单抗与细胞毒药物化学交联的概况
作者：何 颖 张尚权1 严缘昌1
单位：(上海华东师范大学生物系,上海200062)
关键词：免疫交联物；单克隆抗体；抗肿瘤(癌)
中国新药杂志980603 摘要 综述了近几年来单克隆抗体与细胞毒药物交联用于肿瘤治疗的一些化学方法，并对其优缺点进行了比较，同时对目前较流行的光敏交联、酸酶交联等方法进行了介绍。
GENERAL SITUATION IN CHEMICAL CROSS-LINKAGE OF
MONOCLONAL ANTIBODY AND CYTOTOXIC DRUGS
He Ying,Zhang Shangquan,Yan Yuanchang
, 百拇医药
(Department of Biology,East China Normal University,Shanghai 200062)
ABSTRACT Chemical methods for cross-linkage of monoclonal antibody and cytotoxic drugs ，their application in developing anticancer drug and clinical importance of these immunoconjugats were reviewed by the authors.
KEY WORDS Immunoconjugate；MoAb；Anti-tumor(cancer)
大多数抗肿瘤药在治疗肿瘤过程中，也对正常组织，尤其是代谢旺盛的骨髓细胞、胃肠道上皮细胞产生明显的毒副作用。为了减轻这种副作用曾运用了一些方法如：对母药进行化学修饰，生产对靶组织具有活性的前体药等，但效果并不明显。
, 百拇医药
随着肿瘤相关抗原及其相应的单克隆抗体的出现，制备一种具有选择性抗肿瘤作用的药物的研究有了很大的发展。早在1978年，Paul Ehrlich就提出共价连接抗肿瘤药和单克隆抗体能与相关抗原反应，使药物导向肿瘤组织。交联物与肿瘤细胞结合，内化，在溶酶体内降解，释放药或药物多肽片段，作用于DNA或RNA酶，抑制肿瘤生长。近年来，这种以单克隆抗体为载体，连接药物毒素、放射性核素、免疫分子和酶类进行肿瘤导向治疗的研究已取得令人鼓舞的结果，并已成为肿瘤新型生物治疗的主要研究方向之一,本文对单抗与化疗药物交联的各种化学方法作一介绍。
1 细胞毒药物与单抗结合的功能基团
大多数细胞毒药物是“自然”产物或化学合成产物。对一些同类抗癌药物的生物活性检测发现，功能基团对药物的活性很重要。大多数细胞毒药物的基团需要通过化学修饰转化为更合适的功能基团才能与单抗连接。例如：羟基经琥珀酰化很容易转化为羧基，羧酸酯与肼反应转为酰肼。见表1。
, 百拇医药
表1 药物功能基团的化学修饰[1] 功能基团
试剂
新功能基团
OH
琥珀酸酐
OCOCH2CH2COOH
COOR1
肼
CONHNH2
COOH
CDI/NHS
, 百拇医药
活性酯
CH(OH)CH(OH)
高碘酸
醛
CH(OH)CH(NH2)
高碘酸
醛
NH2
SMPB
马来酰亚胺
NH2
碘己酸活性酯
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COCH2I
NH2
琥珀酸酐
NHCOCH2CH2COOH
COCH3
溴
COCH2Br
2 抗体分子的作用基团
单抗有一定数目的反应基团可用于与药物交联，它们中的一些用于维持抗体三级结构，使其与抗原结合。对单抗广泛的共价修饰会导致抗体可溶性和活性丧失，不同的单抗被修饰的可能程度不同。因此，一旦设计了一种合适的交联方案，就有必要检测抗体活性和蛋白质被修饰后的恢复程度。目前，在单抗分子上引入反应基团的方法有3种：用异双功能交叉链；碳水化合物经高碘酸钠氧化形成醛基；二硫化物与DTT反应,还原形成游离的巯基。见表2。
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表2 单抗功能基团的化学修饰[1] 基团
试剂
新基团
NH2
SPDP
活化的二硫化物
NH2
MBS
马来酰亚胺
NH2
亚胺硫醇
SH
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NH2
碘乙酸活性酯
COCH22I
碳水化合物
高碘酸
CHO
SS
DTT
SH
3 药物与抗体交联的方法3.1 直接连接
3.1.1 戊二醛法 戊二醛可用于交叉连接两个氨基，此反应机制复杂，但有证据证明：酸性条件下,药物分子的氨基和单抗的氨基与戊二醛的醛基反应形成希佛氏键,在中性或偏碱性条件下,形成更复杂的反应物,反应中加入硼氢酸钠或氰基硼氢酸钠可使醛基和氨基之间的希佛氏键稳定。使用戊二醛作为交联剂存在的主要问题是反应分子间容易发生聚合作用。如果把反应分为两个阶段进行，即首先用戊二醛与1种成份混合，除去多余的戊二醛，然后再与第2成份反应，对减少不必要的副反应有一定效果[2]。尽管用戊二醛交联具有聚合反应的缺点,但戊二醛方法已用于阿霉素和道诺霉素等与单抗交联。
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3.1.2 碳化二亚胺(CDI) 交联剂CDI与氨基和羧基反应形成酰胺键。在反应中，也会发生聚合反应。用预先制成具有活性的药物衍生物和单抗反应可减少聚合反应。CDI已用于阿霉素、道诺霉素 、氨甲蝶呤与单抗的交联。
3.1.3 活性酯 利用活性酯能使带有羧基的药物与单抗联接，N-羟基琥珀酸亚氨(NHS)和羧酸反应形成酯，酯与氨基反应迅速，与水或羟基反应较慢。活性酯与氨基反应形成稳定的酰氨键，利用活性酯已使氨甲蝶呤、瘤可宁、N-乙酰左旋溶肉瘤素与单抗交联。氨甲蝶呤和氨基蝶呤与等量的NHS和CDI反应，在γ-羧基位置能被选择性活化。Endo等[3]研究提出氨甲蝶呤活性酯与单抗分子上的羟基反应的可能性。形成的酯键能被羟胺水解。用羟胺处理这些交联物可提高其在抗体反应性细胞和非反应性细胞之间的选择性细胞毒性。
3.1.4 酰肼 用羧酸或酯与肼反应可形成酰肼，酰肼在酸性条件下与醛反应形成腙。免疫球蛋白的铰链区具有碳水化合物支链，经高碘酸氧化为醛基，能与药物酰肼衍生物反应。用此方法使长春花碱和氨甲蝶呤与单抗交联，由于单抗位点的特异修饰，产生的交联物比活性酯方法产生的交联物更具免疫活性。
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3.1.5 卤化羰基 α-卤化羰基化合物能与巯基、氨基和羧基反应，例如：14-Br道诺霉素(14-Br Daunomycin) 和道诺霉素的衍生物14-Br-4-脱甲氧基道诺霉素(14-Br Idarubicin)已和多种蛋白质相连，用 14-BrIdarubicin 进行研究发现药物的羧基和氨基与抗体相连。阿霉素的N-碘乙酸衍生物与巯基化的抗体交联形成的交联物在体外与阿霉素的N-碘乙酸衍生物有相似活性。Umemoto等[4]近来研究发现，MTX的肽衍生物与碘乙酸衍生物反应后与单抗相连接。
3.1.6 溶酶体敏感链 抗原抗体复合物经细胞内吞作用进入溶酶体的作用机制引发人们设计一些链，使连接药物和抗体的链在溶酶体酶或低的pH条件下断裂，释放游离的药。Trouet等早期工作证明 Leu-Ala-Leu三肽和Ala-Leu-Ala-Leu四肽可作为连接药物和牛血清白蛋白(BSA)的链，在溶酶体内经水解释放游离的药。已经合成具有相似性质的链，如:Gly-Phe-Leu-Gly，用其连接氨甲蝶呤与单抗 。Shen等人已证实了用顺-乌头酸酐连接药物和抗体，药物的顺-乌头酸衍生物与聚L-赖氨酸连接，在pH 4.5～5条件下释放游离的药，用这种方法合成的道诺霉素、阿霉素单抗交联物在体内和体外都对肿瘤有杀伤作用。
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3.2 利用中间载体连接药物与抗体 利用无活性的物质作为中间载体使药物和单克隆抗体相连可增加抗体携带药物的物质的量。目前常用的有经修饰的葡萄糖、多聚氨基酸、人血清白蛋白等。
3.2.1 葡聚糖 葡聚糖由α-D-吡喃葡萄糖单元聚合而成。用各种方式衍化葡聚糖使其能与抗体连接。经高碘酸氧化，形成的多聚醛葡聚糖作为中间载体使胞嘧啶、博莱霉素、道诺霉素、阿霉素等与单抗相连。由多聚醛葡萄糖合成的氨基葡聚糖已用于DOX与单抗的连接，形成的免疫交联物每个单抗分子上带有40～60个MTX残基[5]。
3.2.2 聚氨基酸 聚L-氨基酸，如：聚L-谷氨酸和L-天冬氨酸可被酶消化的性质决定其能被用作中间介质携带大量药物。用两种方式可以使多聚氨基酸做为载体使药物与单抗相连：多聚氨基酸在α-氨基的位置用交联试剂(SPDP等)衍化，然后与单抗相连；用一种适合的功能化的单体的聚合合成聚L-氨基酸。Kato等[6]用后一种方法在多聚谷氨酸上引入巯基，然后与单抗相连。
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3.2.3 人血清白蛋白 人血清白蛋白(HSA)也可作为中间介质使氨甲蝶呤和丝裂霉素C与单抗交联。Garnett等[7]做过实验 ，用CDI使氨甲蝶呤与HSA连接，然后用DTT还原，使HSA上游离的巯基暴露，与用高碘酸作用后的单抗反应。用这种方法可以使38个氨甲蝶呤残基与单抗相连，产生的免疫交联物比游离的氨甲蝶呤更具杀伤活性。
4 进展
4.1 酸敏链的进展 Greenfield等[8]用SPDP或2-IT作为交联剂使ADM在C-13位置形成酰腙衍生物(ADM-HZN)与巯基化的单抗连接,用这种方法制成的免疫交联物在体内有较高的肿瘤特异性和稳定性,保护了药物分子蒽环上的糖残基。David等[9]用DOX的(6-Maleidocaproyl)腙衍生物与巯基化的单抗连接，1996年Froesch等[10]修改了Willner的方法，用SMCC作为交联剂，使DOX与单抗交联，形成的腙链在中性条件下稳定，对治疗小细胞肺癌有显著疗效 。Ansell等[11]用PDPH作为交联剂使IgG与含有马来酰亚胺的脂质体形成交联物，在体内与交联剂SPDP交联具有相似的活性，但在血循环中的清除率降低，PDPH可望作为传统交联剂SPDP的替代物。
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4.2 前体药的应用 前体药是无治疗活性或仅有较低活性，需在体内代谢转化为有治疗活性的药物。该药物可降低毒性延长药物在体内的作用时间，在肿瘤导向治疗中，用前体药转换酶蛋白与抗肿瘤单抗交联，先把该交联物注入体内，使其附于肿瘤组织表面，隔一定的时间后注入前体药，使其在肿瘤部位转化为有活性的药，杀伤肿瘤细胞。如：应用与单抗-羧肽酶偶联物合并应用前体药氨甲蝶呤-2-丙氨酸等。目前常用的前体药转换酶有：碱性磷酸酶，羧肽酶，青霉素V酰胺酶和胞嘧啶脱氨酶四类[12]。应用单抗-转换酶交联物活化前体药的关键因素有2个：抗体-酶偶联物能在肿瘤表面保留较长时间；选择合适的单抗和酶使前体药不能被正常组织的内源酶活化，达到局部抗肿瘤作用。
肿瘤靶向前体药转换治疗法能使肿瘤部位产生高浓度抗肿瘤药，使化疗药毒性降低到最小，增强化疗药对肿瘤杀伤力，为全身性肿瘤治疗开辟了新思路。
4.3 光敏交联物 目前陆续研制出光敏交联剂制备单抗-药交联物，光敏成分如：氯根离子e6[13]和血卟啉[14]等,与单抗相连，交联物中的光敏成分需被某种特定波长的光激发才具有活性，释放单线态氧。因为单线态氧可扩散，因此交联物不需内化就可杀伤周围缺乏肿瘤抗原的肿瘤细胞。Hemming等[15]用新的光敏试剂BPD(苯异卟啉衍生物)与肿瘤特异性单抗交联，用于治疗鳞状细胞癌，表现出相当高的肿瘤特异性 。光敏交联物的研究已成为近年来各国的研究热点之一。
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5 交联物初步临床研究
在肿瘤治疗中，交联物能被广泛的应用[16]:包括体外体内疗法、腔内疗法、白血病和实体瘤的全身疗法(静脉注射) 、实体瘤的介入疗法(动脉给药,肿瘤内注射或肿瘤周围注射)等。用单抗-阿霉素-顺铂交联物治疗儿科肝癌，5例中有2例肿瘤部分缩小。抗黑色素单抗与蓖麻毒A链交联物治疗22例黑色素瘤病人,有1例缓解,肺转移瘤消失。用小鼠单抗A7与新制癌菌素构成的交联物A7-NSC治疗结肠癌和胰腺癌73例,其中3例肝转移癌缩小,疼痛减轻。用免疫毒素治疗4例晚期霍奇金病，其中3例肿瘤明显缩小，维持6～10周。目前单抗药物交联物的研究多处于I期，已报告少数病例有疗效，但仍需继续研究，才能较全面的评价单抗导向药物的临床疗效。
6 交联物中单抗的制备要求
近年来由于临床研究的交联物几乎全部都用小鼠单抗制备,往往导致人抗鼠抗体(HAMA)反应。单抗人源化是目前普遍关注的问题。单抗人源化主要通过基因工程技术制备嵌和抗体或改形抗体。嵌和抗体是将抗体的Fc片段置换为人源性，其他部分仍为鼠源性。改形抗体是指除互补决定区(CDR)为鼠源单抗外,其他部分均为人源性。临床研究表明,嵌合抗体的副反应轻, HAMA反应率较鼠源性单抗低,在血中半衰期也较长。
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此外，抗体小型化对提高疗效也有重要意义，通过酶切方法得到单抗F(ab’)2或Fab片段,使其分子量相当于完整抗体的2/3和1/3左右。通过基因工程技术制备的抗体Fv片段或单链抗原结合蛋白，分子量约相当于抗体的1/6。研究表明小型化抗体片段较易穿透细胞外间隙达到深部的肿瘤细胞。据报道，由单抗 Fab’片段构成的交联物对癌细胞有很强的作用，在裸鼠体内试验，比由完整单抗构成的交联物有更高的疗效且毒性降低。
7 结语
综上所述的各种化学交联方法，都使药物对肿瘤组织的特异杀伤作用加强，减少了药物对正常组织的毒副作用，但各有其优缺点：直接交联方法虽然操作简单，形成的交联物分子较小，容易内化，但在反应过程中，反应分子间容易发生聚合反应，且抗体携带的药物分子数较少。利用中间载体连接药物和抗体，可以使抗体携带的药物分子数增多，但药物和抗体的活性较直接连接法低。酸敏链是目前较为流行的一种方法，该法使药物与单抗的连接稳定，对肿瘤的特异性和杀伤力增强。随着新的键和具有单一特征的保护基团(如：血清中的稳定性，溶酶体或水解酶的敏感性)的出现，单抗与细胞毒药物的交联技术日趋复杂，尽管免疫交联物的化学法可降低细胞毒素的非特异毒副作用，增加药物的组织特异性,对肿瘤细胞有更强的杀伤力,但化学交联法存在交联物分子量大，渗透性差及稳定性，差制备过程复杂等缺点。因此化学交联法必须与其他生物技术如：脂质体包裹药物技术，基因工程制备嵌合抗体，双特异性抗体，小分子抗体技术，改造药物和抗体的基因等技术相结合来消除抗体的免疫源性，减少抗体的非特异结合，提高抗体的稳定性和穿透肿瘤组织的能力，从而制备出具有高治疗活性的抗肿瘤导向药物。
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参考文献
1 Geoffrey AP.The linkage of cytotoxic drugs to monoclonal antibodies for the treatment of cancer.Bioconjugate Chem,1990,1(2)∶89
2 Gowsala PS,Paul JM, Ralph AR,et al. Therapeutic efficacy of a doxorubicin immunoconjugate in a preclinical model of spontaneous metastatic human melanoma. Cancer Res,1995,55∶2352
3 Endo N,Takeda Y,Umemoto N,et al.Nature of linkage and mode of action of methotrexate conjugated with antitumor antibodies.Implications for future preparation of conjugates.Cancer Res,1988 ,48∶3330
, http://www.100md.com
4 Umemoto N,Kato Y,Endo N,et al .Preparation and in vitro cytoxicity of a methotrexate-anti-MM46 monoclonal antibody conjugate via an oligopeptide spacer.Int J Cancer ,1989, 43∶677
5 Ming-Yang YEH,Steve R,Mu-Hsicn Yu,et al. Doxrubicin:monoclonal antibody conjugate for therapy of human cervical carcinoma. Int J cancer, 1992,51∶274
6 Kato Y,Umemoto N,Kayama Y,et al. A novel method of conjugation of daunomycin with antibody with a poly-l-glutamic acid derivative as intermediate drug carrier.An anti-α-fetoprotein antibody-daunomycin conjugate. J Med Chem,1984 ,27∶1602
, http://www.100md.com
7 Garnett MC, Baldwin RM. An improved synthesis of a methotrexate-Albumin-791T/36 monoclonal antibody conjugate cytotoxic to human osteogenic sarcoma cell lines.Cancer Res, 1986 ,46∶2407
8 Greenfield RS， Kaneko T, Daues A, et al. Evaluation in vitro of adriamycin immnoconjugates synthesized using an acid-sensitive hydrozone linker.Cancer Res,1990, 50∶6600
9 David W, Pamela AT,Trail, et al. (6-Maleilimidocaproyl) hydrazone of doxorubicin- d new derivative for the preparation of immunoconjugates of doxorubicin. Bioconjugate Chem,1993,4∶521
, 百拇医药
10 Froesch BA,Stahel U, Zangemeister-wittke,et al. Preparation and functional evaluation of new doxorubicin immunoconjugates containing an acid-sensitive linker on small-cell lung cancer cells. Cancer Res,1996 ,42∶55
11 Ansell SM,Tardi PG,Buchkowsky SS,et al.3-(2-pridyldithio) propionic acid hydrazide as a cross -linker in the formation of liposome-antibody conjugates. Bioconjugate Chem,1996, 7(4)∶490
12 曹广文， 杜平.现代癌症生物治疗学.北京：人民军医出版社，1995.426～429
, 百拇医药
13 Oseroff AR,Ohuoha D,Bommer JC,et al.Antibody- targeted photolysis:selective photodestruction of human T-cell leukemia cells using monoclonal antibody-chlorin e6 conjugates. Proc Natl Acad Sci USA,1986, 83∶8744
14 Mew D,Lum V,Wat CK,et al. Ability of specific monoclonal antibodies and conventional antisera conjugated to hematoporphyrin to label and kill selected cell lines subsequent to light activation.Cancer Res,1985, 45∶4380
15 Hemming AW,Davis NL,Dubois B, et al. Phtodynamic therapy of squamous cell carcinoma.An evaluation of a new photosensitive agent ,benzoporphyrin derivative and new phtoimmunoconjugate.Surg Oncol,1993,2(3)∶187
16 甑永苏.抗肿瘤导向药物研究的现状与展望.药学学报，1994，29(1)∶1
(收稿：1998—11—18 修回：1997—06—03), 百拇医药(何 颖 张尚权1 严缘昌1)
单位：(上海华东师范大学生物系,上海200062)
关键词：免疫交联物；单克隆抗体；抗肿瘤(癌)
中国新药杂志980603 摘要 综述了近几年来单克隆抗体与细胞毒药物交联用于肿瘤治疗的一些化学方法，并对其优缺点进行了比较，同时对目前较流行的光敏交联、酸酶交联等方法进行了介绍。
GENERAL SITUATION IN CHEMICAL CROSS-LINKAGE OF
MONOCLONAL ANTIBODY AND CYTOTOXIC DRUGS
He Ying,Zhang Shangquan,Yan Yuanchang
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(Department of Biology,East China Normal University,Shanghai 200062)
ABSTRACT Chemical methods for cross-linkage of monoclonal antibody and cytotoxic drugs ，their application in developing anticancer drug and clinical importance of these immunoconjugats were reviewed by the authors.
KEY WORDS Immunoconjugate；MoAb；Anti-tumor(cancer)
大多数抗肿瘤药在治疗肿瘤过程中，也对正常组织，尤其是代谢旺盛的骨髓细胞、胃肠道上皮细胞产生明显的毒副作用。为了减轻这种副作用曾运用了一些方法如：对母药进行化学修饰，生产对靶组织具有活性的前体药等，但效果并不明显。
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随着肿瘤相关抗原及其相应的单克隆抗体的出现，制备一种具有选择性抗肿瘤作用的药物的研究有了很大的发展。早在1978年，Paul Ehrlich就提出共价连接抗肿瘤药和单克隆抗体能与相关抗原反应，使药物导向肿瘤组织。交联物与肿瘤细胞结合，内化，在溶酶体内降解，释放药或药物多肽片段，作用于DNA或RNA酶，抑制肿瘤生长。近年来，这种以单克隆抗体为载体，连接药物毒素、放射性核素、免疫分子和酶类进行肿瘤导向治疗的研究已取得令人鼓舞的结果，并已成为肿瘤新型生物治疗的主要研究方向之一,本文对单抗与化疗药物交联的各种化学方法作一介绍。
1 细胞毒药物与单抗结合的功能基团
大多数细胞毒药物是“自然”产物或化学合成产物。对一些同类抗癌药物的生物活性检测发现，功能基团对药物的活性很重要。大多数细胞毒药物的基团需要通过化学修饰转化为更合适的功能基团才能与单抗连接。例如：羟基经琥珀酰化很容易转化为羧基，羧酸酯与肼反应转为酰肼。见表1。
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表1 药物功能基团的化学修饰[1] 功能基团
试剂
新功能基团
OH
琥珀酸酐
OCOCH2CH2COOH
COOR1
肼
CONHNH2
COOH
CDI/NHS
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活性酯
CH(OH)CH(OH)
高碘酸
醛
CH(OH)CH(NH2)
高碘酸
醛
NH2
SMPB
马来酰亚胺
NH2
碘己酸活性酯
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COCH2I
NH2
琥珀酸酐
NHCOCH2CH2COOH
COCH3
溴
COCH2Br
2 抗体分子的作用基团
单抗有一定数目的反应基团可用于与药物交联，它们中的一些用于维持抗体三级结构，使其与抗原结合。对单抗广泛的共价修饰会导致抗体可溶性和活性丧失，不同的单抗被修饰的可能程度不同。因此，一旦设计了一种合适的交联方案，就有必要检测抗体活性和蛋白质被修饰后的恢复程度。目前，在单抗分子上引入反应基团的方法有3种：用异双功能交叉链；碳水化合物经高碘酸钠氧化形成醛基；二硫化物与DTT反应,还原形成游离的巯基。见表2。
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表2 单抗功能基团的化学修饰[1] 基团
试剂
新基团
NH2
SPDP
活化的二硫化物
NH2
MBS
马来酰亚胺
NH2
亚胺硫醇
SH
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NH2
碘乙酸活性酯
COCH22I
碳水化合物
高碘酸
CHO
SS
DTT
SH
3 药物与抗体交联的方法3.1 直接连接
3.1.1 戊二醛法 戊二醛可用于交叉连接两个氨基，此反应机制复杂，但有证据证明：酸性条件下,药物分子的氨基和单抗的氨基与戊二醛的醛基反应形成希佛氏键,在中性或偏碱性条件下,形成更复杂的反应物,反应中加入硼氢酸钠或氰基硼氢酸钠可使醛基和氨基之间的希佛氏键稳定。使用戊二醛作为交联剂存在的主要问题是反应分子间容易发生聚合作用。如果把反应分为两个阶段进行，即首先用戊二醛与1种成份混合，除去多余的戊二醛，然后再与第2成份反应，对减少不必要的副反应有一定效果[2]。尽管用戊二醛交联具有聚合反应的缺点,但戊二醛方法已用于阿霉素和道诺霉素等与单抗交联。
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3.1.2 碳化二亚胺(CDI) 交联剂CDI与氨基和羧基反应形成酰胺键。在反应中，也会发生聚合反应。用预先制成具有活性的药物衍生物和单抗反应可减少聚合反应。CDI已用于阿霉素、道诺霉素 、氨甲蝶呤与单抗的交联。
3.1.3 活性酯 利用活性酯能使带有羧基的药物与单抗联接，N-羟基琥珀酸亚氨(NHS)和羧酸反应形成酯，酯与氨基反应迅速，与水或羟基反应较慢。活性酯与氨基反应形成稳定的酰氨键，利用活性酯已使氨甲蝶呤、瘤可宁、N-乙酰左旋溶肉瘤素与单抗交联。氨甲蝶呤和氨基蝶呤与等量的NHS和CDI反应，在γ-羧基位置能被选择性活化。Endo等[3]研究提出氨甲蝶呤活性酯与单抗分子上的羟基反应的可能性。形成的酯键能被羟胺水解。用羟胺处理这些交联物可提高其在抗体反应性细胞和非反应性细胞之间的选择性细胞毒性。
3.1.4 酰肼 用羧酸或酯与肼反应可形成酰肼，酰肼在酸性条件下与醛反应形成腙。免疫球蛋白的铰链区具有碳水化合物支链，经高碘酸氧化为醛基，能与药物酰肼衍生物反应。用此方法使长春花碱和氨甲蝶呤与单抗交联，由于单抗位点的特异修饰，产生的交联物比活性酯方法产生的交联物更具免疫活性。
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3.1.5 卤化羰基 α-卤化羰基化合物能与巯基、氨基和羧基反应，例如：14-Br道诺霉素(14-Br Daunomycin) 和道诺霉素的衍生物14-Br-4-脱甲氧基道诺霉素(14-Br Idarubicin)已和多种蛋白质相连，用 14-BrIdarubicin 进行研究发现药物的羧基和氨基与抗体相连。阿霉素的N-碘乙酸衍生物与巯基化的抗体交联形成的交联物在体外与阿霉素的N-碘乙酸衍生物有相似活性。Umemoto等[4]近来研究发现，MTX的肽衍生物与碘乙酸衍生物反应后与单抗相连接。
3.1.6 溶酶体敏感链 抗原抗体复合物经细胞内吞作用进入溶酶体的作用机制引发人们设计一些链，使连接药物和抗体的链在溶酶体酶或低的pH条件下断裂，释放游离的药。Trouet等早期工作证明 Leu-Ala-Leu三肽和Ala-Leu-Ala-Leu四肽可作为连接药物和牛血清白蛋白(BSA)的链，在溶酶体内经水解释放游离的药。已经合成具有相似性质的链，如:Gly-Phe-Leu-Gly，用其连接氨甲蝶呤与单抗 。Shen等人已证实了用顺-乌头酸酐连接药物和抗体，药物的顺-乌头酸衍生物与聚L-赖氨酸连接，在pH 4.5～5条件下释放游离的药，用这种方法合成的道诺霉素、阿霉素单抗交联物在体内和体外都对肿瘤有杀伤作用。
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3.2 利用中间载体连接药物与抗体 利用无活性的物质作为中间载体使药物和单克隆抗体相连可增加抗体携带药物的物质的量。目前常用的有经修饰的葡萄糖、多聚氨基酸、人血清白蛋白等。
3.2.1 葡聚糖 葡聚糖由α-D-吡喃葡萄糖单元聚合而成。用各种方式衍化葡聚糖使其能与抗体连接。经高碘酸氧化，形成的多聚醛葡聚糖作为中间载体使胞嘧啶、博莱霉素、道诺霉素、阿霉素等与单抗相连。由多聚醛葡萄糖合成的氨基葡聚糖已用于DOX与单抗的连接，形成的免疫交联物每个单抗分子上带有40～60个MTX残基[5]。
3.2.2 聚氨基酸 聚L-氨基酸，如：聚L-谷氨酸和L-天冬氨酸可被酶消化的性质决定其能被用作中间介质携带大量药物。用两种方式可以使多聚氨基酸做为载体使药物与单抗相连：多聚氨基酸在α-氨基的位置用交联试剂(SPDP等)衍化，然后与单抗相连；用一种适合的功能化的单体的聚合合成聚L-氨基酸。Kato等[6]用后一种方法在多聚谷氨酸上引入巯基，然后与单抗相连。
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3.2.3 人血清白蛋白 人血清白蛋白(HSA)也可作为中间介质使氨甲蝶呤和丝裂霉素C与单抗交联。Garnett等[7]做过实验 ，用CDI使氨甲蝶呤与HSA连接，然后用DTT还原，使HSA上游离的巯基暴露，与用高碘酸作用后的单抗反应。用这种方法可以使38个氨甲蝶呤残基与单抗相连，产生的免疫交联物比游离的氨甲蝶呤更具杀伤活性。
4 进展
4.1 酸敏链的进展 Greenfield等[8]用SPDP或2-IT作为交联剂使ADM在C-13位置形成酰腙衍生物(ADM-HZN)与巯基化的单抗连接,用这种方法制成的免疫交联物在体内有较高的肿瘤特异性和稳定性,保护了药物分子蒽环上的糖残基。David等[9]用DOX的(6-Maleidocaproyl)腙衍生物与巯基化的单抗连接，1996年Froesch等[10]修改了Willner的方法，用SMCC作为交联剂，使DOX与单抗交联，形成的腙链在中性条件下稳定，对治疗小细胞肺癌有显著疗效 。Ansell等[11]用PDPH作为交联剂使IgG与含有马来酰亚胺的脂质体形成交联物，在体内与交联剂SPDP交联具有相似的活性，但在血循环中的清除率降低，PDPH可望作为传统交联剂SPDP的替代物。
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4.2 前体药的应用 前体药是无治疗活性或仅有较低活性，需在体内代谢转化为有治疗活性的药物。该药物可降低毒性延长药物在体内的作用时间，在肿瘤导向治疗中，用前体药转换酶蛋白与抗肿瘤单抗交联，先把该交联物注入体内，使其附于肿瘤组织表面，隔一定的时间后注入前体药，使其在肿瘤部位转化为有活性的药，杀伤肿瘤细胞。如：应用与单抗-羧肽酶偶联物合并应用前体药氨甲蝶呤-2-丙氨酸等。目前常用的前体药转换酶有：碱性磷酸酶，羧肽酶，青霉素V酰胺酶和胞嘧啶脱氨酶四类[12]。应用单抗-转换酶交联物活化前体药的关键因素有2个：抗体-酶偶联物能在肿瘤表面保留较长时间；选择合适的单抗和酶使前体药不能被正常组织的内源酶活化，达到局部抗肿瘤作用。
肿瘤靶向前体药转换治疗法能使肿瘤部位产生高浓度抗肿瘤药，使化疗药毒性降低到最小，增强化疗药对肿瘤杀伤力，为全身性肿瘤治疗开辟了新思路。
4.3 光敏交联物 目前陆续研制出光敏交联剂制备单抗-药交联物，光敏成分如：氯根离子e6[13]和血卟啉[14]等,与单抗相连，交联物中的光敏成分需被某种特定波长的光激发才具有活性，释放单线态氧。因为单线态氧可扩散，因此交联物不需内化就可杀伤周围缺乏肿瘤抗原的肿瘤细胞。Hemming等[15]用新的光敏试剂BPD(苯异卟啉衍生物)与肿瘤特异性单抗交联，用于治疗鳞状细胞癌，表现出相当高的肿瘤特异性 。光敏交联物的研究已成为近年来各国的研究热点之一。
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5 交联物初步临床研究
在肿瘤治疗中，交联物能被广泛的应用[16]:包括体外体内疗法、腔内疗法、白血病和实体瘤的全身疗法(静脉注射) 、实体瘤的介入疗法(动脉给药,肿瘤内注射或肿瘤周围注射)等。用单抗-阿霉素-顺铂交联物治疗儿科肝癌，5例中有2例肿瘤部分缩小。抗黑色素单抗与蓖麻毒A链交联物治疗22例黑色素瘤病人,有1例缓解,肺转移瘤消失。用小鼠单抗A7与新制癌菌素构成的交联物A7-NSC治疗结肠癌和胰腺癌73例,其中3例肝转移癌缩小,疼痛减轻。用免疫毒素治疗4例晚期霍奇金病，其中3例肿瘤明显缩小，维持6～10周。目前单抗药物交联物的研究多处于I期，已报告少数病例有疗效，但仍需继续研究，才能较全面的评价单抗导向药物的临床疗效。
6 交联物中单抗的制备要求
近年来由于临床研究的交联物几乎全部都用小鼠单抗制备,往往导致人抗鼠抗体(HAMA)反应。单抗人源化是目前普遍关注的问题。单抗人源化主要通过基因工程技术制备嵌和抗体或改形抗体。嵌和抗体是将抗体的Fc片段置换为人源性，其他部分仍为鼠源性。改形抗体是指除互补决定区(CDR)为鼠源单抗外,其他部分均为人源性。临床研究表明,嵌合抗体的副反应轻, HAMA反应率较鼠源性单抗低,在血中半衰期也较长。
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此外，抗体小型化对提高疗效也有重要意义，通过酶切方法得到单抗F(ab’)2或Fab片段,使其分子量相当于完整抗体的2/3和1/3左右。通过基因工程技术制备的抗体Fv片段或单链抗原结合蛋白，分子量约相当于抗体的1/6。研究表明小型化抗体片段较易穿透细胞外间隙达到深部的肿瘤细胞。据报道，由单抗 Fab’片段构成的交联物对癌细胞有很强的作用，在裸鼠体内试验，比由完整单抗构成的交联物有更高的疗效且毒性降低。
7 结语
综上所述的各种化学交联方法，都使药物对肿瘤组织的特异杀伤作用加强，减少了药物对正常组织的毒副作用，但各有其优缺点：直接交联方法虽然操作简单，形成的交联物分子较小，容易内化，但在反应过程中，反应分子间容易发生聚合反应，且抗体携带的药物分子数较少。利用中间载体连接药物和抗体，可以使抗体携带的药物分子数增多，但药物和抗体的活性较直接连接法低。酸敏链是目前较为流行的一种方法，该法使药物与单抗的连接稳定，对肿瘤的特异性和杀伤力增强。随着新的键和具有单一特征的保护基团(如：血清中的稳定性，溶酶体或水解酶的敏感性)的出现，单抗与细胞毒药物的交联技术日趋复杂，尽管免疫交联物的化学法可降低细胞毒素的非特异毒副作用，增加药物的组织特异性,对肿瘤细胞有更强的杀伤力,但化学交联法存在交联物分子量大，渗透性差及稳定性，差制备过程复杂等缺点。因此化学交联法必须与其他生物技术如：脂质体包裹药物技术，基因工程制备嵌合抗体，双特异性抗体，小分子抗体技术，改造药物和抗体的基因等技术相结合来消除抗体的免疫源性，减少抗体的非特异结合，提高抗体的稳定性和穿透肿瘤组织的能力，从而制备出具有高治疗活性的抗肿瘤导向药物。
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参考文献
1 Geoffrey AP.The linkage of cytotoxic drugs to monoclonal antibodies for the treatment of cancer.Bioconjugate Chem,1990,1(2)∶89
2 Gowsala PS,Paul JM, Ralph AR,et al. Therapeutic efficacy of a doxorubicin immunoconjugate in a preclinical model of spontaneous metastatic human melanoma. Cancer Res,1995,55∶2352
3 Endo N,Takeda Y,Umemoto N,et al.Nature of linkage and mode of action of methotrexate conjugated with antitumor antibodies.Implications for future preparation of conjugates.Cancer Res,1988 ,48∶3330
, http://www.100md.com
4 Umemoto N,Kato Y,Endo N,et al .Preparation and in vitro cytoxicity of a methotrexate-anti-MM46 monoclonal antibody conjugate via an oligopeptide spacer.Int J Cancer ,1989, 43∶677
5 Ming-Yang YEH,Steve R,Mu-Hsicn Yu,et al. Doxrubicin:monoclonal antibody conjugate for therapy of human cervical carcinoma. Int J cancer, 1992,51∶274
6 Kato Y,Umemoto N,Kayama Y,et al. A novel method of conjugation of daunomycin with antibody with a poly-l-glutamic acid derivative as intermediate drug carrier.An anti-α-fetoprotein antibody-daunomycin conjugate. J Med Chem,1984 ,27∶1602
, http://www.100md.com
7 Garnett MC, Baldwin RM. An improved synthesis of a methotrexate-Albumin-791T/36 monoclonal antibody conjugate cytotoxic to human osteogenic sarcoma cell lines.Cancer Res, 1986 ,46∶2407
8 Greenfield RS， Kaneko T, Daues A, et al. Evaluation in vitro of adriamycin immnoconjugates synthesized using an acid-sensitive hydrozone linker.Cancer Res,1990, 50∶6600
9 David W, Pamela AT,Trail, et al. (6-Maleilimidocaproyl) hydrazone of doxorubicin- d new derivative for the preparation of immunoconjugates of doxorubicin. Bioconjugate Chem,1993,4∶521
, 百拇医药
10 Froesch BA,Stahel U, Zangemeister-wittke,et al. Preparation and functional evaluation of new doxorubicin immunoconjugates containing an acid-sensitive linker on small-cell lung cancer cells. Cancer Res,1996 ,42∶55
11 Ansell SM,Tardi PG,Buchkowsky SS,et al.3-(2-pridyldithio) propionic acid hydrazide as a cross -linker in the formation of liposome-antibody conjugates. Bioconjugate Chem,1996, 7(4)∶490
12 曹广文， 杜平.现代癌症生物治疗学.北京：人民军医出版社，1995.426～429
, 百拇医药
13 Oseroff AR,Ohuoha D,Bommer JC,et al.Antibody- targeted photolysis:selective photodestruction of human T-cell leukemia cells using monoclonal antibody-chlorin e6 conjugates. Proc Natl Acad Sci USA,1986, 83∶8744
14 Mew D,Lum V,Wat CK,et al. Ability of specific monoclonal antibodies and conventional antisera conjugated to hematoporphyrin to label and kill selected cell lines subsequent to light activation.Cancer Res,1985, 45∶4380
15 Hemming AW,Davis NL,Dubois B, et al. Phtodynamic therapy of squamous cell carcinoma.An evaluation of a new photosensitive agent ,benzoporphyrin derivative and new phtoimmunoconjugate.Surg Oncol,1993,2(3)∶187
16 甑永苏.抗肿瘤导向药物研究的现状与展望.药学学报，1994，29(1)∶1
(收稿：1998—11—18 修回：1997—06—03), 百拇医药(何 颖 张尚权1 严缘昌1)