碱性成纤维细胞生长因子对兔下颌骨骨折愈合中血管生成的影响
作者：龚振宇 周树夏 曹建广 金岩
单位：第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科 710032
关键词：
实用口腔医学杂志000536 骨折后正常骨结构与骨血运均被破坏，二者在修复过程中经历了一系列形态结构及血流动力学变化，骨血供改变直接影响着骨折愈合的过程。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是体内发现的最为有效的血管生成因子，它对新生血管形成的多个环节均有明显的促进作用〔1〕。本实验应用外源性重组人碱性成纤维生长因子(rhbFGF)治疗兔下颌骨骨折，观察其对骨折局部新生血管形成的影响。
1 材料与方法
1.1 rhbFGF/胶原复合物膜的制备
超净工作台内将rhbFGF(珠海东大生物制品公司)8 μg用0.3 ml注射用水完全溶解后与牛胶原蛋白I 型(北京革瑞德生物制品公司)1.6 ml混合均匀，4 ℃下真空抽吸24 h，使其成为膜状物，环氧乙烷消毒2 h。对照组只用牛胶原蛋白I型1.6 ml，制备方法同前。
, 百拇医药
1.2 实验动物及分组
健康成年大耳白兔(第四军医大学实验动物中心提供)，雌雄兼有，体重1.7～2.0 kg，共50只。随机分为实验组及对照组，1、2、4、8、12周时间点各5只。
1.3 手术方法
动物麻醉、脱毛、消毒后沿右侧下颌骨下缘切开皮肤、皮下、骨膜，剥离骨膜，用涡轮机在角前切迹处磨开颊侧骨皮质，轻掰使其完全骨折〔2〕，放置rhbFGF/胶原膜于骨折处颊侧骨膜下，对照组放置单纯胶原膜，钢丝结扎固定，关闭伤口。分别于术后1、2、4、8、12周时处死动物，经颈动脉灌住40 g/L多聚甲醛固定，整体取出右侧下颌骨，不过多剥离骨折处软组织。
1.4免疫组织化学方法
小心拆除结扎钢丝，常规脱钙、脱水、透明、60 ℃浸蜡包埋，制备5 μm切片。按常规ABC法进行免疫组化染色，F8—RA单克隆抗体(Dako公司产品)，工作浓度为1∶50。
, 百拇医药
1.5 血管计数
阳性染色表现为点状褐色着色，定位于内皮细胞的胞质中，被褐染的单个内皮细胞或内皮细胞簇均被认为是单个微血管(图1)。低倍镜下于颊侧桥梁骨痂处寻找3个微血管最密集的区域，再分别于高倍镜下依一定次序测定每个区域的3个视野，共得9个数据，取其平均值，即为每个标本的血管密度〔3〕。
图 F8-RA阳性的血管内皮细胞(20×10)
2 结 果
在术后1、2、4、8周时rhbFGF治疗组骨折局部新生血管数明显高于对照组(P<0.01)。
表1 rhbFGF治疗组与对照组骨痂内血管密度(条/高倍镜视野,
±s) 组 别
, 百拇医药
1周
2周
4周
8周
12周
rhbFGF组
50.7±3.4①
47.8±2.0①
30.8±1.4①
22.0±1.9①
18.0±2.7
, 百拇医药 对 照 组
37.2±2.1
36.2±1.7
27.1±1.9
18.8±1.4
16.3±2.6
①P<0.01
3 讨 论
本实验中骨痂内血管数量最多时为骨折后1周时，以后逐渐减少。rhbFGF治疗组血管数量在每一时间点均高于对照组，但随着时间推移，两组差距逐渐缩小。bFGF是体内发现的最为有效的血管生成因子，在体内外均能刺激大血管和毛细血管内皮细胞增殖，促进内皮细胞迁移并释放至少两种间质降解酶：胶原酶和纤溶酶原激活剂，降解细胞外间质蛋白，使内皮细胞和成纤维细胞突破细胞外骨架而形成新血管。此外bFGF还能维持内皮细胞已分化状态，推迟细胞衰老，增加细胞与基质的附着〔1〕。
, 百拇医药
bFGF通过促进新生血管形成可以使骨折后早期出现的急性非特异性反应如血清碱性磷酸酶与血磷浓度升高、血钙浓度下降及骨折后10 d时出现的降钙素、甲状旁腺激素和24-25-(OH)2D升高等信息，通过血液循环运抵损伤区，并发挥作用〔4〕。Leung〔5〕等发现骨折愈合两周内ATP含量最高，这种高能代谢状态也要求骨血供提高。骨血流增高尚能使骨髓内低PO2、高PCO2状态得以纠正。新生血管的长入能将钙磷等元素和大量间充质细胞带入损伤区，间充质细胞进一步转化为成骨细胞，参与骨形成〔6〕。还有研究表明血管内皮细胞可以转化为成骨细胞，血管是参与成骨活动的，当内皮细胞受到刺激时，就会急剧地改变自己的特性，获得幼稚的发育中成纤维细胞或生发细胞状态，进一步分化〔7〕。由此可见bFGF通过其强大的促进新生血管形成的作用促进骨折修复过程。
本实验结果表明rhbFGF能促进兔下颌骨骨折局部新生血管的生成，可能为因血液循环障碍所致的骨愈合不良的治疗提供一个新的思路。
, 百拇医药
参考文献
1，周廷冲主编. 多肽生长因子的基础与临床. 北京：中国科学技术出版社,1992.205～227
2，Jin Y, Yang LJ, White FH. An immunocytochemical study of BMP in experimental fracture healing of the rabbit mandible. Chin Med Sci J,1991, 9:91
3，李龙江,温玉明,毛祖彝,等. 颊粘膜鳞癌微血管密度与增殖细胞比率的定量研究. 中华口腔医学杂志,1997,4：227
4，Meller Y, Kestenbaum RS, Mozes M, et al. Mineral and endocrine metabolism during fracture healing in dogs. Clin Orthop, 1984,187:289
, 百拇医药
5，Leung KS, Sher AH, Lam TS, et al. Energy metabolism in fracture healing: Measurement of adenosine triphosphate in callus to monitor progress. J Bone Joint Surg, 1989,71B(4):657
6，Shapiro F. Cortical bone repair: The relationship of the lacunar-canalicular system and intercellular gap junction to the repair process. J Bone Joint Surg, 1988,70A(7): 1067
7，王云钊，李国珍编著. 骨关节创伤X线诊断学. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995.87～94
(收稿：2000-02-01), http://www.100md.com
单位：第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科 710032
关键词：
实用口腔医学杂志000536 骨折后正常骨结构与骨血运均被破坏，二者在修复过程中经历了一系列形态结构及血流动力学变化，骨血供改变直接影响着骨折愈合的过程。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是体内发现的最为有效的血管生成因子，它对新生血管形成的多个环节均有明显的促进作用〔1〕。本实验应用外源性重组人碱性成纤维生长因子(rhbFGF)治疗兔下颌骨骨折，观察其对骨折局部新生血管形成的影响。
1 材料与方法
1.1 rhbFGF/胶原复合物膜的制备
超净工作台内将rhbFGF(珠海东大生物制品公司)8 μg用0.3 ml注射用水完全溶解后与牛胶原蛋白I 型(北京革瑞德生物制品公司)1.6 ml混合均匀，4 ℃下真空抽吸24 h，使其成为膜状物，环氧乙烷消毒2 h。对照组只用牛胶原蛋白I型1.6 ml，制备方法同前。
, 百拇医药
1.2 实验动物及分组
健康成年大耳白兔(第四军医大学实验动物中心提供)，雌雄兼有，体重1.7～2.0 kg，共50只。随机分为实验组及对照组，1、2、4、8、12周时间点各5只。
1.3 手术方法
动物麻醉、脱毛、消毒后沿右侧下颌骨下缘切开皮肤、皮下、骨膜，剥离骨膜，用涡轮机在角前切迹处磨开颊侧骨皮质，轻掰使其完全骨折〔2〕，放置rhbFGF/胶原膜于骨折处颊侧骨膜下，对照组放置单纯胶原膜，钢丝结扎固定，关闭伤口。分别于术后1、2、4、8、12周时处死动物，经颈动脉灌住40 g/L多聚甲醛固定，整体取出右侧下颌骨，不过多剥离骨折处软组织。
1.4免疫组织化学方法
小心拆除结扎钢丝，常规脱钙、脱水、透明、60 ℃浸蜡包埋，制备5 μm切片。按常规ABC法进行免疫组化染色，F8—RA单克隆抗体(Dako公司产品)，工作浓度为1∶50。
, 百拇医药
1.5 血管计数
阳性染色表现为点状褐色着色，定位于内皮细胞的胞质中，被褐染的单个内皮细胞或内皮细胞簇均被认为是单个微血管(图1)。低倍镜下于颊侧桥梁骨痂处寻找3个微血管最密集的区域，再分别于高倍镜下依一定次序测定每个区域的3个视野，共得9个数据，取其平均值，即为每个标本的血管密度〔3〕。
图 F8-RA阳性的血管内皮细胞(20×10)
2 结 果
在术后1、2、4、8周时rhbFGF治疗组骨折局部新生血管数明显高于对照组(P<0.01)。
表1 rhbFGF治疗组与对照组骨痂内血管密度(条/高倍镜视野,
±s) 组 别, 百拇医药
1周
2周
4周
8周
12周
rhbFGF组
50.7±3.4①
47.8±2.0①
30.8±1.4①
22.0±1.9①
18.0±2.7
, 百拇医药 对 照 组
37.2±2.1
36.2±1.7
27.1±1.9
18.8±1.4
16.3±2.6
①P<0.01
3 讨 论
本实验中骨痂内血管数量最多时为骨折后1周时，以后逐渐减少。rhbFGF治疗组血管数量在每一时间点均高于对照组，但随着时间推移，两组差距逐渐缩小。bFGF是体内发现的最为有效的血管生成因子，在体内外均能刺激大血管和毛细血管内皮细胞增殖，促进内皮细胞迁移并释放至少两种间质降解酶：胶原酶和纤溶酶原激活剂，降解细胞外间质蛋白，使内皮细胞和成纤维细胞突破细胞外骨架而形成新血管。此外bFGF还能维持内皮细胞已分化状态，推迟细胞衰老，增加细胞与基质的附着〔1〕。
, 百拇医药
bFGF通过促进新生血管形成可以使骨折后早期出现的急性非特异性反应如血清碱性磷酸酶与血磷浓度升高、血钙浓度下降及骨折后10 d时出现的降钙素、甲状旁腺激素和24-25-(OH)2D升高等信息，通过血液循环运抵损伤区，并发挥作用〔4〕。Leung〔5〕等发现骨折愈合两周内ATP含量最高，这种高能代谢状态也要求骨血供提高。骨血流增高尚能使骨髓内低PO2、高PCO2状态得以纠正。新生血管的长入能将钙磷等元素和大量间充质细胞带入损伤区，间充质细胞进一步转化为成骨细胞，参与骨形成〔6〕。还有研究表明血管内皮细胞可以转化为成骨细胞，血管是参与成骨活动的，当内皮细胞受到刺激时，就会急剧地改变自己的特性，获得幼稚的发育中成纤维细胞或生发细胞状态，进一步分化〔7〕。由此可见bFGF通过其强大的促进新生血管形成的作用促进骨折修复过程。
本实验结果表明rhbFGF能促进兔下颌骨骨折局部新生血管的生成，可能为因血液循环障碍所致的骨愈合不良的治疗提供一个新的思路。
, 百拇医药
参考文献
1，周廷冲主编. 多肽生长因子的基础与临床. 北京：中国科学技术出版社,1992.205～227
2，Jin Y, Yang LJ, White FH. An immunocytochemical study of BMP in experimental fracture healing of the rabbit mandible. Chin Med Sci J,1991, 9:91
3，李龙江,温玉明,毛祖彝,等. 颊粘膜鳞癌微血管密度与增殖细胞比率的定量研究. 中华口腔医学杂志,1997,4：227
4，Meller Y, Kestenbaum RS, Mozes M, et al. Mineral and endocrine metabolism during fracture healing in dogs. Clin Orthop, 1984,187:289
, 百拇医药
5，Leung KS, Sher AH, Lam TS, et al. Energy metabolism in fracture healing: Measurement of adenosine triphosphate in callus to monitor progress. J Bone Joint Surg, 1989,71B(4):657
6，Shapiro F. Cortical bone repair: The relationship of the lacunar-canalicular system and intercellular gap junction to the repair process. J Bone Joint Surg, 1988,70A(7): 1067
7，王云钊，李国珍编著. 骨关节创伤X线诊断学. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995.87～94
(收稿：2000-02-01), http://www.100md.com