川芎嗪、苦参碱对癌细胞与内皮细胞粘附及粘附因子表达的影响
作者：林洪生 李树奇 裴迎霞 祁 鑫 李攻戍 朴炳奎
单位：(中国中医研究院广安门医院，北京 100053)
关键词：肿瘤细胞粘附因子；活体外研究；中药；川芎嗪；苦参碱
中国新药杂志990609
摘要 目的：研究中药抗肿瘤转移机理。方法：采用川芎嗪、苦参碱对肿瘤细胞与内皮细胞粘附及粘附因子表达和对内皮细胞通透性影响进行研究。结果：中药对肿瘤细胞与内皮细胞的粘附具有明显的抑制作用，并可明显抑制CD44、CD49粘附因子的表达，还可以减轻内皮细胞的通透性，保护内皮细胞的完整，阻断肿瘤细胞与基质的粘附，从而减少了肿瘤转移的形成。结论：川芎嗪、苦参碱抑制肿瘤细胞与内皮细胞的粘附，抑制粘附因子的表达，减轻内皮细胞的通透性，减轻肿瘤转移。
EFFECTS OF ACTIVE COMPONENTS TO TWO TRADITIONAL CHINESE MEDICINAL HERBS,CHUANQIONGQIN & KUSHENJIAN, ON THE ADHESION OF ENDOTHELIOCYTES TO
, 百拇医药
CANCER CELL LINE(PG),ADHESION MELECULE AND PERMEABILITY OF
ENDOTHELIOCYTES IN VITRO
Lin Hongsheng,Li Shuqi,Pei Yingxia,et al.
(Guang An Men Hospital,Chinese Academy of Traditional Chinese Medicine,Beijing 111053)
ABSTRACT OBJECTIVE:To explore the inhibition effects of two TCM herbs on the mechanism of metastasis of cancer cell.METHODS:The active components of two TCM herbs,Chuannqiongqin and Kushenjian were tested in the culture of metastatic lung cancer cell line(PG),and observe the adhesion of endotheliocytes(EC) to PG,adhesion molecule and permeability of endotheliocytes.RESULTS:Data revealed that the active components of two TCM herbs inhibited the adhesion of EC to PG,regulated the expression of CD44,CD49,and reduced the permeability of EC.CONCLUSION: In vitro study shows that through the inhibition of adhesion of EC to PG,expression of adhesion of molecules,and permeability of EC,Chuanqiongqin & Kushenjian may inhibit the metastasis of cancer cells.
, 百拇医药
KEY WORDS Adhesion of endotheliocytes to cancer cell; In vitro study;TCM; Chuangqiong-qin;Kushenjian
研究认为肿瘤转移与癌细胞同内皮细胞的粘附、粘附因子的表达和穿透密切相关[1]。在肿瘤转移过程中,粘附因子十分重要，有报道认为CD44、CD49(细胞粘附因子)在肿瘤转移中扮演重要的角色[2]。肿瘤血行转移的关键步骤之一是血液中的癌细胞栓子附着在内皮上，血小板释放凝集素，使肿瘤细胞与内皮细胞粘附，血管内皮细胞收缩变圆，细胞连接间出现间隙，内皮层通透性增高，肿瘤细胞穿透血管壁，进入组织，形成转移。因此，药物对内皮细胞的影响，可以作为判定药物的疗效的标准之一。
材料和方法
1 试剂与药物
, http://www.100md.com
细胞培养液为含20%小牛血清的M199液(华美公司)，内皮细胞(EC)来自胎儿脐静脉，同时加内皮生长因子30 μ/ml, 实验采用2～5代内皮细胞;药物包括川芎嗪、苦参碱(中国医学科学院药物所);PG细胞：人肺高转移巨细胞癌细胞系(北京医科大学病理室)；IgG1-FITC，CD44-FITC，CD49-FITC，CD31-FITC均为PHARMINGEN产品；FACSort 流式细胞仪为美国BD公司产品。
2 癌细胞内皮粘附试验
收集PG细胞,以PBS洗涤后, 重悬于完全培养基中,调整浓度4×105细胞/ml,加入已铺满EC的96孔板上(100 μl/孔),再加入川芎嗪、苦参碱，剂量为5 μg/ml,在37℃,5%CO2培养箱中培养30，60，90，120 min，弃去未粘着的细胞,再以0.25%胰蛋白酶洗脱粘附的细胞进行计数,计算粘附率。
, http://www.100md.com 3 粘附因子的表达
收集培养的PG细胞,以PBS洗涤后,重悬于完全培养基中,调整浓度4×105细胞/ml,加入已铺满EC的24孔板上(500 μL/孔), 再加入川芎嗪、苦参碱，剂量5 μg/ml,于37℃，5%CO2培养箱中培养30，60，90，120 min弃去未粘着的细胞,再以0.25%胰蛋白酶洗脱粘附的细胞,待测。以CD44和CD49对上述PG细胞进行标记，流式测定。
4 内皮细胞体外通透性试验
取Boyden小室若干，以孔径为1.0 μm的微孔滤膜(上海工业研究院制)铺在小室上面，以内皮细胞2×104接种上室滤膜面，待形成细胞单层后，收集培养的PG细胞,以PBS洗涤后,重悬于无血清的培养基中,调整浓度4×105细胞/ml,加到内皮细胞单层上，再加入川芎嗪、苦参碱，分高、中、低三个剂量，分别为50，5，0.5 μg/ml, 再加牛血清蛋白，于37℃，5%CO2培养箱中培养，每隔30 min取下室培养液进行白蛋白的浓度测定。
, 百拇医药
结 果
1 癌细胞内皮单层粘附量
见表1。
表1 川芎嗪、苦参碱等对内皮细胞与PG细胞的粘附影响
30min
60min
90min
120min
粘附率
粘附抑
粘附率
粘附抑
, http://www.100md.com
粘附率
粘附抑
粘附率
粘附抑
(%)
制率(%)
(%)
制率(%)
(%)
制率(%)
(%)
制率(%)
对照组
, http://www.100md.com
15
37.6
42.5
47.5
川芎嗪
12.5
16.7
20
46.8
27.5
35.2
25.0
47.3
, http://www.100md.com
苦参碱
12.5
16.7
22.5
40.0
30.0
29.4
25.0
47.3
中药由于在体内缓慢地起作用，30 min粘附抑制率比较低，60 min达到第1个高峰，90 min略下降，120 min达到第2个高峰，这可能与中药中含有多种成分，在不同时间发挥作用有关。2 中药对粘附因子表达的影响
, 百拇医药 见表2。
表2 川芎嗪、苦参碱对CD44、CD49粘附因子的影响 时间(h)
CD44
CD49
平均荧光
几何荧光
中位荧光
平均荧光
几何荧光
中位荧光
对照组
0.5h
, http://www.100md.com 523.54
336.23
392.42
18.45
17.56
17.21
1h
374.93
245.09
283.87
17.60
14.98
15.14
, 百拇医药
2h
265.46
178.65
199.63
15.93
14.25
13.97
川芎嗪
0.5h
420.61
239.11
283.87
13.57
, 百拇医药
12.54
11.55
1h
218.83
121.86
124.09
13.86
12.81
11.97
2h
106.23
68.84
62.64
, http://www.100md.com
12.91
13.21
11.97
苦参碱
0.5h
437.60
295.02
339.82
11.90
11.65
11.14
1h
250.88
, 百拇医药
152.09
163.87
3.19
2.78
2.64
2h
147.14
95.43
106.34
3.57
2.86
2.97
在对照组中粘附因子CD44和CD49的表达，0.5 h比较高，1 h开始下降，2 h下降更低。说明肿瘤细胞与内皮细胞开始接触时，粘附因子分泌较多，逐渐分泌减少，呈下降趋势。采用川芎嗪、苦参碱治疗后CD44和CD49粘附因子在0.5，1 ，2 h的各项指标均明显低于对照组，CD44和CD49粘附因子表达明显减少。3 内皮细胞体外通透性白蛋白渗透影响
, 百拇医药
见表3。
表3 川芎嗪、苦参碱对内皮通透性影响(μg/ml) 组别
30min
60min
90min
120min
A
B
A
B
A
B
A
, 百拇医药
B
对照
0.05
0.13
0.13
0.17
0.17
0.20
0.20
0.24
0.24
高剂量
0.05
, http://www.100md.com
0.09
0.08
0.11
0.10
0.13
0.12
0.15
0.14
中剂量
0.05
0.10
0.09
0.12
, 百拇医药
0.12
0.14
0.14
0.16
0.15
低剂量
0.05
0.10
0.09
0.12
0.13
0.15
0.15
, 百拇医药
0.18
0.17
A：川芎嗪；B：苦参碱 用川芎嗪、苦参碱后，内皮细胞的通透性明显降低，与用药剂量有一定的相关性。
讨 论
Rice研究认为癌细胞的浸润转移与内皮细胞膜表面的粘附相关,内皮细胞是抗癌的最前沿屏障，癌细胞只有越过内皮细胞才能发生转移。高进等[3]研究表明肿瘤细胞与内皮细胞单层作用,粘附率与转移率呈正相关。该研究结果表明，肿瘤细胞与内皮细胞作用后，随时间的增加粘附率不断提高，由此为肿瘤转移创造了条件。采用川芎嗪、苦参碱等治疗后对肿瘤的粘附起到明显的抑制作用，从而阻断了肿瘤细胞与内皮细胞的粘附，减少了肿瘤转移的可能性。
恶性肿瘤细胞表达不同的粘附因子，粘附机制的失调，在肿瘤的转移中起重要的作用，干扰细胞粘附因子与肿瘤发生和转移密切相关[4]。细胞粘附分子CD44变异体的表达在促进结肠癌转移中十分重要[5]，在体外实验表明肿瘤细胞转染过度表达CD44,增加肿瘤转移潜能，这些数据提示CD44在肿瘤转移中扮演重要的角色。本研究的结果表明川芎嗪、苦参碱均可明显抑制肿瘤细胞与内皮细胞粘附后CD44、CD49粘附因子的表达，从而抑制了肿瘤细胞与内皮细胞的粘附，减少了肿瘤的转移。
, 百拇医药
本研究参考张亚历等[6] 内皮细胞通透性实验进行肿瘤细胞与内皮细胞通透性研究，经用中药处理后，内皮细胞通透性降低。其机理可能是肿瘤细胞与内皮细胞粘附后，血管内皮细胞收缩变圆，细胞连接间出现裂隙，内皮通透性增高，使得白蛋白渗出增加，经中药处理后，内皮细胞收缩减轻，白蛋白的渗出减少，阻断肿瘤细胞与基质的粘附，减少肿瘤的转移。
参考文献
1 Abe S.Molecular biological prognostic markers in lung cancer.Nippon Geka Gakkai Zasshi，1997,98(1)：2
2 Schildberg FW，Meyer G，Piltz S，et al.Surgical treatment of tumor metastases: general considerations and results.Surg Today,1995,25(1):1
, 百拇医药
3 高进,刘玉琴.转移性癌细胞的不同转移潜能亚群与细胞电泳速度、粘附、运动及侵袭性间相互关系.中国肿瘤,1994,3(9):19
4 Miyasaka M.Cancer metastasis and adhesion molecules.Clin Oncology,1995,58(312):10
5 Tanabe KK, Saya H.The CD44 adhesion molecule and metastasis.Crit Rev Oncology，1994,5(2):201
6 张亚历, 周杰，周殿元，等. 活性氧及抗癌药物对内皮细胞通透性、细胞骨架及癌细胞粘附量的影响.中国病理生理杂志, 1995,11(6)∶629
(收稿：1999-01-17 修回：1999-04-13), 百拇医药
单位：(中国中医研究院广安门医院，北京 100053)
关键词：肿瘤细胞粘附因子；活体外研究；中药；川芎嗪；苦参碱
中国新药杂志990609
摘要 目的：研究中药抗肿瘤转移机理。方法：采用川芎嗪、苦参碱对肿瘤细胞与内皮细胞粘附及粘附因子表达和对内皮细胞通透性影响进行研究。结果：中药对肿瘤细胞与内皮细胞的粘附具有明显的抑制作用，并可明显抑制CD44、CD49粘附因子的表达，还可以减轻内皮细胞的通透性，保护内皮细胞的完整，阻断肿瘤细胞与基质的粘附，从而减少了肿瘤转移的形成。结论：川芎嗪、苦参碱抑制肿瘤细胞与内皮细胞的粘附，抑制粘附因子的表达，减轻内皮细胞的通透性，减轻肿瘤转移。
EFFECTS OF ACTIVE COMPONENTS TO TWO TRADITIONAL CHINESE MEDICINAL HERBS,CHUANQIONGQIN & KUSHENJIAN, ON THE ADHESION OF ENDOTHELIOCYTES TO
, 百拇医药
CANCER CELL LINE(PG),ADHESION MELECULE AND PERMEABILITY OF
ENDOTHELIOCYTES IN VITRO
Lin Hongsheng,Li Shuqi,Pei Yingxia,et al.
(Guang An Men Hospital,Chinese Academy of Traditional Chinese Medicine,Beijing 111053)
ABSTRACT OBJECTIVE:To explore the inhibition effects of two TCM herbs on the mechanism of metastasis of cancer cell.METHODS:The active components of two TCM herbs,Chuannqiongqin and Kushenjian were tested in the culture of metastatic lung cancer cell line(PG),and observe the adhesion of endotheliocytes(EC) to PG,adhesion molecule and permeability of endotheliocytes.RESULTS:Data revealed that the active components of two TCM herbs inhibited the adhesion of EC to PG,regulated the expression of CD44,CD49,and reduced the permeability of EC.CONCLUSION: In vitro study shows that through the inhibition of adhesion of EC to PG,expression of adhesion of molecules,and permeability of EC,Chuanqiongqin & Kushenjian may inhibit the metastasis of cancer cells.
, 百拇医药
KEY WORDS Adhesion of endotheliocytes to cancer cell; In vitro study;TCM; Chuangqiong-qin;Kushenjian
研究认为肿瘤转移与癌细胞同内皮细胞的粘附、粘附因子的表达和穿透密切相关[1]。在肿瘤转移过程中,粘附因子十分重要，有报道认为CD44、CD49(细胞粘附因子)在肿瘤转移中扮演重要的角色[2]。肿瘤血行转移的关键步骤之一是血液中的癌细胞栓子附着在内皮上，血小板释放凝集素，使肿瘤细胞与内皮细胞粘附，血管内皮细胞收缩变圆，细胞连接间出现间隙，内皮层通透性增高，肿瘤细胞穿透血管壁，进入组织，形成转移。因此，药物对内皮细胞的影响，可以作为判定药物的疗效的标准之一。
材料和方法
1 试剂与药物
, http://www.100md.com
细胞培养液为含20%小牛血清的M199液(华美公司)，内皮细胞(EC)来自胎儿脐静脉，同时加内皮生长因子30 μ/ml, 实验采用2～5代内皮细胞;药物包括川芎嗪、苦参碱(中国医学科学院药物所);PG细胞：人肺高转移巨细胞癌细胞系(北京医科大学病理室)；IgG1-FITC，CD44-FITC，CD49-FITC，CD31-FITC均为PHARMINGEN产品；FACSort 流式细胞仪为美国BD公司产品。
2 癌细胞内皮粘附试验
收集PG细胞,以PBS洗涤后, 重悬于完全培养基中,调整浓度4×105细胞/ml,加入已铺满EC的96孔板上(100 μl/孔),再加入川芎嗪、苦参碱，剂量为5 μg/ml,在37℃,5%CO2培养箱中培养30，60，90，120 min，弃去未粘着的细胞,再以0.25%胰蛋白酶洗脱粘附的细胞进行计数,计算粘附率。
, http://www.100md.com 3 粘附因子的表达
收集培养的PG细胞,以PBS洗涤后,重悬于完全培养基中,调整浓度4×105细胞/ml,加入已铺满EC的24孔板上(500 μL/孔), 再加入川芎嗪、苦参碱，剂量5 μg/ml,于37℃，5%CO2培养箱中培养30，60，90，120 min弃去未粘着的细胞,再以0.25%胰蛋白酶洗脱粘附的细胞,待测。以CD44和CD49对上述PG细胞进行标记，流式测定。
4 内皮细胞体外通透性试验
取Boyden小室若干，以孔径为1.0 μm的微孔滤膜(上海工业研究院制)铺在小室上面，以内皮细胞2×104接种上室滤膜面，待形成细胞单层后，收集培养的PG细胞,以PBS洗涤后,重悬于无血清的培养基中,调整浓度4×105细胞/ml,加到内皮细胞单层上，再加入川芎嗪、苦参碱，分高、中、低三个剂量，分别为50，5，0.5 μg/ml, 再加牛血清蛋白，于37℃，5%CO2培养箱中培养，每隔30 min取下室培养液进行白蛋白的浓度测定。
, 百拇医药
结 果
1 癌细胞内皮单层粘附量
见表1。
表1 川芎嗪、苦参碱等对内皮细胞与PG细胞的粘附影响
30min
60min
90min
120min
粘附率
粘附抑
粘附率
粘附抑
, http://www.100md.com
粘附率
粘附抑
粘附率
粘附抑
(%)
制率(%)
(%)
制率(%)
(%)
制率(%)
(%)
制率(%)
对照组
, http://www.100md.com
15
37.6
42.5
47.5
川芎嗪
12.5
16.7
20
46.8
27.5
35.2
25.0
47.3
, http://www.100md.com
苦参碱
12.5
16.7
22.5
40.0
30.0
29.4
25.0
47.3
中药由于在体内缓慢地起作用，30 min粘附抑制率比较低，60 min达到第1个高峰，90 min略下降，120 min达到第2个高峰，这可能与中药中含有多种成分，在不同时间发挥作用有关。2 中药对粘附因子表达的影响
, 百拇医药 见表2。
表2 川芎嗪、苦参碱对CD44、CD49粘附因子的影响 时间(h)
CD44
CD49
平均荧光
几何荧光
中位荧光
平均荧光
几何荧光
中位荧光
对照组
0.5h
, http://www.100md.com 523.54
336.23
392.42
18.45
17.56
17.21
1h
374.93
245.09
283.87
17.60
14.98
15.14
, 百拇医药
2h
265.46
178.65
199.63
15.93
14.25
13.97
川芎嗪
0.5h
420.61
239.11
283.87
13.57
, 百拇医药
12.54
11.55
1h
218.83
121.86
124.09
13.86
12.81
11.97
2h
106.23
68.84
62.64
, http://www.100md.com
12.91
13.21
11.97
苦参碱
0.5h
437.60
295.02
339.82
11.90
11.65
11.14
1h
250.88
, 百拇医药
152.09
163.87
3.19
2.78
2.64
2h
147.14
95.43
106.34
3.57
2.86
2.97
在对照组中粘附因子CD44和CD49的表达，0.5 h比较高，1 h开始下降，2 h下降更低。说明肿瘤细胞与内皮细胞开始接触时，粘附因子分泌较多，逐渐分泌减少，呈下降趋势。采用川芎嗪、苦参碱治疗后CD44和CD49粘附因子在0.5，1 ，2 h的各项指标均明显低于对照组，CD44和CD49粘附因子表达明显减少。3 内皮细胞体外通透性白蛋白渗透影响
, 百拇医药
见表3。
表3 川芎嗪、苦参碱对内皮通透性影响(μg/ml) 组别
30min
60min
90min
120min
A
B
A
B
A
B
A
, 百拇医药
B
对照
0.05
0.13
0.13
0.17
0.17
0.20
0.20
0.24
0.24
高剂量
0.05
, http://www.100md.com
0.09
0.08
0.11
0.10
0.13
0.12
0.15
0.14
中剂量
0.05
0.10
0.09
0.12
, 百拇医药
0.12
0.14
0.14
0.16
0.15
低剂量
0.05
0.10
0.09
0.12
0.13
0.15
0.15
, 百拇医药
0.18
0.17
A：川芎嗪；B：苦参碱 用川芎嗪、苦参碱后，内皮细胞的通透性明显降低，与用药剂量有一定的相关性。
讨 论
Rice研究认为癌细胞的浸润转移与内皮细胞膜表面的粘附相关,内皮细胞是抗癌的最前沿屏障，癌细胞只有越过内皮细胞才能发生转移。高进等[3]研究表明肿瘤细胞与内皮细胞单层作用,粘附率与转移率呈正相关。该研究结果表明，肿瘤细胞与内皮细胞作用后，随时间的增加粘附率不断提高，由此为肿瘤转移创造了条件。采用川芎嗪、苦参碱等治疗后对肿瘤的粘附起到明显的抑制作用，从而阻断了肿瘤细胞与内皮细胞的粘附，减少了肿瘤转移的可能性。
恶性肿瘤细胞表达不同的粘附因子，粘附机制的失调，在肿瘤的转移中起重要的作用，干扰细胞粘附因子与肿瘤发生和转移密切相关[4]。细胞粘附分子CD44变异体的表达在促进结肠癌转移中十分重要[5]，在体外实验表明肿瘤细胞转染过度表达CD44,增加肿瘤转移潜能，这些数据提示CD44在肿瘤转移中扮演重要的角色。本研究的结果表明川芎嗪、苦参碱均可明显抑制肿瘤细胞与内皮细胞粘附后CD44、CD49粘附因子的表达，从而抑制了肿瘤细胞与内皮细胞的粘附，减少了肿瘤的转移。
, 百拇医药
本研究参考张亚历等[6] 内皮细胞通透性实验进行肿瘤细胞与内皮细胞通透性研究，经用中药处理后，内皮细胞通透性降低。其机理可能是肿瘤细胞与内皮细胞粘附后，血管内皮细胞收缩变圆，细胞连接间出现裂隙，内皮通透性增高，使得白蛋白渗出增加，经中药处理后，内皮细胞收缩减轻，白蛋白的渗出减少，阻断肿瘤细胞与基质的粘附，减少肿瘤的转移。
参考文献
1 Abe S.Molecular biological prognostic markers in lung cancer.Nippon Geka Gakkai Zasshi，1997,98(1)：2
2 Schildberg FW，Meyer G，Piltz S，et al.Surgical treatment of tumor metastases: general considerations and results.Surg Today,1995,25(1):1
, 百拇医药
3 高进,刘玉琴.转移性癌细胞的不同转移潜能亚群与细胞电泳速度、粘附、运动及侵袭性间相互关系.中国肿瘤,1994,3(9):19
4 Miyasaka M.Cancer metastasis and adhesion molecules.Clin Oncology,1995,58(312):10
5 Tanabe KK, Saya H.The CD44 adhesion molecule and metastasis.Crit Rev Oncology，1994,5(2):201
6 张亚历, 周杰，周殿元，等. 活性氧及抗癌药物对内皮细胞通透性、细胞骨架及癌细胞粘附量的影响.中国病理生理杂志, 1995,11(6)∶629
(收稿：1999-01-17 修回：1999-04-13), 百拇医药