硫普罗宁抗急性肝损伤的实验研究
作者：杜荔菁 唐望先 张文英 李绍白
单位：(同济医科大学附属同济医院肝病研究所，武汉430030)
关键词：硫普罗宁；肝损害；细胞因子
中国新药杂志980624 摘要 目的：用D-氨基半乳糖(D-GalN)制备大鼠急性肝损伤模型。方法：通过检测血清ALT及各种细胞因子包括：肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素8(IL-8)浓度的变化，并观察光镜和电镜下肝组织的病理改变，以探讨硫普罗宁对急性肝损害的保护作用。结果：模型组ALT、TNF-α、IL-6及IL-8显著升高；而硫普罗宁组ALT及以上各细胞因子的水平均较模型明显降低(P<0.01) 。结论：硫普罗宁可能通过免疫机制的调节，降低TNF-α、IL-6及IL-8等细胞因子的生成和释放，而对肝细胞的损伤呈现一定的保护作用。
EXPERIMENTAL STUDY ON THE EFFECT OF TIOPRONIN IN PROTECTION OF
, 百拇医药
ACUTE LIVER INJURY IN RATS
Du Lijing,Tang Wangxian, Zhang Wenying, et al.
(Institute of Liver Disease, Tongji Hospital,Tongji Medical
University Medical Sciences,Wuhan 430030)
ABSTRACT OBJECTIVE：To explore the effect of tiopronin in protection of acute liver injury in rats.METHODS:Acute liver injury model in rats was induced by D-galactosamine,and the serum level of cytokines determined in conjunction with microscopic and electron microscopic observations on pathological changes in liver were used to evaluate the liver protection effect of tiopronin.RESULTS:The serum concentration of cytokines,such as ALT,TNF-α,IL-6,and IL-8,in active and control groups were obtained,and the level of cytokines in active group were significantly reduced in comparation with those of control group.CONCLUSION:It can be concluded that tiopronin possesses obvious protection effect on acute liver injury in rats model in terms of inhibition of TNF-α,IL-6 and IL-8 .
, 百拇医药
KEY WORDS Tiopronin;Liver injury;Cytokine
材料与方法
1 实验材料
SD大鼠35只，雌雄各半，体重220～250 g，由本校实验动物中心提供。
D-GalN由重庆医科大学提供。临用前配制成800 mg/kg的生理盐水溶液。
硫普罗宁由湖北省医药工业研究所提供，实验前配成37 mg/ml。
肝得健胶囊：系德国Rhone-Poulenc Rorer公司生产，批号为41009200，实验前配成50 mg/ml的溶液灌胃。
2 实验动物分组及处理方法
, http://www.100md.com
实验动物随机分4组：正常对照组(5只)、模型组(10只)、硫普罗宁保护组(10只)和肝得健保护组(10只)。正常组按正常饲养，模型组、硫普罗宁、肝得健组均按10 ml/kg，分别灌生理盐水、硫普罗宁及肝得健，bid，共3 d。并分别于灌胃次日腹腔注射 D-GalN 800 mg/kg，40 h后处死。
3 标本采集及检测
3.1 血清丙氨酸转氨酶活性的检测(ALT) 注射D-GalN 40 h后，快速断头采血，分离血清，采用赖氏法测定。
3.2 血清TNF-α的测定 采用双抗体夹心法。用军事医学科学院提供的试剂盒测定。
3.3 血清IL-6和IL-8水平的测定 分别采用北京邦定生物医学公司提供的试剂盒测定。
3.4 病理标本的处理 病理组织学标本用福尔马林固定，石蜡包埋包片，HE染色。电镜标本用25 g/L戊 二醛磷酸缓冲液预固定，2 h后用锇酸缓冲液作后固定，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋切片，电镜下观察。
, 百拇医药
结 果
1 血清ALT及TNF-α的检测
见表1。
表1 各组大鼠血清ALT活性及TNF-α含量的检测(
±s) 组 别
n
ALT(nmol/s)
TNF-α(μg/L)
正常组
5
573.4±183.4
, 百拇医药 0.22±0.10
模型组
10
2442.2±445.1a
8.07±1.93a
硫普罗宁组
10
1097.3±374.6b
0.60±0.32b
肝得健组
10
, http://www.100md.com
1236.9±346.7bc
0.76±0.35bc
a:P<0.01与正常组比较；b:P<0.01 与模型组比较；c:P>0.05硫普罗宁与肝得健组间比较(下表同)2 血清IL-6和IL-8水平的检测
结果见表2。
表2 各组大鼠血清IL-6和IL-8水平的检测(±s) 组别
n
IL-6(ng/ml)
IL-8(ng/ml)
, http://www.100md.com
正常组
5
0.11±0.04
0.63±0.14
模型组
10
2.56±0.87a
5.78±2.12a
硫普罗宁组
10
0.58±0.18b
1.32±0.67b
, http://www.100md.com
肝得健组
10
0.48±0.11bc
1.14±0.57bc
3 光镜观察
模型组肝小叶结构破坏，可见明显淤血，肝细胞明显肿胀，胞浆疏松，肝细胞核大小不一，核内染色质聚集，嗜酸性小体和点状坏死多见，坏死处可见炎性细胞浸润和枯否细胞增生活跃。硫普罗宁组和肝得健组所见病变较模型组明显减轻，肝小叶结构正常，细胞索排列整齐，肝内瘀血明显减轻，可见少许点状坏死，未见嗜酸性小体和灶状坏死。
4 电镜观察
模型组可见肝细胞弥漫性肿胀，细胞核不规则，染色质凝集，线粒体肿胀，粗面内质网排列不规则，脱颗粒，糖原减少，溶酶体及脂滴增多，部分区域肝细胞可见坏死改变：细胞膜破裂，肿胀变性的细胞器微游离于细胞外。硫普罗宁组和肝得健组所见病变较模型组明显减轻，肝细胞有轻度肿胀，核形态规则，线粒体轻度肿胀，部分内质网轻度扩张，糖原颗粒减少，细胞膜完整。 讨 论
, 百拇医药
本实验结果显示TNF-α水平与转氨酶变化呈正相关，转氨酶升高者，TNF-α 的水平也显著升高。从肝病理形态学的研究中发现，模型组的肝组织可见炎性细胞浸润及枯否细胞活跃增生，此为TNF-α产生的基础，肝脏内大量生成的TNF-α可直接作用于肝细胞造成急性坏死和急性炎症，同时TNF-α引发的中性粒细胞通过释放蛋白酶或氧自由基也可造成肝损害[1，2]。
IL-6和IL-8主要是由单核巨噬细胞产生的细胞因子。内皮细胞、成纤维细胞、多形核白细胞和肝细胞在TNF-α的诱导下也能产生IL-6和IL-8。这些细胞因子共同作用于肝细胞，参与急性期反应。血清IL-6和IL-8水平的升高，一方面可能是血清和肝组织内TNF-α水平的增加，促进了IL-8的产生，另一方面也可能是肝组织内的炎症反应，直接影响IL-8的合成。IL-8有显著的中性粒细胞趋化作用，并能诱导其发生变形、脱颗粒和溶酶体酶释放反应，其释放出的蛋白酶能直接损害肝细胞。本研究也提示TNF-α、IL-6和IL-8等多种细胞因子在D-氨基半乳糖所致的肝损害中起着一定的作用[3～5]。
, 百拇医药
硫普罗宁是一种巯基丙酸的衍生物，它可替代谷胱甘肽作为巯基的供体。Torrilli等[6]的研究表明该药可调节机体的体液和细胞免疫，通过对细胞能量代谢的调节，并作为膜的稳定剂而对肝细胞起到保护作用。我们的研究发现，硫普罗宁可以明显降低血清ALT活性，减少TNF-α、IL-6和IL-8等急性反应期细胞因子的产生。其对肝细胞的保护作用，一方面是通过降低TNF-α、IL-6和IL-8等细胞因子的生成和释放；或直接拮抗TNF-α等细胞因子的致肝损害作用，另外，也可通过对肝细胞膜结构完整性的保护，从而减轻肝脏的损害。我们通过对急性肝损害大鼠肝脏的酶组织化学的研究也证实，硫普罗宁可提高肝脏合成蛋白的能力，加强肝脏的储备功能，对溶酶体膜的通透性也有一定的稳定作用[7]。
参考文献
1 冯学胜，汤钊猷.肿瘤坏死因子与肝病.国外医学消化系疾病分册，1994，14(4)∶207
, 百拇医药
2 Cornell RP.Acute phase responses after acute liver injury by partial hepatectomy in rats as indicators of cytokine release.Hepatology,1990,11(6)∶923
3 Bac-DJ,Pruimboom WM,Mulder PG,et al.High interleukin-6 production within the peritoneal cavity in decompensated cirrhosis and malignancy-related ascites .Liver, 1995,15(5)∶265
4 Sheron N,Williams R.IL-8 as a circulating cytokine:induction by recombinant tumor necrosis factor alpha.Clin Exp Immunol,1992,89(1)∶100
, 百拇医药
5 王新，许才钹，赵国宁，等.慢性肝病患者血清白细胞介素-8的检测及意义.中国实用内科杂志，1996，6(1)∶29
6 Ichida F,Shibasaki K, Takino T,et al. Therapeutic effects of tiopronin on chronic hepatitis:a double-blind clincal study.J Int Med Res,1982,10∶325
7 唐望先，杜荔菁，张文英，等.硫普罗宁对D-氨基半乳糖所致肝损害保护作用.中华肝脏病杂志，1997，5(1)∶52
(收稿：1997—07—08 修回：1998—03—02), 百拇医药
单位：(同济医科大学附属同济医院肝病研究所，武汉430030)
关键词：硫普罗宁；肝损害；细胞因子
中国新药杂志980624 摘要 目的：用D-氨基半乳糖(D-GalN)制备大鼠急性肝损伤模型。方法：通过检测血清ALT及各种细胞因子包括：肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素8(IL-8)浓度的变化，并观察光镜和电镜下肝组织的病理改变，以探讨硫普罗宁对急性肝损害的保护作用。结果：模型组ALT、TNF-α、IL-6及IL-8显著升高；而硫普罗宁组ALT及以上各细胞因子的水平均较模型明显降低(P<0.01) 。结论：硫普罗宁可能通过免疫机制的调节，降低TNF-α、IL-6及IL-8等细胞因子的生成和释放，而对肝细胞的损伤呈现一定的保护作用。
EXPERIMENTAL STUDY ON THE EFFECT OF TIOPRONIN IN PROTECTION OF
, 百拇医药
ACUTE LIVER INJURY IN RATS
Du Lijing,Tang Wangxian, Zhang Wenying, et al.
(Institute of Liver Disease, Tongji Hospital,Tongji Medical
University Medical Sciences,Wuhan 430030)
ABSTRACT OBJECTIVE：To explore the effect of tiopronin in protection of acute liver injury in rats.METHODS:Acute liver injury model in rats was induced by D-galactosamine,and the serum level of cytokines determined in conjunction with microscopic and electron microscopic observations on pathological changes in liver were used to evaluate the liver protection effect of tiopronin.RESULTS:The serum concentration of cytokines,such as ALT,TNF-α,IL-6,and IL-8,in active and control groups were obtained,and the level of cytokines in active group were significantly reduced in comparation with those of control group.CONCLUSION:It can be concluded that tiopronin possesses obvious protection effect on acute liver injury in rats model in terms of inhibition of TNF-α,IL-6 and IL-8 .
, 百拇医药
KEY WORDS Tiopronin;Liver injury;Cytokine
材料与方法
1 实验材料
SD大鼠35只，雌雄各半，体重220～250 g，由本校实验动物中心提供。
D-GalN由重庆医科大学提供。临用前配制成800 mg/kg的生理盐水溶液。
硫普罗宁由湖北省医药工业研究所提供，实验前配成37 mg/ml。
肝得健胶囊：系德国Rhone-Poulenc Rorer公司生产，批号为41009200，实验前配成50 mg/ml的溶液灌胃。
2 实验动物分组及处理方法
, http://www.100md.com
实验动物随机分4组：正常对照组(5只)、模型组(10只)、硫普罗宁保护组(10只)和肝得健保护组(10只)。正常组按正常饲养，模型组、硫普罗宁、肝得健组均按10 ml/kg，分别灌生理盐水、硫普罗宁及肝得健，bid，共3 d。并分别于灌胃次日腹腔注射 D-GalN 800 mg/kg，40 h后处死。
3 标本采集及检测
3.1 血清丙氨酸转氨酶活性的检测(ALT) 注射D-GalN 40 h后，快速断头采血，分离血清，采用赖氏法测定。
3.2 血清TNF-α的测定 采用双抗体夹心法。用军事医学科学院提供的试剂盒测定。
3.3 血清IL-6和IL-8水平的测定 分别采用北京邦定生物医学公司提供的试剂盒测定。
3.4 病理标本的处理 病理组织学标本用福尔马林固定，石蜡包埋包片，HE染色。电镜标本用25 g/L戊 二醛磷酸缓冲液预固定，2 h后用锇酸缓冲液作后固定，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋切片，电镜下观察。
, 百拇医药
结 果
1 血清ALT及TNF-α的检测
见表1。
表1 各组大鼠血清ALT活性及TNF-α含量的检测(
±s) 组 别n
ALT(nmol/s)
TNF-α(μg/L)
正常组
5
573.4±183.4
, 百拇医药 0.22±0.10
模型组
10
2442.2±445.1a
8.07±1.93a
硫普罗宁组
10
1097.3±374.6b
0.60±0.32b
肝得健组
10
, http://www.100md.com
1236.9±346.7bc
0.76±0.35bc
a:P<0.01与正常组比较；b:P<0.01 与模型组比较；c:P>0.05硫普罗宁与肝得健组间比较(下表同)2 血清IL-6和IL-8水平的检测
结果见表2。
表2 各组大鼠血清IL-6和IL-8水平的检测(
±s) 组别n
IL-6(ng/ml)
IL-8(ng/ml)
, http://www.100md.com
正常组
5
0.11±0.04
0.63±0.14
模型组
10
2.56±0.87a
5.78±2.12a
硫普罗宁组
10
0.58±0.18b
1.32±0.67b
, http://www.100md.com
肝得健组
10
0.48±0.11bc
1.14±0.57bc
3 光镜观察
模型组肝小叶结构破坏，可见明显淤血，肝细胞明显肿胀，胞浆疏松，肝细胞核大小不一，核内染色质聚集，嗜酸性小体和点状坏死多见，坏死处可见炎性细胞浸润和枯否细胞增生活跃。硫普罗宁组和肝得健组所见病变较模型组明显减轻，肝小叶结构正常，细胞索排列整齐，肝内瘀血明显减轻，可见少许点状坏死，未见嗜酸性小体和灶状坏死。
4 电镜观察
模型组可见肝细胞弥漫性肿胀，细胞核不规则，染色质凝集，线粒体肿胀，粗面内质网排列不规则，脱颗粒，糖原减少，溶酶体及脂滴增多，部分区域肝细胞可见坏死改变：细胞膜破裂，肿胀变性的细胞器微游离于细胞外。硫普罗宁组和肝得健组所见病变较模型组明显减轻，肝细胞有轻度肿胀，核形态规则，线粒体轻度肿胀，部分内质网轻度扩张，糖原颗粒减少，细胞膜完整。 讨 论
, 百拇医药
本实验结果显示TNF-α水平与转氨酶变化呈正相关，转氨酶升高者，TNF-α 的水平也显著升高。从肝病理形态学的研究中发现，模型组的肝组织可见炎性细胞浸润及枯否细胞活跃增生，此为TNF-α产生的基础，肝脏内大量生成的TNF-α可直接作用于肝细胞造成急性坏死和急性炎症，同时TNF-α引发的中性粒细胞通过释放蛋白酶或氧自由基也可造成肝损害[1，2]。
IL-6和IL-8主要是由单核巨噬细胞产生的细胞因子。内皮细胞、成纤维细胞、多形核白细胞和肝细胞在TNF-α的诱导下也能产生IL-6和IL-8。这些细胞因子共同作用于肝细胞，参与急性期反应。血清IL-6和IL-8水平的升高，一方面可能是血清和肝组织内TNF-α水平的增加，促进了IL-8的产生，另一方面也可能是肝组织内的炎症反应，直接影响IL-8的合成。IL-8有显著的中性粒细胞趋化作用，并能诱导其发生变形、脱颗粒和溶酶体酶释放反应，其释放出的蛋白酶能直接损害肝细胞。本研究也提示TNF-α、IL-6和IL-8等多种细胞因子在D-氨基半乳糖所致的肝损害中起着一定的作用[3～5]。
, 百拇医药
硫普罗宁是一种巯基丙酸的衍生物，它可替代谷胱甘肽作为巯基的供体。Torrilli等[6]的研究表明该药可调节机体的体液和细胞免疫，通过对细胞能量代谢的调节，并作为膜的稳定剂而对肝细胞起到保护作用。我们的研究发现，硫普罗宁可以明显降低血清ALT活性，减少TNF-α、IL-6和IL-8等急性反应期细胞因子的产生。其对肝细胞的保护作用，一方面是通过降低TNF-α、IL-6和IL-8等细胞因子的生成和释放；或直接拮抗TNF-α等细胞因子的致肝损害作用，另外，也可通过对肝细胞膜结构完整性的保护，从而减轻肝脏的损害。我们通过对急性肝损害大鼠肝脏的酶组织化学的研究也证实，硫普罗宁可提高肝脏合成蛋白的能力，加强肝脏的储备功能，对溶酶体膜的通透性也有一定的稳定作用[7]。
参考文献
1 冯学胜，汤钊猷.肿瘤坏死因子与肝病.国外医学消化系疾病分册，1994，14(4)∶207
, 百拇医药
2 Cornell RP.Acute phase responses after acute liver injury by partial hepatectomy in rats as indicators of cytokine release.Hepatology,1990,11(6)∶923
3 Bac-DJ,Pruimboom WM,Mulder PG,et al.High interleukin-6 production within the peritoneal cavity in decompensated cirrhosis and malignancy-related ascites .Liver, 1995,15(5)∶265
4 Sheron N,Williams R.IL-8 as a circulating cytokine:induction by recombinant tumor necrosis factor alpha.Clin Exp Immunol,1992,89(1)∶100
, 百拇医药
5 王新，许才钹，赵国宁，等.慢性肝病患者血清白细胞介素-8的检测及意义.中国实用内科杂志，1996，6(1)∶29
6 Ichida F,Shibasaki K, Takino T,et al. Therapeutic effects of tiopronin on chronic hepatitis:a double-blind clincal study.J Int Med Res,1982,10∶325
7 唐望先，杜荔菁，张文英，等.硫普罗宁对D-氨基半乳糖所致肝损害保护作用.中华肝脏病杂志，1997，5(1)∶52
(收稿：1997—07—08 修回：1998—03—02), 百拇医药