PDGF-B基因表达及其对成纤维细胞增生和胶原合成的促进作用
作者：王忠彪 孙逊 李勇 俞璎 戴金凤 陈常庆 范维琥
单位：王忠彪 李勇 范维琥 200040 上海医科大学附属华山医院心脏科；孙逊 俞璎 戴金凤 陈常庆 中国科学院上海生物工程研究中心
关键词：血小板衍生生长因子；基因；表达；NIH3T3细胞
中华创伤杂志980408 【摘要】 目的 建立稳定表达人血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB)的细胞株,并考察该重组蛋白与损伤修复有关的生物学作用。方法 将含PDGF-B基因的真核表达载体pcDNA3转染小鼠成纤维细胞NIH3T3中,在G418选择压力下得到抗性克隆,收集扩增的抗性克隆培养液并制备细胞膜上PDGF-BB蛋白质,3H-TdR掺入法表达产物的生物学活性,并以3H-Pro掺入测胶原合成率。结果 免疫荧光染色法证实抗性细胞中PDGF-BB的表达,膜上PDGF-BB显著促进NIH3T3细胞DNA合成,活性可达约31.2U/106细胞,而培养液的致丝裂活性低于可检测水平。抗性细胞的胶原合成率显著增高。结论 PDGF-BB的真核表达系统已得以成功构建,该重组蛋白可促进成纤维细胞增生和胶原合成,提示其在损伤修复中有潜在应用价值。
, 百拇医药
PDGF-B Gene Expression and Its Stimulating Effect on Fibroblast Proliferation and Collagen Synthesis WANG Zhong-biao*, SUN Xun, LI Yong, et al. *Dept. of Cardiology, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040
【Abstract】 Aim To study the biological effect of human platelet-derived growth factor (PDGF)-BB on injury healing. Methods A recombinant eukaryotic vector containing human PDGF-B gene was transduced into mouse fibroblasts NIH3T3. The positive clones were obtained under the selection of G418-media. The media and the membrane fractions of the drug resistance cells were well respectively prepared for assaying their biological activity by means of 3 H-TdR incorpration. The effect of PDGF-BB on the collagen synthesis of the fibroblasts was estimated with 3 H-Proline incorpration. Results The recommbinant protein of the drug resistance cell membrane significantly stimulated the DNA synthesis of NTH3T3 cells with the mitogenic activity about 31.2U/106 cells while the activity in the media was below the detectable level. The PDGF-BB antigen in drug resistance cells was positive in immunofluorescent staining while that in the control group was negative, and the drug resistance cells had significantly higher 3 H-proline incorpration than that of the control cells. conclusion A cell strain expressing biologically active PDGF-BB was successfully established. The recombinant PDGF-BB stimulated the mitogenesis and collagen synthesis of the fibroblasts, which may have some clinical value in injury repair.
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【Key words】 Platelet-derived growth factor Gene Expression NIH3T3 cell
血小板衍生生长因子(PDGF)是由二硫键相连,反向平行的两条链(A或B链)构成,有三种二聚体形式(PDGF-AA,-BB,-AB)具有多种生物学功能。诸如它是多种细胞的强力丝裂原和趋化物。目前研究发现外科手术后和/或损伤修复过程中伴随有局部PDGF-B链基因表达量的升高和受体的上调等,此外尚有许多研究结果提示它在损伤修复中起重要作用,甚至被称为损伤修复因子,美国FDA也已批准其进入软组织损伤和糖尿病溃疡方面的临床试验。
制备具有生物学活性的PDGF,不仅具有潜在的临床应用价值,而且有助于评估其在某些相关疾病(如动脉粥样硬化,恶性肿瘤等)中的确切作用。本研究旨在建立PDGF-B链基因的真核表达系统并深入考察其与损伤修复密切相关的生物学作用。
, 百拇医药 材料与方法
一、基因、细胞、菌株与试剂
本实验所用的PDGF-B cDNA由美国哈佛医学院Collins等构建并提供,长约2.2kb以EcoRI插入质粒pUC9,真核表达载体pcDNA3由中国科学院基因库提供,3H-TdR和3H-Proline购自中国原子能研究院同位素研究所,Ecoli.JM103、DH5α菌株用于扩增质粒,限制性内切酶、T4DNA连接酶,脂质体转染试剂Lipofectamine等购自Promega公司,NIN3T3细胞购自中国科学院细胞生物研究所,细胞培养基、G418为GIBCO-BRL公司产品,PDGF-BB标准品、兔抗PDGF-BB抗体,羊抗兔荧光抗体分别由Promega、华顺,华美公司提供。
二、质粒转化、扩增、抽提、酶切和片断回收
, 百拇医药 按标准方法[1]进行。
三、重组质粒pcDNA3 PDGF-B的构建
限制性内切酶BamH 1和EcoR 1分别酶切pcDNA3和PUC9 PDGF-B,回收载体和供体目的片断,在T4DNA连接酶作用下进行连接反应,经转化、抽提和酶切鉴定后,将重组质粒命名为pcDNA3 PDGF-B。
四、NIH3T3细胞的转染和筛选、转移、扩增
转染前1天,将NIH3T3细胞按2×105个/孔接种于6孔板,过夜培养后吸弃原完全培养基,以无血清培养基轻洗2次,用脂质体介导转染法[2]将重组质粒pcDNA3PDGF-B转染细胞,然后恢复生长至近融合,再1∶3传入另外6孔板,用含有G418(500μg/ml)的完全培养基筛选培养形成单克隆,再经96孔板、6孔板筛选培养,转入培养瓶培养。细胞长至近融合时,弃原培养液,Hanks液洗3次,改用无血清培养基4ml再培养6小时,收集条件培养基,待测。
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五、膜蛋白的制备
用低渗裂解法[3]裂解细胞,离心(1 000×g,10min)除去细胞核,上清液再经离心(100000×g, 90min)沉淀膜组份,以10mMPB(pH7.4)复悬膜沉淀物,煮5分钟,再离心(100 000×g,45min)重新沉淀膜,收集上清备测。
六、免疫荧光细胞化学染色
转染后的NIH3T3细胞传入自制的载玻片上培养,2天后取出载玻片,PBS洗3次后丙酮/甲醇固定5分钟,再以PBS洗,在玻片上滴加1∶100稀释的一抗,湿盒中孵育1小时PBS洗后滴加1∶45稀释的荧光抗体,孵育30分钟后,荧光显微镜下观察并拍照。
七、表达产物的致丝裂活性检测
参照文献[4],将NIH3T3细胞以含10%小牛血清的DMEM调成细胞悬液,按2×104个/孔传入96孔板,37℃孵箱中培养6天,使细胞达静止。待测样品直接加入,继续孵育16小时,加入0.2μci 3 H-TdR,孵育5小时,然后用10%三氯乙酸固定,0.25N NaOH溶解,进行液闪计数。参照Promega公司提供的标准方案,以引起半最大刺激反应的生长因子浓度为一个活性单位,以PDGF-BB标准品为参照。
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八、胶原合成率的测定
采用同位素液闪测定方法[5],将转染pcDNA3 PDGF-B的NIH3T3细胞和未经转染的NIH3T3细胞以2×106个/瓶传入培养瓶,培养24小时后,加入3H-Pro(1μci/瓶),5小时后终止培养,PBS轻洗3次,胰酶消化后以PBS洗2次,离心,弃样品上清,0.1mlPBS复悬细胞。液氮、细胞孵箱内反复冻融,再离心,取样品上清加入液闪杯中继续测量,测量误差≤2.5%(每组细胞设6瓶)。
结 果
一、限制性内切酶酶切片断分析
载体pcDNA3质粒经BamH 1和EcoR 1酶解,显示5.4kb片断,供体pUC9PDGF-B质粒以BamH 1和EcoR 1酶切得三个片断,大小分别约:736bp、1.4kb、2.7kb,其中1.4kb片断含PDGF-B编码区,将其与酶切后的载体片断连接成重组DNA,核重组DNA转化大肠杆菌后抽提得重组质粒,再以BamH 1和EcoR 1酶切,同时相应酶切载体和供体DNA作为对照,进行1%琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示:重组质粒DNA用BamH 1和EcoR 1酶切后得到5.4kb和1.4kb两个片断,表明含编码区的PDGF-B cDNA片断已正确重组于pcDNA3载体中。
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二、免疫荧光细胞化学染色结果
重组质粒pcDNA3PDGF-B转染的NIH3T3细胞免疫荧光细胞化学染色显示细胞膜、胞浆均呈阳性染色,而质粒pcDNA3PDGF-B转染的对照细胞染色为阴性。
三、表达产物PDGF-BB活性测定结果
本实验以表达产物PDGF-BB诱发3H-TdR掺入NIH3T3细胞的能力评估其致丝裂活性。结果见附图,pcDNA3PDGF-B转导的细胞条件培养基的致丝裂活性低于检测水平,而该细胞膜组分能诱发高水平的3H-TdR掺入,活性约为31.2U/106细胞,其促DNA合成作用可被相应抗体特异性抑制,表明所测得的有丝分裂活性来源于PDGF-BB。
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附图 细胞膜上PDGF-BB蛋白的致丝裂情况
▲:由图所示数目的细胞所制备的膜蛋白直接用于检测的结果;○:与相应抗体预孵育后一定数量细胞的膜蛋白的3H-TdR掺入值。
四、胶原合成率的测定结果
质粒pcDNA3转染后的NIH3T3细胞3H-Pro掺入率为(5.98±0.37)dpm/104细胞,而重组质粒pcDNA3PDGF-B转染后的抗性细胞为(9.34±0.46)dpm/104细胞,两者差异极显著(P<0.001)。
讨 论
目前国内外多从血制品中提取、纯化PDGF,但血制品昂贵,且操作工艺繁琐,此外原核系统宿主细胞因不具备组装二硫键和糖基化作用等功能,难以表达具有活性的PDGF分子,本研究采用哺乳动物细胞表达PDGF-BB分子,国内尚未见类似报道。
, 百拇医药
本实验所用的真核表达载体pcDNA3含巨细胞病毒启动因子供目的基因插入的多克隆位点,牛生长激素基因加尾信号。所以PDGF-B基因插入后可形成一个完整的转录单位。该载体还携有氨苄青霉素、新霉素磷酸转移酶抗性基因,故有利于转化大肠杆菌和转染真核细胞后筛选阳性克隆,因此,该载体在基因转移及病毒研究中得以广泛应用。
本实验结果提示成纤维细胞所表达的PDGF-BB主要是以滞留在细胞上的形式存在,国外也有类似报道[6]。PDGF滞留的生物学功能至今仍令人迷惑,但至少滞留在细胞表面的PDGF-BB可对其毗邻细胞发生作用,可能还包括促进自分泌刺激[7]。
PDGF在损伤修复中具有重要意义。本实验在真核细胞中表达出具有活性的PDGF-BB,其促进成纤维细胞NIH3T3合成、细胞增生、转导该重组基因的成纤维细胞胶原合成率显著提高,至于后者可能与PDGF-B基因表达后的自分泌刺激诱导其它静息状态基因(包括表达胶原的胶原)的活化有关[8]。成纤维细胞的增殖和胶原合成的增加无疑将促进损伤修复。
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目前该表达人PDGF-B基因的NIH3T3细胞已连续传代12次,重组PDGF-BB表达水平未见明显变化,表明PDGF-BB基因已整合于NIH3T3细胞的染色体中,具有转录和翻译活性,可望作为基因工程生产重组PDGF-BB的种子细胞。
本课题受国家卫生部科研基金资助
参考文献
[1]Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 16-60.
[2]姜泊,张亚历,周殿元.分子生物学常用实验方法.第一版,北京:人民军医出版社,1996, 157-158.
, 百拇医药
[3]Giese N. Expression and purification of biologically active V-sis/platelet-derived growth factor B protein by using a baculovirus vector system. J Virol. 1989, 7∶3080-3086.
[4]Leal F, Williams LT, Robbins KC, et al. Evidence that the V-sis gene product transforms by interaction with the receptor for platelet-derived growth factor. Science, 1992, 230∶327-330.
[5]汪兆琦.同位素液闪测定.见:细胞生物学实用方法与技术.第一版,北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1995, 159-161.
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[6]Robbins KC, Leal F, Pierce JH, et al. The V-sis/PDGF-2 transforming gene product localizes to cell membranes but is not a secretory protein. EMBO J, 1985, 4∶257-288.
[7]Westermark B, Sorg C. Biology of platelet-derived growth factor (Cytokines Vol.5). Switzerland: S.karger AG. Basel, 1993, 13-18.
[8]Deuel TF, Silverman NJ, Kawahara RS. Platelet-derived growth factor: A multifunctional regulator of normal and abnormal cell growth. Biofactors, 1998, 1∶213-217.
(收稿:1997-08-07 修回:1998-03-31), 百拇医药
单位：王忠彪 李勇 范维琥 200040 上海医科大学附属华山医院心脏科；孙逊 俞璎 戴金凤 陈常庆 中国科学院上海生物工程研究中心
关键词：血小板衍生生长因子；基因；表达；NIH3T3细胞
中华创伤杂志980408 【摘要】 目的 建立稳定表达人血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB)的细胞株,并考察该重组蛋白与损伤修复有关的生物学作用。方法 将含PDGF-B基因的真核表达载体pcDNA3转染小鼠成纤维细胞NIH3T3中,在G418选择压力下得到抗性克隆,收集扩增的抗性克隆培养液并制备细胞膜上PDGF-BB蛋白质,3H-TdR掺入法表达产物的生物学活性,并以3H-Pro掺入测胶原合成率。结果 免疫荧光染色法证实抗性细胞中PDGF-BB的表达,膜上PDGF-BB显著促进NIH3T3细胞DNA合成,活性可达约31.2U/106细胞,而培养液的致丝裂活性低于可检测水平。抗性细胞的胶原合成率显著增高。结论 PDGF-BB的真核表达系统已得以成功构建,该重组蛋白可促进成纤维细胞增生和胶原合成,提示其在损伤修复中有潜在应用价值。
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PDGF-B Gene Expression and Its Stimulating Effect on Fibroblast Proliferation and Collagen Synthesis WANG Zhong-biao*, SUN Xun, LI Yong, et al. *Dept. of Cardiology, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040
【Abstract】 Aim To study the biological effect of human platelet-derived growth factor (PDGF)-BB on injury healing. Methods A recombinant eukaryotic vector containing human PDGF-B gene was transduced into mouse fibroblasts NIH3T3. The positive clones were obtained under the selection of G418-media. The media and the membrane fractions of the drug resistance cells were well respectively prepared for assaying their biological activity by means of 3 H-TdR incorpration. The effect of PDGF-BB on the collagen synthesis of the fibroblasts was estimated with 3 H-Proline incorpration. Results The recommbinant protein of the drug resistance cell membrane significantly stimulated the DNA synthesis of NTH3T3 cells with the mitogenic activity about 31.2U/106 cells while the activity in the media was below the detectable level. The PDGF-BB antigen in drug resistance cells was positive in immunofluorescent staining while that in the control group was negative, and the drug resistance cells had significantly higher 3 H-proline incorpration than that of the control cells. conclusion A cell strain expressing biologically active PDGF-BB was successfully established. The recombinant PDGF-BB stimulated the mitogenesis and collagen synthesis of the fibroblasts, which may have some clinical value in injury repair.
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【Key words】 Platelet-derived growth factor Gene Expression NIH3T3 cell
血小板衍生生长因子(PDGF)是由二硫键相连,反向平行的两条链(A或B链)构成,有三种二聚体形式(PDGF-AA,-BB,-AB)具有多种生物学功能。诸如它是多种细胞的强力丝裂原和趋化物。目前研究发现外科手术后和/或损伤修复过程中伴随有局部PDGF-B链基因表达量的升高和受体的上调等,此外尚有许多研究结果提示它在损伤修复中起重要作用,甚至被称为损伤修复因子,美国FDA也已批准其进入软组织损伤和糖尿病溃疡方面的临床试验。
制备具有生物学活性的PDGF,不仅具有潜在的临床应用价值,而且有助于评估其在某些相关疾病(如动脉粥样硬化,恶性肿瘤等)中的确切作用。本研究旨在建立PDGF-B链基因的真核表达系统并深入考察其与损伤修复密切相关的生物学作用。
, 百拇医药 材料与方法
一、基因、细胞、菌株与试剂
本实验所用的PDGF-B cDNA由美国哈佛医学院Collins等构建并提供,长约2.2kb以EcoRI插入质粒pUC9,真核表达载体pcDNA3由中国科学院基因库提供,3H-TdR和3H-Proline购自中国原子能研究院同位素研究所,Ecoli.JM103、DH5α菌株用于扩增质粒,限制性内切酶、T4DNA连接酶,脂质体转染试剂Lipofectamine等购自Promega公司,NIN3T3细胞购自中国科学院细胞生物研究所,细胞培养基、G418为GIBCO-BRL公司产品,PDGF-BB标准品、兔抗PDGF-BB抗体,羊抗兔荧光抗体分别由Promega、华顺,华美公司提供。
二、质粒转化、扩增、抽提、酶切和片断回收
, 百拇医药 按标准方法[1]进行。
三、重组质粒pcDNA3 PDGF-B的构建
限制性内切酶BamH 1和EcoR 1分别酶切pcDNA3和PUC9 PDGF-B,回收载体和供体目的片断,在T4DNA连接酶作用下进行连接反应,经转化、抽提和酶切鉴定后,将重组质粒命名为pcDNA3 PDGF-B。
四、NIH3T3细胞的转染和筛选、转移、扩增
转染前1天,将NIH3T3细胞按2×105个/孔接种于6孔板,过夜培养后吸弃原完全培养基,以无血清培养基轻洗2次,用脂质体介导转染法[2]将重组质粒pcDNA3PDGF-B转染细胞,然后恢复生长至近融合,再1∶3传入另外6孔板,用含有G418(500μg/ml)的完全培养基筛选培养形成单克隆,再经96孔板、6孔板筛选培养,转入培养瓶培养。细胞长至近融合时,弃原培养液,Hanks液洗3次,改用无血清培养基4ml再培养6小时,收集条件培养基,待测。
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五、膜蛋白的制备
用低渗裂解法[3]裂解细胞,离心(1 000×g,10min)除去细胞核,上清液再经离心(100000×g, 90min)沉淀膜组份,以10mMPB(pH7.4)复悬膜沉淀物,煮5分钟,再离心(100 000×g,45min)重新沉淀膜,收集上清备测。
六、免疫荧光细胞化学染色
转染后的NIH3T3细胞传入自制的载玻片上培养,2天后取出载玻片,PBS洗3次后丙酮/甲醇固定5分钟,再以PBS洗,在玻片上滴加1∶100稀释的一抗,湿盒中孵育1小时PBS洗后滴加1∶45稀释的荧光抗体,孵育30分钟后,荧光显微镜下观察并拍照。
七、表达产物的致丝裂活性检测
参照文献[4],将NIH3T3细胞以含10%小牛血清的DMEM调成细胞悬液,按2×104个/孔传入96孔板,37℃孵箱中培养6天,使细胞达静止。待测样品直接加入,继续孵育16小时,加入0.2μci 3 H-TdR,孵育5小时,然后用10%三氯乙酸固定,0.25N NaOH溶解,进行液闪计数。参照Promega公司提供的标准方案,以引起半最大刺激反应的生长因子浓度为一个活性单位,以PDGF-BB标准品为参照。
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八、胶原合成率的测定
采用同位素液闪测定方法[5],将转染pcDNA3 PDGF-B的NIH3T3细胞和未经转染的NIH3T3细胞以2×106个/瓶传入培养瓶,培养24小时后,加入3H-Pro(1μci/瓶),5小时后终止培养,PBS轻洗3次,胰酶消化后以PBS洗2次,离心,弃样品上清,0.1mlPBS复悬细胞。液氮、细胞孵箱内反复冻融,再离心,取样品上清加入液闪杯中继续测量,测量误差≤2.5%(每组细胞设6瓶)。
结 果
一、限制性内切酶酶切片断分析
载体pcDNA3质粒经BamH 1和EcoR 1酶解,显示5.4kb片断,供体pUC9PDGF-B质粒以BamH 1和EcoR 1酶切得三个片断,大小分别约:736bp、1.4kb、2.7kb,其中1.4kb片断含PDGF-B编码区,将其与酶切后的载体片断连接成重组DNA,核重组DNA转化大肠杆菌后抽提得重组质粒,再以BamH 1和EcoR 1酶切,同时相应酶切载体和供体DNA作为对照,进行1%琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示:重组质粒DNA用BamH 1和EcoR 1酶切后得到5.4kb和1.4kb两个片断,表明含编码区的PDGF-B cDNA片断已正确重组于pcDNA3载体中。
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二、免疫荧光细胞化学染色结果
重组质粒pcDNA3PDGF-B转染的NIH3T3细胞免疫荧光细胞化学染色显示细胞膜、胞浆均呈阳性染色,而质粒pcDNA3PDGF-B转染的对照细胞染色为阴性。
三、表达产物PDGF-BB活性测定结果
本实验以表达产物PDGF-BB诱发3H-TdR掺入NIH3T3细胞的能力评估其致丝裂活性。结果见附图,pcDNA3PDGF-B转导的细胞条件培养基的致丝裂活性低于检测水平,而该细胞膜组分能诱发高水平的3H-TdR掺入,活性约为31.2U/106细胞,其促DNA合成作用可被相应抗体特异性抑制,表明所测得的有丝分裂活性来源于PDGF-BB。
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附图 细胞膜上PDGF-BB蛋白的致丝裂情况
▲:由图所示数目的细胞所制备的膜蛋白直接用于检测的结果;○:与相应抗体预孵育后一定数量细胞的膜蛋白的3H-TdR掺入值。
四、胶原合成率的测定结果
质粒pcDNA3转染后的NIH3T3细胞3H-Pro掺入率为(5.98±0.37)dpm/104细胞,而重组质粒pcDNA3PDGF-B转染后的抗性细胞为(9.34±0.46)dpm/104细胞,两者差异极显著(P<0.001)。
讨 论
目前国内外多从血制品中提取、纯化PDGF,但血制品昂贵,且操作工艺繁琐,此外原核系统宿主细胞因不具备组装二硫键和糖基化作用等功能,难以表达具有活性的PDGF分子,本研究采用哺乳动物细胞表达PDGF-BB分子,国内尚未见类似报道。
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本实验所用的真核表达载体pcDNA3含巨细胞病毒启动因子供目的基因插入的多克隆位点,牛生长激素基因加尾信号。所以PDGF-B基因插入后可形成一个完整的转录单位。该载体还携有氨苄青霉素、新霉素磷酸转移酶抗性基因,故有利于转化大肠杆菌和转染真核细胞后筛选阳性克隆,因此,该载体在基因转移及病毒研究中得以广泛应用。
本实验结果提示成纤维细胞所表达的PDGF-BB主要是以滞留在细胞上的形式存在,国外也有类似报道[6]。PDGF滞留的生物学功能至今仍令人迷惑,但至少滞留在细胞表面的PDGF-BB可对其毗邻细胞发生作用,可能还包括促进自分泌刺激[7]。
PDGF在损伤修复中具有重要意义。本实验在真核细胞中表达出具有活性的PDGF-BB,其促进成纤维细胞NIH3T3合成、细胞增生、转导该重组基因的成纤维细胞胶原合成率显著提高,至于后者可能与PDGF-B基因表达后的自分泌刺激诱导其它静息状态基因(包括表达胶原的胶原)的活化有关[8]。成纤维细胞的增殖和胶原合成的增加无疑将促进损伤修复。
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目前该表达人PDGF-B基因的NIH3T3细胞已连续传代12次,重组PDGF-BB表达水平未见明显变化,表明PDGF-BB基因已整合于NIH3T3细胞的染色体中,具有转录和翻译活性,可望作为基因工程生产重组PDGF-BB的种子细胞。
本课题受国家卫生部科研基金资助
参考文献
[1]Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 16-60.
[2]姜泊,张亚历,周殿元.分子生物学常用实验方法.第一版,北京:人民军医出版社,1996, 157-158.
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[3]Giese N. Expression and purification of biologically active V-sis/platelet-derived growth factor B protein by using a baculovirus vector system. J Virol. 1989, 7∶3080-3086.
[4]Leal F, Williams LT, Robbins KC, et al. Evidence that the V-sis gene product transforms by interaction with the receptor for platelet-derived growth factor. Science, 1992, 230∶327-330.
[5]汪兆琦.同位素液闪测定.见:细胞生物学实用方法与技术.第一版,北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1995, 159-161.
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[6]Robbins KC, Leal F, Pierce JH, et al. The V-sis/PDGF-2 transforming gene product localizes to cell membranes but is not a secretory protein. EMBO J, 1985, 4∶257-288.
[7]Westermark B, Sorg C. Biology of platelet-derived growth factor (Cytokines Vol.5). Switzerland: S.karger AG. Basel, 1993, 13-18.
[8]Deuel TF, Silverman NJ, Kawahara RS. Platelet-derived growth factor: A multifunctional regulator of normal and abnormal cell growth. Biofactors, 1998, 1∶213-217.
(收稿:1997-08-07 修回:1998-03-31), 百拇医药