Ti-75合金对人成骨细胞的生长、增殖和功能分化的影响
作者：张春宝 陈富林 张蓉 马轩祥 宋应亮
单位：张春宝(第四军医大学口腔医学院 710032)；陈富林(第四军医大学口腔医学院 710032)；张蓉(第四军医大学口腔医学院 710032)；马轩祥(第四军医大学口腔医学院 710032)；宋应亮(第四军医大学口腔医学院 710032)
关键词：种植材料；成骨细胞；细胞培养
实用口腔医学杂志000108 摘 要：目的：研究Ti-75合金对人成骨细胞生长、增殖和功能分化的影响。方法：将传至第5代的人成骨细胞接种于Ti-75合金表面进行培养，在不同培养时间进行细胞计数，计算细胞贴壁率，绘制细胞生长曲线，检测细胞裂解产物中的碱性磷酸酶(ALPase)活性和蛋白质含量。结果：培养于Ti-75合金表面的人成骨细胞在24 h贴壁率达到84.38%，细胞ALPase活性和蛋白质合成量在培养第7天后出现明显增大趋势,各项指标同作为对照组的纯钛相比，均无显著差异。结论：Ti-75合金具有与纯钛相同的良好骨组织生物相容性，适于作为骨内种植材料应用。
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分类号：R783.1 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)01-0024-03
Experimental research on the osteoblasts function on Ti-75 alloy
Zhang Chunbao Chen Fulin Zhang Rong et al.
(School of Stomatology,The Fourth Military Medical University,Xian 710032)
Abstract：Objective：To study the human osteoblasts function on Ti-75 alloy surface. Method: Human osteoblast of passage five were seeded onto Ti-75 alloy and Titanium surface, cell attachment efficiency was calculated, cell growth curve was drawn, and ALPase activity and protein content were measured at different intervals after seeding.Results: cell attachment efficiency on Ti-75 alloy surface reached 84.38% 24 hours after seeding. ALPase activity and protein content increased significantly 7 days after seeding. There were no significant differences between the human osteoblasts function on the surface of Ti-75 alloy and Titanium. Conclusion: Ti-75 alloy had good bio compatibility just as Titanium and was suitable to be used as the biomaterials for dental implant。
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Key words：Implants materials;Osteoblasts;Cell cultivation▲
在生物材料领域中,钛及钛合金以杰出的生物相容性和良好的耐腐蚀性等优点,占据了非常重要的地位。Ti-75合金是中国西北有色金属研究院近年研制出的一种新型钛合金,其强度介于纯钛和Ti-6Al-4V之间,不含钒,机加工性能优于纯钛，是作为骨内种植的良好备选材料。近年来,由于细胞培养和分化提纯技术的研究进展,为观察骨细胞和生物材料的相互作用提供了一个有效的手段〔1〕，应用细胞培养的方法,建立骨一种植体界面的体外模型,对成骨细胞在种植材料表面的吸附、分化等表达特点进行研究,使在细胞和分子水平上研究生物材料与生物组织的相互作用成为可能。本研究即是采用上述方法，研究Ti-75合金对人成骨细胞的生长和功能分化的影响，以评价Ti-75合金作为骨内种植材料应具有的骨组织生物相容性〔2〕。
1 材料和方法
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1.1 实验材料
Ti-75合金、TA2纯钛(西北有色金属研究院提供)；人成骨细胞(本院中心实验室提供)等。
1.2 实验方法
1.2.1 试件处理 Ti-75合金及TA2加工成直径15 mm,厚1 mm的圆片试件，经喷砂、清洗后，高温高压消毒,分别置于经放射线消毒的24孔细胞培养板中。整个操作过程中均以钛钳夹持试件,防止异种元素污染。
1.2.2 成骨细胞贴壁率的测定 d=15 mm的Ti-75和TA2试件分别放于24孔培养板中,接种传至第5代的人成骨细胞,接种密度: 4×104个/ml，每孔加入0.5 ml。DMEM培养液中含有体积分数(φ)为10%胎牛血清、50 μg/ml L—抗坏血酸。放入二氧化碳培养箱37 ℃,饱和湿度,φ(CO2)=5%培养。分别于培养 1、2、8、24 h后各取出3个孔,去除细胞培养液，0.01 mol/L PBS清洗3次，2.5 g/L胰酶0.25 ml /孔消化3 min，加0.25 ml细胞培养液中和胰酶,细胞计数板计数细胞,每孔重复4次,取平均值。贴壁率计算公式为:贴壁细胞数/接种细胞数×100%。
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1.3 成骨细胞生长曲线的测定
d=15 mm的 Ti-75和TA2试件放于 24孔培养板中,接种传至第5代的人成骨细胞,接种密度:2×104个/ml，每孔加入0.5 ml，培养液同前。分别于1、4、7、10 d各取出 4个孔,进行细胞计数,绘制生长曲线。
1.4 成骨细胞功能、分化指标检测。
细胞培养方法同1.3，接种后第1天始,每3 d换液一次,取4、7、10、14 d4个点进行培养,每时间点4个孔，用于制备细胞裂解液。制备细胞裂解产物: 吸去培养液，0.01 mol/L PBS清洗细胞3次,细胞裂解液(体积分数为0.02%Triton X-100,0.3 mmol/L PBS, pH7.2～7.4)200 μl，4 ℃下放置24 h。
1.4.1 细胞层碱性磷酸酶(ALPase)活性测定 细胞裂解产物100 μl加入反应底物(对硝基苯磷酸盐PNPP，Mg2+) 150 μl， 37 ℃孵育30 min,加入0.4 mol/L NaOH 100 μl终止反应,酶联免疫仪检测吸光度值,波长为410 nm。
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1.4.2 细胞层蛋白质含量测定 细胞裂解产物20 μl加显色液(50 g/L考马斯亮蓝 G250、φ(乙醇)=2.375%、42.5 g/LH2PO4)200 μl，混合均匀10 min，酶联免疫仪测定吸光度值,波长为595 nm。
2 结 果
2.1 Ti-75合金表面成骨细胞贴壁率的测定
接种于Ti-75合金表面的人成骨细胞在前2 h的贴壁率为45.31%，到 24 h贴壁率达到84.38%(图1)。与TA2相比，在各个培养时间的细胞贴壁率二者无明显差异。
2.2 细胞生长曲线
Ti-75与TA2表现出近乎相同的生长特点,培养第1天,细胞数为1.51×104,至第7天,细胞增长为3.31×104个,第 10 d时,细胞数达到8.23×104个。(图2)。
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2.3 细胞的功能分化指标
细胞 ALPase活性和蛋白质合成量由吸光度值表示。从图3、4可看出,上述指标在培养第7天后出现明显增大趋势。
图1 不同培养时间Ti-75和TA2表面成骨细胞的贴壁率培养时间
图2 Ti-75及TA2表面人成骨细胞生长曲线培养时间
图3 Ti-75及TA2表面细胞层ALPase活性培养时间
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图4 Ti-75及TA2表面细胞层蛋白质含量
3 讨 论
3.1 种植体—骨界面的愈合机制
对于骨内种植生物材料,除要求其满足基本的生物相容性要求之外,还应具有利于种植体骨—界面骨性愈合的性质,即骨组织生物相容性〔2〕。种植材料与骨组织的相互作用即种植体—骨界面的愈合机制对种植材料的性能以及种植体的预后有着极其重要的意义。对于骨内种植材料的骨组织生物相容性研究,是将骨组织对材料的反应作为研究重点,侧重的是研究生物材料对骨愈合过程的能动性影响。关于种植体植入骨内后的种植体—骨界面愈合机制,人们普遍认为是通过种植体表面与周围组织在分子及细胞水平上的相互作用而完成的。种植体植入骨内后,很快的吸附周围血液、组织液中的生物大分子,如:纤维粘连蛋白,骨粘连蛋白,纤维蛋白原以及各种细胞因子(如骨形成蛋白,β-转化生长因子等),形成生物大分子层, 从而引起一系列的细胞学变化：细胞转化因子引导未分化间充质细胞、骨母细胞、成骨细胞向种植体表面移行，通过细胞粘连因子而发生贴壁,在细胞生长因子的作用下出现增殖或分化等不同的反应〔3〕。种植体表面的细胞层增殖、分化、合成并分泌细胞外基质,矿化成骨。种植材料表面的理化性质能影响生物大分子层的结构、组成和空间构象，进而导致不同的细胞学表现。因此,骨内种植材料表面选择性吸附生物大分子是它影响整个界面骨愈合过程的中间环节。这一影响可通过细胞学的反应表现出来。成骨细胞在生物材料表面的贴壁率、生长曲线、细胞层碱性磷酸酶活性和蛋白质含量等指标可反应细胞的生长与功能分化两方面的特性,从组织愈合的一般特性到骨愈合的特殊性两方面较全面的反应骨内种植材料促进界面骨性愈合的能力,从而可作为体外评价骨内种植材料骨性生物相容性的有效指标。
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3.2 Ti-75合金的骨组织相容性评价
纯钛表面的惰性氧化膜使其具有比较理想的骨组织生物相容性,在骨内种植材料中占据了显著的地位。然而，纯钛的力学性能仍显得相对偏弱，Ti-6AL-4V合金虽然具有较高的力学性能,但由于它含有钒、铝等有害成分,其应用前景尚存在争议。Ti-75合金的抗拉强度和屈服强度分别为790和630 MPa,力学性能介于Ti-6AL-4V和纯钛之间，且其韧性高于Ti-6AL-4V，不含钒,含铝量也很低。裘松波〔4〕采用体外成纤维细胞培养法对Ti-75合金的细胞毒性和耐腐蚀性进行的实验研究表明:Ti-75合金具有良好的生物相容性和耐腐蚀性,是作为骨内种植体较为理想的候选材料，因而对Ti-75合金的骨组织生物相容性的评价则显示出很大的必要性。
从本实验结果可以看出：在相同的接种密度和培养条件下,在Ti-75和纯钛表面培养的成骨细胞贴壁率、细胞生长曲线几乎重叠,形状接近“S”形,因而可认为Ti-75与纯钛在对细胞生长的影响上具有相同的作用。同样,从细胞层ALPase活性和蛋白质含量等细胞功能分化的指标也可看出,在Ti-75和纯钛上培养的人成骨细胞的上述各项指标随培养时间变化的曲线也近乎重叠。实验结果表明： Ti-75合金的骨组织生物相容性的各项指标与纯钛均无显著差异，可以认为， Ti-75具有与纯钛一样良好的骨组织生物相容性，结合其良好的机械力学性能,可看出 Ti-75合金在骨内种植材料的应用中将具有良好的前景。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目，批准号39700164，39470759
参考文献：
[1]Itakura Y,Kosugi A,Sudo H,et al.Development of a new sysfem for evaluaing the biocompatibility of implants materials using an osteogene cell line.J Biomed Mater Res,1988,22:613
[2]李德华. 钛种植体表面改良喷砂处理对其骨性生物相容性影响的实验研究：〔学位论文〕. 西安:第四军医大学口腔医学院. 1996,5
[3]Ziats NP,Miller KM,Anderson JM. In vitro and in vivo interactions of cells with biomaterials.Biomaterials, 1988, 9:5
[4]裘松波,郭天文,王为,等.新型钛合金 Ti-75的体外细胞相容性试验.实用口腔医学杂志,1995,11:179
收稿日期：1998-08-23
修改日期：1999-08-17, http://www.100md.com
单位：张春宝(第四军医大学口腔医学院 710032)；陈富林(第四军医大学口腔医学院 710032)；张蓉(第四军医大学口腔医学院 710032)；马轩祥(第四军医大学口腔医学院 710032)；宋应亮(第四军医大学口腔医学院 710032)
关键词：种植材料；成骨细胞；细胞培养
实用口腔医学杂志000108 摘 要：目的：研究Ti-75合金对人成骨细胞生长、增殖和功能分化的影响。方法：将传至第5代的人成骨细胞接种于Ti-75合金表面进行培养，在不同培养时间进行细胞计数，计算细胞贴壁率，绘制细胞生长曲线，检测细胞裂解产物中的碱性磷酸酶(ALPase)活性和蛋白质含量。结果：培养于Ti-75合金表面的人成骨细胞在24 h贴壁率达到84.38%，细胞ALPase活性和蛋白质合成量在培养第7天后出现明显增大趋势,各项指标同作为对照组的纯钛相比，均无显著差异。结论：Ti-75合金具有与纯钛相同的良好骨组织生物相容性，适于作为骨内种植材料应用。
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分类号：R783.1 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)01-0024-03
Experimental research on the osteoblasts function on Ti-75 alloy
Zhang Chunbao Chen Fulin Zhang Rong et al.
(School of Stomatology,The Fourth Military Medical University,Xian 710032)
Abstract：Objective：To study the human osteoblasts function on Ti-75 alloy surface. Method: Human osteoblast of passage five were seeded onto Ti-75 alloy and Titanium surface, cell attachment efficiency was calculated, cell growth curve was drawn, and ALPase activity and protein content were measured at different intervals after seeding.Results: cell attachment efficiency on Ti-75 alloy surface reached 84.38% 24 hours after seeding. ALPase activity and protein content increased significantly 7 days after seeding. There were no significant differences between the human osteoblasts function on the surface of Ti-75 alloy and Titanium. Conclusion: Ti-75 alloy had good bio compatibility just as Titanium and was suitable to be used as the biomaterials for dental implant。
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Key words：Implants materials;Osteoblasts;Cell cultivation▲
在生物材料领域中,钛及钛合金以杰出的生物相容性和良好的耐腐蚀性等优点,占据了非常重要的地位。Ti-75合金是中国西北有色金属研究院近年研制出的一种新型钛合金,其强度介于纯钛和Ti-6Al-4V之间,不含钒,机加工性能优于纯钛，是作为骨内种植的良好备选材料。近年来,由于细胞培养和分化提纯技术的研究进展,为观察骨细胞和生物材料的相互作用提供了一个有效的手段〔1〕，应用细胞培养的方法,建立骨一种植体界面的体外模型,对成骨细胞在种植材料表面的吸附、分化等表达特点进行研究,使在细胞和分子水平上研究生物材料与生物组织的相互作用成为可能。本研究即是采用上述方法，研究Ti-75合金对人成骨细胞的生长和功能分化的影响，以评价Ti-75合金作为骨内种植材料应具有的骨组织生物相容性〔2〕。
1 材料和方法
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1.1 实验材料
Ti-75合金、TA2纯钛(西北有色金属研究院提供)；人成骨细胞(本院中心实验室提供)等。
1.2 实验方法
1.2.1 试件处理 Ti-75合金及TA2加工成直径15 mm,厚1 mm的圆片试件，经喷砂、清洗后，高温高压消毒,分别置于经放射线消毒的24孔细胞培养板中。整个操作过程中均以钛钳夹持试件,防止异种元素污染。
1.2.2 成骨细胞贴壁率的测定 d=15 mm的Ti-75和TA2试件分别放于24孔培养板中,接种传至第5代的人成骨细胞,接种密度: 4×104个/ml，每孔加入0.5 ml。DMEM培养液中含有体积分数(φ)为10%胎牛血清、50 μg/ml L—抗坏血酸。放入二氧化碳培养箱37 ℃,饱和湿度,φ(CO2)=5%培养。分别于培养 1、2、8、24 h后各取出3个孔,去除细胞培养液，0.01 mol/L PBS清洗3次，2.5 g/L胰酶0.25 ml /孔消化3 min，加0.25 ml细胞培养液中和胰酶,细胞计数板计数细胞,每孔重复4次,取平均值。贴壁率计算公式为:贴壁细胞数/接种细胞数×100%。
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1.3 成骨细胞生长曲线的测定
d=15 mm的 Ti-75和TA2试件放于 24孔培养板中,接种传至第5代的人成骨细胞,接种密度:2×104个/ml，每孔加入0.5 ml，培养液同前。分别于1、4、7、10 d各取出 4个孔,进行细胞计数,绘制生长曲线。
1.4 成骨细胞功能、分化指标检测。
细胞培养方法同1.3，接种后第1天始,每3 d换液一次,取4、7、10、14 d4个点进行培养,每时间点4个孔，用于制备细胞裂解液。制备细胞裂解产物: 吸去培养液，0.01 mol/L PBS清洗细胞3次,细胞裂解液(体积分数为0.02%Triton X-100,0.3 mmol/L PBS, pH7.2～7.4)200 μl，4 ℃下放置24 h。
1.4.1 细胞层碱性磷酸酶(ALPase)活性测定 细胞裂解产物100 μl加入反应底物(对硝基苯磷酸盐PNPP，Mg2+) 150 μl， 37 ℃孵育30 min,加入0.4 mol/L NaOH 100 μl终止反应,酶联免疫仪检测吸光度值,波长为410 nm。
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1.4.2 细胞层蛋白质含量测定 细胞裂解产物20 μl加显色液(50 g/L考马斯亮蓝 G250、φ(乙醇)=2.375%、42.5 g/LH2PO4)200 μl，混合均匀10 min，酶联免疫仪测定吸光度值,波长为595 nm。
2 结 果
2.1 Ti-75合金表面成骨细胞贴壁率的测定
接种于Ti-75合金表面的人成骨细胞在前2 h的贴壁率为45.31%，到 24 h贴壁率达到84.38%(图1)。与TA2相比，在各个培养时间的细胞贴壁率二者无明显差异。
2.2 细胞生长曲线
Ti-75与TA2表现出近乎相同的生长特点,培养第1天,细胞数为1.51×104,至第7天,细胞增长为3.31×104个,第 10 d时,细胞数达到8.23×104个。(图2)。
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2.3 细胞的功能分化指标
细胞 ALPase活性和蛋白质合成量由吸光度值表示。从图3、4可看出,上述指标在培养第7天后出现明显增大趋势。
图1 不同培养时间Ti-75和TA2表面成骨细胞的贴壁率培养时间
图2 Ti-75及TA2表面人成骨细胞生长曲线培养时间
图3 Ti-75及TA2表面细胞层ALPase活性培养时间
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图4 Ti-75及TA2表面细胞层蛋白质含量
3 讨 论
3.1 种植体—骨界面的愈合机制
对于骨内种植生物材料,除要求其满足基本的生物相容性要求之外,还应具有利于种植体骨—界面骨性愈合的性质,即骨组织生物相容性〔2〕。种植材料与骨组织的相互作用即种植体—骨界面的愈合机制对种植材料的性能以及种植体的预后有着极其重要的意义。对于骨内种植材料的骨组织生物相容性研究,是将骨组织对材料的反应作为研究重点,侧重的是研究生物材料对骨愈合过程的能动性影响。关于种植体植入骨内后的种植体—骨界面愈合机制,人们普遍认为是通过种植体表面与周围组织在分子及细胞水平上的相互作用而完成的。种植体植入骨内后,很快的吸附周围血液、组织液中的生物大分子,如:纤维粘连蛋白,骨粘连蛋白,纤维蛋白原以及各种细胞因子(如骨形成蛋白,β-转化生长因子等),形成生物大分子层, 从而引起一系列的细胞学变化：细胞转化因子引导未分化间充质细胞、骨母细胞、成骨细胞向种植体表面移行，通过细胞粘连因子而发生贴壁,在细胞生长因子的作用下出现增殖或分化等不同的反应〔3〕。种植体表面的细胞层增殖、分化、合成并分泌细胞外基质,矿化成骨。种植材料表面的理化性质能影响生物大分子层的结构、组成和空间构象，进而导致不同的细胞学表现。因此,骨内种植材料表面选择性吸附生物大分子是它影响整个界面骨愈合过程的中间环节。这一影响可通过细胞学的反应表现出来。成骨细胞在生物材料表面的贴壁率、生长曲线、细胞层碱性磷酸酶活性和蛋白质含量等指标可反应细胞的生长与功能分化两方面的特性,从组织愈合的一般特性到骨愈合的特殊性两方面较全面的反应骨内种植材料促进界面骨性愈合的能力,从而可作为体外评价骨内种植材料骨性生物相容性的有效指标。
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3.2 Ti-75合金的骨组织相容性评价
纯钛表面的惰性氧化膜使其具有比较理想的骨组织生物相容性,在骨内种植材料中占据了显著的地位。然而，纯钛的力学性能仍显得相对偏弱，Ti-6AL-4V合金虽然具有较高的力学性能,但由于它含有钒、铝等有害成分,其应用前景尚存在争议。Ti-75合金的抗拉强度和屈服强度分别为790和630 MPa,力学性能介于Ti-6AL-4V和纯钛之间，且其韧性高于Ti-6AL-4V，不含钒,含铝量也很低。裘松波〔4〕采用体外成纤维细胞培养法对Ti-75合金的细胞毒性和耐腐蚀性进行的实验研究表明:Ti-75合金具有良好的生物相容性和耐腐蚀性,是作为骨内种植体较为理想的候选材料，因而对Ti-75合金的骨组织生物相容性的评价则显示出很大的必要性。
从本实验结果可以看出：在相同的接种密度和培养条件下,在Ti-75和纯钛表面培养的成骨细胞贴壁率、细胞生长曲线几乎重叠,形状接近“S”形,因而可认为Ti-75与纯钛在对细胞生长的影响上具有相同的作用。同样,从细胞层ALPase活性和蛋白质含量等细胞功能分化的指标也可看出,在Ti-75和纯钛上培养的人成骨细胞的上述各项指标随培养时间变化的曲线也近乎重叠。实验结果表明： Ti-75合金的骨组织生物相容性的各项指标与纯钛均无显著差异，可以认为， Ti-75具有与纯钛一样良好的骨组织生物相容性，结合其良好的机械力学性能,可看出 Ti-75合金在骨内种植材料的应用中将具有良好的前景。
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参考文献：
[1]Itakura Y,Kosugi A,Sudo H,et al.Development of a new sysfem for evaluaing the biocompatibility of implants materials using an osteogene cell line.J Biomed Mater Res,1988,22:613
[2]李德华. 钛种植体表面改良喷砂处理对其骨性生物相容性影响的实验研究：〔学位论文〕. 西安:第四军医大学口腔医学院. 1996,5
[3]Ziats NP,Miller KM,Anderson JM. In vitro and in vivo interactions of cells with biomaterials.Biomaterials, 1988, 9:5
[4]裘松波,郭天文,王为,等.新型钛合金 Ti-75的体外细胞相容性试验.实用口腔医学杂志,1995,11:179
收稿日期：1998-08-23
修改日期：1999-08-17, http://www.100md.com