化，而神经元细胞的生长及分化反过来又加速了轴突的再生速度，二者互相促进。
, 百拇医药
目前对于GDNF的研究主要集中于对培养的运动神经元及新生小鼠面神经损伤后的营养及保护作用等方面，对于是否能促进成熟面神经损伤后的再生及功能恢复尚未见报道。本试验在这一方面作了一些初步探讨。由于面神经损伤后的功能恢复主要取决于肌肉功能的恢复，因此有必要继续研究GDNF对靶器官功能恢复所起的作用。此外，由于不同家族的神经营养因子(NTF)作用机制不同，因子间存在网络调控效应，联合应用不同亚类的NTF往往可起到协同作用〔5〕，因此，还应在联合应用NTF方面作深入的研究。
参考文献
1，Henderson CE,Phillips HS,Pollock RA et al.GDNF: A potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle.Science,1994,266(5181):1062
, 百拇医药
2，Yan Q, Matheson C, Lopez TD. In vivo neurotrophic effects of GDNF on neonatal and adult facial motor neurons.Nature,1995,373:341
3，Suzuki H，Hase A，Miyata Y, et al.Prominent expression of glial cell line-derived nearotrophic factor in human skeletal muscle.J Comp Neurol,1998,402(3):303
4，Naveilhan P,Elshamy M A, Emfors P. Differential regulation of mRNAs for GDNF and its receptors Ret and GDNFR alpha after sciatic nerve lesion in the mouse. Eur J Neurosci,1997,9(7):1450
5，何成，王成海，敖世洲.神经营养因子.生命科学，1996,8：32
(收稿：1999-12-01修回：2000-04-05), 百拇医药