东菱精纯克栓酶对癌细胞裸鼠体内增殖能力的影响
作者：黄 剑 梁清华 唐慰萍 邓惠华
单位：(广东医学院病理学教研室，湛江 524023)
关键词：东菱精纯克栓酶；鼻咽癌；胃癌；DNA含量；增殖细胞核抗原
东菱精纯克栓酶对癌细胞裸鼠 体内增殖能力的影响 摘要 目的：观察东菱精纯克栓酶(DF-521)对裸鼠体内人胃癌及鼻咽癌细胞增殖能力的影响。方法：用免疫组织细胞化学及图像分析定量的方法，研究DF-521处理组和对照组之间，裸鼠移植瘤癌细胞DNA含量及增殖细胞核抗原(PCNA)表达的差异。结果：胃癌处理组，癌细胞的DNA含量及PCNA表达均明显低于对照组(P<0.01)；鼻咽癌处理组，癌细胞DNA含量及PCNA表达和对照组之间无明显差异(P>0.05)。结论：DF-521对裸鼠体内人胃癌细胞的增殖能力有明显的抑制作用，而对人鼻咽癌细胞的抑制作用不明显。
QUANTITATIVE STUDY OF BATROXOBIN EFFECTS ON THE
, 百拇医药
PROLIFERATION ABILITY OF HUMAN CARCINOMA CELLS IN NUDE MICE
Huang Jian,Liang Qinghua,Tang Weiping,et al.
(Department of Pathology, Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023)
ABSTRACT OBJECTIVE：To observe batroxobin effects on the proliferation ability of human gastric carcinoma(GC)cells and human nasopharyngeal carcinoma(NPC)cells in nude mice.METHODS:By using immunohistochemistry and computer image analysis system,the DNA content and the proliferating cell nuclear antigen(PCNA) of human carcinoma cells in nude mice were determined and the DNA content and PCNA differences in active and control groups were revealed.RESULTS:The DNA content and PCNA of GC cells are markedly lower in batroxobin group in comparison with control group (P<0.01) and no significant difference in NPC cells(P>0.05)between groups were observed.CONCLUSION:These results suggested that the proliferation ability of human GC cells in nude mice was significantly inhibited by batroxobin but the human NPC cells was not significantly affected by the agent.
, 百拇医药
KEY WORDS Batroxobin; Nasopharyngeal carcinoma; Gastric carcinoma;DNA content;Proliferating cell nuclear antigen
东菱精纯克栓酶(batroxobin,Defibrase,DF-521)能选择性地溶解血中的纤维蛋白原，使其形成纤维蛋白单体，降低血液粘度，改善微循环，在临床上已广泛用于心脑血管疾病的治疗，并取得明显的疗效[1～4]。但该药在抗肿瘤方面的作用笔者尚未见研究报道。本研究旨在研究DF-521对人鼻咽癌和胃癌细胞裸鼠体内增殖能力的影响，探讨其对人鼻咽癌和胃癌细胞增殖能力可能的抑制机制，希望能为该药早日在临床应用于抗肿瘤治疗提供必要的实验依据。
材料和方法
1 实验动物NIH系裸小鼠，鼠龄4～8个月，体重20～25 g，雌雄兼用。饲养繁殖于本室SPF环境中。
, http://www.100md.com
2 肿瘤细胞
人胃低分化粘液腺癌细胞系(MGC-803)的克隆株(c-11)，人低分化鼻咽癌克隆株CNE-2Z-H5，均由本室细胞室提供。
3 实验分组
分为鼻咽癌克栓酶治疗组、对照组；胃癌克栓酶治疗组、对照组，每组12只裸鼠。
4 癌细胞移植方法
复苏的癌细胞传代培养5 d后，用胰酶与EDTA混合液消化，制成细胞悬液，每只裸鼠以1×106/0.3 ml细胞数，按无菌操作的要求，直接穿刺注射于裸鼠近前腋处皮下。
5 给药方法
本实验中所采用的DF-521由日本东菱药品工业株式会社提供。由鼻咽癌实验组动物在实验前1周开始腹腔注射给药，给药2次/周，给药量为每次每只裸鼠0.7BU(相当30～35BU/kg)，每只裸鼠用生理盐水稀释为0.2 ml后注射。
, 百拇医药
6 增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色及全自动图像分析处理
各组取4例移植瘤组织，按S-P法进行染色，PCNA单抗及S-P试剂盒为美国ZYMED公司产品。染色流程按试剂盒说明书进行。细胞核染成棕黄色即为阳性，每例在高倍视野随机取100个阳性细胞，每组共取400个阳性细胞，用摄像枪将图像摄入电脑中储存，待各组图像均摄入完毕后，进行全自动图像分析，算出各组的积分光密度均值，并将其作为PCNA的相对含量，以任意单位(AU)表示。比较各组积分光密度均值的差异，进行t检验，算出P值，此过程由全自动图像分析仪自动完成。图像分析系统为同济医科大学清平影像工程公司开发的MPIAS-500型多媒体彩色病理图文分析系统。
7 肿瘤组织的DNA染色及全自动图像分析处理
每组取4例移植瘤组织，每例在高倍视野随机取100个DNA阳性细胞进行全自动图像分析，DNA染色按常规Feulgen染色方法进行。图像分析方法同PCNA的处理方法。
, 百拇医药
8 统计学处理
各项指标差异的显著性检验用POMS医学统计学程序处理。
结果
DF-521对人胃癌及鼻咽癌裸鼠移植瘤PCNA和DNA含量影响的定量结果见表1。
表1 人胃癌及鼻咽癌裸鼠移植瘤PCNA和DNA含量的表达(
±s)
组 别
细胞总数
PCNA含量(AU)
, 百拇医药
DNA含量(AU)
胃癌对照组
400
3.12±0.78
6.53±2.17
胃癌治疗组
400
0.84±0.06a
1.59±0.56a
鼻咽癌对照组
400
2.43±0.51
, http://www.100md.com
5.13±1.68
鼻咽癌治疗组
400
2.28±0.27b
4.88±1.36b
与对照组比较a：P<0.01；b：P>0.05
DF-521对人胃癌裸鼠移植瘤癌细胞的PCNA及DNA含量均有极为明显的抑制作用；而对人鼻咽癌裸鼠移植瘤癌细胞的PCNA及DNA含量均无明显的抑制作用。 讨论
肿瘤细胞的PCNA及DNA含量是反映肿瘤细胞增殖能力强弱的常用指标之一，用图像分析仪对该指标进行定量研究，更是近年来广泛采用的、用于肿瘤研究领域的重要方法，该方法能较准确地测定肿瘤细胞的增殖状态[5～7]。恶性肿瘤的增殖是其最基本的生物学特性之一，受肿瘤细胞本身和周围微环境等诸多因素影响，而肿瘤细胞周围微环境是维持其增殖的重要外部因素。研究表明：肿瘤患者血液处于高凝状态，血液中纤维蛋白原的含量增高，可导致肿瘤间质中纤维蛋白的的含量增高，纤维蛋白原是肿瘤细胞外基质的重要成分，是肿瘤细胞微环境的物质基础，其含量增加有助于肿瘤间质新生毛细血管及纤维母细胞的形成，从而促进肿瘤的生长和增殖[8～10]。
, 百拇医药
DF-521能选择性地溶解血中的纤维蛋白原，使其形成纤维蛋白单体，降低血液粘度，改善微循环，从而降低肿瘤细胞外基质中纤维蛋白原的含量，抑制肿瘤间质新生毛细血管及纤维母细胞的形成，达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。本实验结果显示：DF-521对裸鼠体内胃癌细胞的PCNA及DNA含量有明显的抑制作用，表明其能有效抑制胃癌细胞在裸鼠体内的增殖能力；而对裸鼠体内鼻咽癌细胞增殖能力的抑制作用不明显，导致这种差异的原因可能和这两种恶性肿癌细胞株的特性不同有关，黄剑等[11]已证实该胃癌细胞株是一具有高血道转移趋向的细胞株，而该鼻咽癌细胞株则为高淋巴道转移趋向的细胞株，这一结果亦可提示，DF-521可能更适用于发生血道转移恶性肿瘤的治疗。
参考文献
[1] Dascombe WH,Dumanian G,Hong C, et al.Application of thrombin based fibrin glue and non-thrombin based batroxobin glue on intact human blood vessels:evidence for transmural thrombin activity.Thromb Haemost,1997,78(2)∶947
, 百拇医药
[2] Tomaru T,Fujimori Y,Morita T,et al.Local delivery of antithrombotic drug prevents restenosis after balloon angioplasty in atherosclerotic rabbit artery. Jpn Circ J,1996,60(12)∶981
[3] Inoue A,Koh CS,Shimada K,et al.Suppression of cell-transferred experimental autoimmune encephalomyelitis in defibrinated Lewis rats.J Neuroimmunol,1996,71(1-2)∶131
[4] Yu S,Kuang P,Kanazawa T,et al.Batroxobin accelerates lipid accumulation of peroxidized low density lipoprotein in mouse peritoneal macrophages.Pathobiology,1996,64(5)∶275
, http://www.100md.com
[5] Faccioli S,Cavicchi O,Caliceti U,et al.Cell proliferation as an independent predictor of survival for patients with advanced nasopharyngeal carcinoma.Mod Patho,1997,10(9)∶884
[6] Bellotti M,Elsner B,Kahn A,et al.Morphometric determination of AgNORs in breast carcinoma.Correlation with flow cytometry and proliferating cell nuclear antigen.Anal Quant Cytol Histol,1997,19(2)∶139
[7] Veltri RW,Partin AW,Epstein JE,et al.Quantitative nuclear morphometry,Markovian texture descriptors,and DNA content captured on a CAS-200 image analysis system,combined with PCNA and HER-2/neu immunohistochemistry for prediction of prostate cancer progression. J Cell Biochem,1994,19∶249
, http://www.100md.com
[8] Sevick EM,Jain RK.Viscous resistance to blood flow in solid tumors:effect of hematocrit on intratumor blood viscosity.Cancer Res,1989,49(13)∶3513
[9] Miller B,Heilmann L.Hemorheological parameters in patients with gynecologic malignancies.Gynecol Oncol,1989,33(2)∶177
[10] Sporn LA, Bunce LA,Francis CW.Cell proliferation on fibrin:modulation by fibrinopeptide cleavage.Blood,1995,86(5)∶1802
[11] 黄剑，唐慰萍，邓惠华，等.鼻咽癌细胞裸鼠体内传代中转移及增殖动力学研究.临床与实验病理杂志，1997，13(3)∶254
(收稿：1998-02-04 修回：1998-10-14), http://www.100md.com
单位：(广东医学院病理学教研室，湛江 524023)
关键词：东菱精纯克栓酶；鼻咽癌；胃癌；DNA含量；增殖细胞核抗原
东菱精纯克栓酶对癌细胞裸鼠 体内增殖能力的影响 摘要 目的：观察东菱精纯克栓酶(DF-521)对裸鼠体内人胃癌及鼻咽癌细胞增殖能力的影响。方法：用免疫组织细胞化学及图像分析定量的方法，研究DF-521处理组和对照组之间，裸鼠移植瘤癌细胞DNA含量及增殖细胞核抗原(PCNA)表达的差异。结果：胃癌处理组，癌细胞的DNA含量及PCNA表达均明显低于对照组(P<0.01)；鼻咽癌处理组，癌细胞DNA含量及PCNA表达和对照组之间无明显差异(P>0.05)。结论：DF-521对裸鼠体内人胃癌细胞的增殖能力有明显的抑制作用，而对人鼻咽癌细胞的抑制作用不明显。
QUANTITATIVE STUDY OF BATROXOBIN EFFECTS ON THE
, 百拇医药
PROLIFERATION ABILITY OF HUMAN CARCINOMA CELLS IN NUDE MICE
Huang Jian,Liang Qinghua,Tang Weiping,et al.
(Department of Pathology, Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023)
ABSTRACT OBJECTIVE：To observe batroxobin effects on the proliferation ability of human gastric carcinoma(GC)cells and human nasopharyngeal carcinoma(NPC)cells in nude mice.METHODS:By using immunohistochemistry and computer image analysis system,the DNA content and the proliferating cell nuclear antigen(PCNA) of human carcinoma cells in nude mice were determined and the DNA content and PCNA differences in active and control groups were revealed.RESULTS:The DNA content and PCNA of GC cells are markedly lower in batroxobin group in comparison with control group (P<0.01) and no significant difference in NPC cells(P>0.05)between groups were observed.CONCLUSION:These results suggested that the proliferation ability of human GC cells in nude mice was significantly inhibited by batroxobin but the human NPC cells was not significantly affected by the agent.
, 百拇医药
KEY WORDS Batroxobin; Nasopharyngeal carcinoma; Gastric carcinoma;DNA content;Proliferating cell nuclear antigen
东菱精纯克栓酶(batroxobin,Defibrase,DF-521)能选择性地溶解血中的纤维蛋白原，使其形成纤维蛋白单体，降低血液粘度，改善微循环，在临床上已广泛用于心脑血管疾病的治疗，并取得明显的疗效[1～4]。但该药在抗肿瘤方面的作用笔者尚未见研究报道。本研究旨在研究DF-521对人鼻咽癌和胃癌细胞裸鼠体内增殖能力的影响，探讨其对人鼻咽癌和胃癌细胞增殖能力可能的抑制机制，希望能为该药早日在临床应用于抗肿瘤治疗提供必要的实验依据。
材料和方法
1 实验动物NIH系裸小鼠，鼠龄4～8个月，体重20～25 g，雌雄兼用。饲养繁殖于本室SPF环境中。
, http://www.100md.com
2 肿瘤细胞
人胃低分化粘液腺癌细胞系(MGC-803)的克隆株(c-11)，人低分化鼻咽癌克隆株CNE-2Z-H5，均由本室细胞室提供。
3 实验分组
分为鼻咽癌克栓酶治疗组、对照组；胃癌克栓酶治疗组、对照组，每组12只裸鼠。
4 癌细胞移植方法
复苏的癌细胞传代培养5 d后，用胰酶与EDTA混合液消化，制成细胞悬液，每只裸鼠以1×106/0.3 ml细胞数，按无菌操作的要求，直接穿刺注射于裸鼠近前腋处皮下。
5 给药方法
本实验中所采用的DF-521由日本东菱药品工业株式会社提供。由鼻咽癌实验组动物在实验前1周开始腹腔注射给药，给药2次/周，给药量为每次每只裸鼠0.7BU(相当30～35BU/kg)，每只裸鼠用生理盐水稀释为0.2 ml后注射。
, 百拇医药
6 增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色及全自动图像分析处理
各组取4例移植瘤组织，按S-P法进行染色，PCNA单抗及S-P试剂盒为美国ZYMED公司产品。染色流程按试剂盒说明书进行。细胞核染成棕黄色即为阳性，每例在高倍视野随机取100个阳性细胞，每组共取400个阳性细胞，用摄像枪将图像摄入电脑中储存，待各组图像均摄入完毕后，进行全自动图像分析，算出各组的积分光密度均值，并将其作为PCNA的相对含量，以任意单位(AU)表示。比较各组积分光密度均值的差异，进行t检验，算出P值，此过程由全自动图像分析仪自动完成。图像分析系统为同济医科大学清平影像工程公司开发的MPIAS-500型多媒体彩色病理图文分析系统。
7 肿瘤组织的DNA染色及全自动图像分析处理
每组取4例移植瘤组织，每例在高倍视野随机取100个DNA阳性细胞进行全自动图像分析，DNA染色按常规Feulgen染色方法进行。图像分析方法同PCNA的处理方法。
, 百拇医药
8 统计学处理
各项指标差异的显著性检验用POMS医学统计学程序处理。
结果
DF-521对人胃癌及鼻咽癌裸鼠移植瘤PCNA和DNA含量影响的定量结果见表1。
表1 人胃癌及鼻咽癌裸鼠移植瘤PCNA和DNA含量的表达(
±s)组 别
细胞总数
PCNA含量(AU)
, 百拇医药
DNA含量(AU)
胃癌对照组
400
3.12±0.78
6.53±2.17
胃癌治疗组
400
0.84±0.06a
1.59±0.56a
鼻咽癌对照组
400
2.43±0.51
, http://www.100md.com
5.13±1.68
鼻咽癌治疗组
400
2.28±0.27b
4.88±1.36b
与对照组比较a：P<0.01；b：P>0.05
DF-521对人胃癌裸鼠移植瘤癌细胞的PCNA及DNA含量均有极为明显的抑制作用；而对人鼻咽癌裸鼠移植瘤癌细胞的PCNA及DNA含量均无明显的抑制作用。 讨论
肿瘤细胞的PCNA及DNA含量是反映肿瘤细胞增殖能力强弱的常用指标之一，用图像分析仪对该指标进行定量研究，更是近年来广泛采用的、用于肿瘤研究领域的重要方法，该方法能较准确地测定肿瘤细胞的增殖状态[5～7]。恶性肿瘤的增殖是其最基本的生物学特性之一，受肿瘤细胞本身和周围微环境等诸多因素影响，而肿瘤细胞周围微环境是维持其增殖的重要外部因素。研究表明：肿瘤患者血液处于高凝状态，血液中纤维蛋白原的含量增高，可导致肿瘤间质中纤维蛋白的的含量增高，纤维蛋白原是肿瘤细胞外基质的重要成分，是肿瘤细胞微环境的物质基础，其含量增加有助于肿瘤间质新生毛细血管及纤维母细胞的形成，从而促进肿瘤的生长和增殖[8～10]。
, 百拇医药
DF-521能选择性地溶解血中的纤维蛋白原，使其形成纤维蛋白单体，降低血液粘度，改善微循环，从而降低肿瘤细胞外基质中纤维蛋白原的含量，抑制肿瘤间质新生毛细血管及纤维母细胞的形成，达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。本实验结果显示：DF-521对裸鼠体内胃癌细胞的PCNA及DNA含量有明显的抑制作用，表明其能有效抑制胃癌细胞在裸鼠体内的增殖能力；而对裸鼠体内鼻咽癌细胞增殖能力的抑制作用不明显，导致这种差异的原因可能和这两种恶性肿癌细胞株的特性不同有关，黄剑等[11]已证实该胃癌细胞株是一具有高血道转移趋向的细胞株，而该鼻咽癌细胞株则为高淋巴道转移趋向的细胞株，这一结果亦可提示，DF-521可能更适用于发生血道转移恶性肿瘤的治疗。
参考文献
[1] Dascombe WH,Dumanian G,Hong C, et al.Application of thrombin based fibrin glue and non-thrombin based batroxobin glue on intact human blood vessels:evidence for transmural thrombin activity.Thromb Haemost,1997,78(2)∶947
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[2] Tomaru T,Fujimori Y,Morita T,et al.Local delivery of antithrombotic drug prevents restenosis after balloon angioplasty in atherosclerotic rabbit artery. Jpn Circ J,1996,60(12)∶981
[3] Inoue A,Koh CS,Shimada K,et al.Suppression of cell-transferred experimental autoimmune encephalomyelitis in defibrinated Lewis rats.J Neuroimmunol,1996,71(1-2)∶131
[4] Yu S,Kuang P,Kanazawa T,et al.Batroxobin accelerates lipid accumulation of peroxidized low density lipoprotein in mouse peritoneal macrophages.Pathobiology,1996,64(5)∶275
, http://www.100md.com
[5] Faccioli S,Cavicchi O,Caliceti U,et al.Cell proliferation as an independent predictor of survival for patients with advanced nasopharyngeal carcinoma.Mod Patho,1997,10(9)∶884
[6] Bellotti M,Elsner B,Kahn A,et al.Morphometric determination of AgNORs in breast carcinoma.Correlation with flow cytometry and proliferating cell nuclear antigen.Anal Quant Cytol Histol,1997,19(2)∶139
[7] Veltri RW,Partin AW,Epstein JE,et al.Quantitative nuclear morphometry,Markovian texture descriptors,and DNA content captured on a CAS-200 image analysis system,combined with PCNA and HER-2/neu immunohistochemistry for prediction of prostate cancer progression. J Cell Biochem,1994,19∶249
, http://www.100md.com
[8] Sevick EM,Jain RK.Viscous resistance to blood flow in solid tumors:effect of hematocrit on intratumor blood viscosity.Cancer Res,1989,49(13)∶3513
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[10] Sporn LA, Bunce LA,Francis CW.Cell proliferation on fibrin:modulation by fibrinopeptide cleavage.Blood,1995,86(5)∶1802
[11] 黄剑，唐慰萍，邓惠华，等.鼻咽癌细胞裸鼠体内传代中转移及增殖动力学研究.临床与实验病理杂志，1997，13(3)∶254
(收稿：1998-02-04 修回：1998-10-14), http://www.100md.com