I型和Ⅲ型胶原在修复性牙本质形成中的免疫定位
作者：陈智 樊明文 张旗 朱奇
单位：武汉大学口腔医学院 430079
关键词：修复性牙本质；胶原；牙髓；免疫组织化学；大鼠
实用口腔医学杂志000502
〔摘要〕 目的：研究I型和Ⅲ型胶原在修复性牙本质形成中的免疫定位和分布特征。方法：在大鼠第一磨牙制备单面洞，观察修复性牙本质形成。免疫组化SABC法检测I型胶原和Ⅲ型胶原的免疫反应。结果：在术后3 d，修复性牙本质尚未形成。I型胶原和Ⅲ型胶原均分布于牙髓内，前期牙本质为弱阳性。术后15 d，I型胶原和Ⅲ型胶原在牙髓细胞内呈阳性染色。I型胶原在前期牙本质中呈弱阳性。术后30 d，I型胶原和Ⅲ型胶原的强阳性染色集中于已形成的修复性牙本质下的牙髓内，成牙本质细胞样细胞染色呈强阳性。结论：形成修复性牙本质的成牙本质细胞样细胞合成、分泌I型胶原和Ⅲ型胶原。I型胶原是修复性牙本质的主要基质成分。
, 百拇医药
中图分类号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0338-03
Immunolocalization of collagen I & Ⅲ in rat reparative dentin
Chen Zhi Fan Minwen Zhang Qi
(School of Stomatology,Hubei Medical University,Wuhan 430079)
〔Abstract〕Objective:To study the distribution of collagen type I and type Ⅲduring reparative dentin formation in rat.Methods:The cavity was prepared on the mesial surface of first molar in Wistar rats.The rats were sacrificed 3,15 and 30 days after operation.After histological process,the sections of the teeth were reacted with antibodies of collagen I and collagen Ⅲ respectively and stained with SABC method.Results:In 3-day-group dental pulp was stained intensely by collagen I or Ⅲ antibody while the predentin was weakly.In 15-day-group,collagen I was strongly positive in dental pulp cells and positive in predentin.Collagen Ⅲ was moderately positive in dental pulp cells,whereas negative in predentin.After 30 days,both collagen I and Ⅲ were positive in reparative dentin,particularly localized in cell rich zone under the reparative dentin.The odontoblast-like cells were stained strongly.Conclusion:Odontoblast-like cells secrete collagen I and Ⅲ during the formation of reparative dentin.Collagen I is the major constitute of reparative dentin matrix.
, http://www.100md.com
Key words
Key words Reparative dentin;Collagen;Dental pulp;Immunohistochemistry;Rats
胶原是牙髓-牙本质复合体中最主要的有机成分〔1〕。牙本质基质以I型胶原为主，还含有极少量的V型胶原，缺乏Ⅲ型胶原。牙髓中既有I型胶原，又有Ⅲ型胶原〔2〕。许多学者对I型和Ⅲ型胶原在牙齿发育过程中以及成熟的牙髓-牙本质复合体中的表达和分布特征进行了研究〔3～5〕。Karjalainen曾对龋损牙的胶原分布进行过研究，发现龋损下的成牙本质细胞既合成I型胶原，也合成Ⅲ型胶原〔6〕。D'Souza研究发现，形成修复性牙本质的成牙本质细胞样细胞仅仅合成I型胶原，而不合成Ⅲ型胶原〔7〕。
本研究利用已建立的修复性牙本质形成的动物模型和免疫组化技术，观察I型胶原和Ⅲ型胶原在修复性牙本质形成中的免疫定位和分布特征。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 标本制备
实验标本为18只Wistar大白鼠(湖北省医科院)，体重150～250 g。50 g/L苯巴必妥钠腹腔内注射麻醉(30 mg/kg)。分别在上下颌第一磨牙近中面制备单面洞。窝洞深度约为牙本质厚度的1/2。分别在术后第3、15和30 天处死动物，迅速分离上下颌骨，立即置于40 g/L多聚甲醛内、4 ℃下固定24～48 h。100 g/L EDTA脱钙2～3周。系列乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm连续切片。
1.2 免疫组化
1.2.1 免疫组化工作试剂 兔抗I型胶原抗体、兔抗Ⅲ型胶原抗体和SP试剂盒均购自北京中山生物技术公司。DAB显色试剂盒、复合消化液和抗原修复液购自武汉博士德生物制品公司。
1.2.2 免疫组化染色方法 免疫组化采用SABC法，DAB显色，苏木素复染。显微镜下观察结果。
, 百拇医药
2 结 果
3 d组，未见修复性牙本质形成。I型胶原和Ⅲ型胶原在牙髓内染色均匀，Ⅲ型胶原阳性染色弱于I型胶原。前期牙本质染色呈弱阳性(图1，2)。I型胶原和Ⅲ型胶原在牙本质染色均为阴性。
15 d组，可见明显的修复性牙本质形成。新形成的修复性牙本质I型胶原染色阴性，与牙髓细胞接触的未矿化的前期牙本质染色阳性，在牙髓细胞内染色强阳性(图3)。Ⅲ型胶原在牙髓细胞内染色呈阳性，染色均匀，前期牙本质内染色呈阴性(图4)。
30 d组，修复性牙本质形成增加。I型胶原和Ⅲ型胶原在未完全矿化的修复性牙本质中染色阳性。I型胶原和Ⅲ型胶原阳性反应集中于修复性牙本质下的牙髓细胞层内。部分化的成牙本质细胞样细胞浆内染色呈强阳性(图5，6)。
, 百拇医药 图1 3 d组I型胶原染色 ×20
C：洞 D：牙本质 DO：前期牙本质
图2 3 d组Ⅲ型胶原染色 ×20
C：洞 B：牙本质 PD：前期牙本质
图3 15 d组Ⅰ型胶原染色 ×20
C：洞 D：牙本质 RD：修复性牙本质 P：牙髓
图4 15 d组Ⅲ型胶原染色 ×20
, http://www.100md.com
C：洞 D：牙本质 RD：修复性
牙本质 P：牙髓
图5 30 d组I型胶原染色 ×60
RD：修复性牙本质 OLC：成牙本质
细胞样细胞 P：牙髓
图6 30 d组Ⅲ型胶原阳性染色 ×60
RD：修复性牙本质 OLC：成牙本质
细胞样细胞 P：牙髓
, 百拇医药 3 讨 论
本研究证实I型胶原构成了牙髓和修复性牙本质的主要纤维结构成分。Ⅲ型胶原同时也构成了牙髓细胞外基质和修复性牙本质基质的成分。本研究与国外学者的研究结果一致〔7，8〕。牙本质基质中的胶原来源于成牙本质细胞。成牙本质细胞分泌、形成的胶原分子在体外通过化学键相互交联，形成胶原原纤维和胶原纤维。胶原纤维形成一个致密的胶原网，矿物盐在胶原网内沉积，形成高度矿化的牙本质〔2〕。本研究显示，在牙髓修复过程中，形成修复性牙本质的细胞I型胶原免疫组化染色呈强阳性，提示修复性牙本质的基质形成过程与原发性牙本质和继发性牙本质基质形成过程一致。I型胶原纤维不仅仅是原发性和继发性牙本质最主要的基质成分，也是修复性牙本质基质中最主要的基质成分。
虽然I型胶原构成牙本质基质的主要结构成分，但本研究中牙本质I型胶原染色均呈阴性，与国外研究结果一致。其原因可能是由于牙本质基质中的其他非胶原蛋白或糖蛋白与胶原发生结合，遮盖了I型胶原的抗原分子簇。
, 百拇医药
本研究中Ⅲ型胶原在牙髓和修复性牙本质中的免疫染色呈阳性。在20世纪80年代早期，曾有学者认为，Ⅲ型胶原并不由成牙本质细胞表达，而可能为牙髓细胞合成。90年代后，D'Souza〔7〕、Lukinmaa〔9〕等均发现，成牙本质细胞能够合成和分泌Ⅲ型胶原。Lukinmaa、D'Souza等还发现，在修复性牙本质形成后，沿新生成的牙本质排列的细胞并不表达Ⅲ型胶原。Magloire〔8〕等发现修复性牙本质形成时有Ⅲ型胶原的表达。本研究结果与Magloire等结果一致。修复性牙本质中为何存在免疫反应阳性的Ⅲ型胶原，原因尚不清楚。很可能是，在牙髓修复的早期，新分化的成牙本质细胞样细胞在较短时间内合成和分泌Ⅲ型胶原，随后以合成I型胶原为主。分泌进入修复性牙本质基质中的Ⅲ型胶原因长期存在而被检测出来〔10〕。由于本研究未利用原位杂交技术对Ⅲ型胶原mRNA进行检测，故对此现象需要作进一步研究。
国家自然科学基金项目 项目编号：39830430
, 百拇医药
湖北省自然科学基金项目 编号：98J096
参考文献
1，樊明文,李成章,凌均启,等.牙本质非胶原蛋白诱导修复性牙本质形成的实验研究.口腔医学纵横,1996,12(1):67
2，Butler WT.Dentin matrix proteins and dentinogenesis.Connect Tissue Res,1995,33:381
3，Sodek J, Mandell SM.Collagen metabolism in rat incisor predentine in vivo:Synthesis and maturation of type I,α1(I)trimer,and type V collagens.Biochemistry,1982,21:2011
, 百拇医药
4，Magloire H,Joffre A,Grimaud JA,et al.Distribution of type Ⅲ collagen in the pulp parenchyma of the human developing tooth.Histochemistry,1982,74:319
5，Takita K,Ohsaki Y,Nakata M,et al.Immunofluorescence localization of type I and type Ⅲ collagen and fibronectin in mouse dental tissues in late development and during molar eruption.Arch Oral Biol,1987,32:273
6，Karjalainen S,Soderling E,Pelliniemi L,et al.Immunohistochemical localization of types I and Ⅲ collagen and fibronectin in the dentine of carious human teeth.Arch Oral Biol,1986,31:801
, 百拇医药
7，D'Souza RN,Bachman T,Baumgardner KR,et al.Characterization of cellular responses involved in reparative dentinogenesis in rat molars.J Dent Res,1995,74(2):702
8，Magloire H,Joffre A,Hartman DJ.Localization and synthesis of type Ⅲ collagen and fibronectin in human reparative dentine.Histochemistry,1988,88:141
9，Lukinmaa PL,Waltimo J.Immunohistochemical localization of types I,V,and Ⅵ collagen in human permanent teeth and periodontal ligament.J Dent Res,1992,71(2):391
10，Webb PP,Moxham BJ,Ralphs JR,et al.Immunolocalisation of collagens in the developing rat molar tooth.Eur J Oral Sci,1998,106(suppl 1):147
(收稿：2000-02-01修回：2000-03-13), 百拇医药
单位：武汉大学口腔医学院 430079
关键词：修复性牙本质；胶原；牙髓；免疫组织化学；大鼠
实用口腔医学杂志000502
〔摘要〕 目的：研究I型和Ⅲ型胶原在修复性牙本质形成中的免疫定位和分布特征。方法：在大鼠第一磨牙制备单面洞，观察修复性牙本质形成。免疫组化SABC法检测I型胶原和Ⅲ型胶原的免疫反应。结果：在术后3 d，修复性牙本质尚未形成。I型胶原和Ⅲ型胶原均分布于牙髓内，前期牙本质为弱阳性。术后15 d，I型胶原和Ⅲ型胶原在牙髓细胞内呈阳性染色。I型胶原在前期牙本质中呈弱阳性。术后30 d，I型胶原和Ⅲ型胶原的强阳性染色集中于已形成的修复性牙本质下的牙髓内，成牙本质细胞样细胞染色呈强阳性。结论：形成修复性牙本质的成牙本质细胞样细胞合成、分泌I型胶原和Ⅲ型胶原。I型胶原是修复性牙本质的主要基质成分。
, 百拇医药
中图分类号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)05-0338-03
Immunolocalization of collagen I & Ⅲ in rat reparative dentin
Chen Zhi Fan Minwen Zhang Qi
(School of Stomatology,Hubei Medical University,Wuhan 430079)
〔Abstract〕Objective:To study the distribution of collagen type I and type Ⅲduring reparative dentin formation in rat.Methods:The cavity was prepared on the mesial surface of first molar in Wistar rats.The rats were sacrificed 3,15 and 30 days after operation.After histological process,the sections of the teeth were reacted with antibodies of collagen I and collagen Ⅲ respectively and stained with SABC method.Results:In 3-day-group dental pulp was stained intensely by collagen I or Ⅲ antibody while the predentin was weakly.In 15-day-group,collagen I was strongly positive in dental pulp cells and positive in predentin.Collagen Ⅲ was moderately positive in dental pulp cells,whereas negative in predentin.After 30 days,both collagen I and Ⅲ were positive in reparative dentin,particularly localized in cell rich zone under the reparative dentin.The odontoblast-like cells were stained strongly.Conclusion:Odontoblast-like cells secrete collagen I and Ⅲ during the formation of reparative dentin.Collagen I is the major constitute of reparative dentin matrix.
, http://www.100md.com
Key words
Key words Reparative dentin;Collagen;Dental pulp;Immunohistochemistry;Rats
胶原是牙髓-牙本质复合体中最主要的有机成分〔1〕。牙本质基质以I型胶原为主，还含有极少量的V型胶原，缺乏Ⅲ型胶原。牙髓中既有I型胶原，又有Ⅲ型胶原〔2〕。许多学者对I型和Ⅲ型胶原在牙齿发育过程中以及成熟的牙髓-牙本质复合体中的表达和分布特征进行了研究〔3～5〕。Karjalainen曾对龋损牙的胶原分布进行过研究，发现龋损下的成牙本质细胞既合成I型胶原，也合成Ⅲ型胶原〔6〕。D'Souza研究发现，形成修复性牙本质的成牙本质细胞样细胞仅仅合成I型胶原，而不合成Ⅲ型胶原〔7〕。
本研究利用已建立的修复性牙本质形成的动物模型和免疫组化技术，观察I型胶原和Ⅲ型胶原在修复性牙本质形成中的免疫定位和分布特征。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 标本制备
实验标本为18只Wistar大白鼠(湖北省医科院)，体重150～250 g。50 g/L苯巴必妥钠腹腔内注射麻醉(30 mg/kg)。分别在上下颌第一磨牙近中面制备单面洞。窝洞深度约为牙本质厚度的1/2。分别在术后第3、15和30 天处死动物，迅速分离上下颌骨，立即置于40 g/L多聚甲醛内、4 ℃下固定24～48 h。100 g/L EDTA脱钙2～3周。系列乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm连续切片。
1.2 免疫组化
1.2.1 免疫组化工作试剂 兔抗I型胶原抗体、兔抗Ⅲ型胶原抗体和SP试剂盒均购自北京中山生物技术公司。DAB显色试剂盒、复合消化液和抗原修复液购自武汉博士德生物制品公司。
1.2.2 免疫组化染色方法 免疫组化采用SABC法，DAB显色，苏木素复染。显微镜下观察结果。
, 百拇医药
2 结 果
3 d组，未见修复性牙本质形成。I型胶原和Ⅲ型胶原在牙髓内染色均匀，Ⅲ型胶原阳性染色弱于I型胶原。前期牙本质染色呈弱阳性(图1，2)。I型胶原和Ⅲ型胶原在牙本质染色均为阴性。
15 d组，可见明显的修复性牙本质形成。新形成的修复性牙本质I型胶原染色阴性，与牙髓细胞接触的未矿化的前期牙本质染色阳性，在牙髓细胞内染色强阳性(图3)。Ⅲ型胶原在牙髓细胞内染色呈阳性，染色均匀，前期牙本质内染色呈阴性(图4)。
30 d组，修复性牙本质形成增加。I型胶原和Ⅲ型胶原在未完全矿化的修复性牙本质中染色阳性。I型胶原和Ⅲ型胶原阳性反应集中于修复性牙本质下的牙髓细胞层内。部分化的成牙本质细胞样细胞浆内染色呈强阳性(图5，6)。
, 百拇医药 图1 3 d组I型胶原染色 ×20
C：洞 D：牙本质 DO：前期牙本质
图2 3 d组Ⅲ型胶原染色 ×20
C：洞 B：牙本质 PD：前期牙本质
图3 15 d组Ⅰ型胶原染色 ×20
C：洞 D：牙本质 RD：修复性牙本质 P：牙髓
图4 15 d组Ⅲ型胶原染色 ×20
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C：洞 D：牙本质 RD：修复性
牙本质 P：牙髓
图5 30 d组I型胶原染色 ×60
RD：修复性牙本质 OLC：成牙本质
细胞样细胞 P：牙髓
图6 30 d组Ⅲ型胶原阳性染色 ×60
RD：修复性牙本质 OLC：成牙本质
细胞样细胞 P：牙髓
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本研究证实I型胶原构成了牙髓和修复性牙本质的主要纤维结构成分。Ⅲ型胶原同时也构成了牙髓细胞外基质和修复性牙本质基质的成分。本研究与国外学者的研究结果一致〔7，8〕。牙本质基质中的胶原来源于成牙本质细胞。成牙本质细胞分泌、形成的胶原分子在体外通过化学键相互交联，形成胶原原纤维和胶原纤维。胶原纤维形成一个致密的胶原网，矿物盐在胶原网内沉积，形成高度矿化的牙本质〔2〕。本研究显示，在牙髓修复过程中，形成修复性牙本质的细胞I型胶原免疫组化染色呈强阳性，提示修复性牙本质的基质形成过程与原发性牙本质和继发性牙本质基质形成过程一致。I型胶原纤维不仅仅是原发性和继发性牙本质最主要的基质成分，也是修复性牙本质基质中最主要的基质成分。
虽然I型胶原构成牙本质基质的主要结构成分，但本研究中牙本质I型胶原染色均呈阴性，与国外研究结果一致。其原因可能是由于牙本质基质中的其他非胶原蛋白或糖蛋白与胶原发生结合，遮盖了I型胶原的抗原分子簇。
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本研究中Ⅲ型胶原在牙髓和修复性牙本质中的免疫染色呈阳性。在20世纪80年代早期，曾有学者认为，Ⅲ型胶原并不由成牙本质细胞表达，而可能为牙髓细胞合成。90年代后，D'Souza〔7〕、Lukinmaa〔9〕等均发现，成牙本质细胞能够合成和分泌Ⅲ型胶原。Lukinmaa、D'Souza等还发现，在修复性牙本质形成后，沿新生成的牙本质排列的细胞并不表达Ⅲ型胶原。Magloire〔8〕等发现修复性牙本质形成时有Ⅲ型胶原的表达。本研究结果与Magloire等结果一致。修复性牙本质中为何存在免疫反应阳性的Ⅲ型胶原，原因尚不清楚。很可能是，在牙髓修复的早期，新分化的成牙本质细胞样细胞在较短时间内合成和分泌Ⅲ型胶原，随后以合成I型胶原为主。分泌进入修复性牙本质基质中的Ⅲ型胶原因长期存在而被检测出来〔10〕。由于本研究未利用原位杂交技术对Ⅲ型胶原mRNA进行检测，故对此现象需要作进一步研究。
国家自然科学基金项目 项目编号：39830430
, 百拇医药
湖北省自然科学基金项目 编号：98J096
参考文献
1，樊明文,李成章,凌均启,等.牙本质非胶原蛋白诱导修复性牙本质形成的实验研究.口腔医学纵横,1996,12(1):67
2，Butler WT.Dentin matrix proteins and dentinogenesis.Connect Tissue Res,1995,33:381
3，Sodek J, Mandell SM.Collagen metabolism in rat incisor predentine in vivo:Synthesis and maturation of type I,α1(I)trimer,and type V collagens.Biochemistry,1982,21:2011
, 百拇医药
4，Magloire H,Joffre A,Grimaud JA,et al.Distribution of type Ⅲ collagen in the pulp parenchyma of the human developing tooth.Histochemistry,1982,74:319
5，Takita K,Ohsaki Y,Nakata M,et al.Immunofluorescence localization of type I and type Ⅲ collagen and fibronectin in mouse dental tissues in late development and during molar eruption.Arch Oral Biol,1987,32:273
6，Karjalainen S,Soderling E,Pelliniemi L,et al.Immunohistochemical localization of types I and Ⅲ collagen and fibronectin in the dentine of carious human teeth.Arch Oral Biol,1986,31:801
, 百拇医药
7，D'Souza RN,Bachman T,Baumgardner KR,et al.Characterization of cellular responses involved in reparative dentinogenesis in rat molars.J Dent Res,1995,74(2):702
8，Magloire H,Joffre A,Hartman DJ.Localization and synthesis of type Ⅲ collagen and fibronectin in human reparative dentine.Histochemistry,1988,88:141
9，Lukinmaa PL,Waltimo J.Immunohistochemical localization of types I,V,and Ⅵ collagen in human permanent teeth and periodontal ligament.J Dent Res,1992,71(2):391
10，Webb PP,Moxham BJ,Ralphs JR,et al.Immunolocalisation of collagens in the developing rat molar tooth.Eur J Oral Sci,1998,106(suppl 1):147
(收稿：2000-02-01修回：2000-03-13), 百拇医药