pH-敏脂质体研究的最新进展
作者：王 弘 王志清 王升启
单位：(军事医学科学院放射医学研究所， 北京 100850)
关键词：脂质体；pH-敏脂质体；非病毒载体
pH 摘要 综述近几年pH-敏脂质体的研究的新方法和新思路，为此类脂质体的开发和应用提供参考。
RECENT DEVELOPMENT IN pH-SENSITIVE LIPOSOMES’ RESEARCH
Wang Hong, Wang Zhiqing, Wang Shengqi
(Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850)
, http://www.100md.com
ABSTRACT The new methods and thinking in pH-sensitive liposomes research in recent years were reviewed in an attempt to provide references for development and application of agents of this kind.
KEY WORDS Liposomes;pH-sensitive liposomes; Negative virus carrier
脂质体是具有双层膜的封闭式粒子。脂质体技术主要是利用生物膜的物理化学性质作为药物载体。脂质体转运DNA原理是脂质体加速大分子、荷电多的分子透过细胞膜。此过程相当复杂，尤其在包封较大片段上。由于这种技术在实践中只在体外使用且要用融合剂，荷电越多用途越少；同时由于脂质体稳定性和在环境中相互作用的特点而不能广泛使用。采用pH敏脂质体可以改善转运并且不改变方向。立体稳定性的pH-敏脂质体在血循环中极稳定，避免了在血循环中被迅速清除，可在血管部位渗出并在肿瘤组织发挥作用，已成功地用于人体肿瘤治疗的临床前和临床试验。
, 百拇医药
pH-敏脂质体是一种具有细胞内靶向和控制药物(如基因、核酸、肽、蛋白质)释放的功能性脂质体。其原理是pH低时可导致脂肪酯羧基的质子化而引起六角晶相的形成，这是膜融合的主要机制。在酸性条件下，即在核内体(endosome)形成后几分钟内，进入溶酶体之前， pH从7.4减至5.3～6.3左右时，pH-敏脂质体膜发生结构改变，促使脂质体膜与核内体/溶酶体膜的融合，将包封的物质导入胞浆及主动靶向病变组织，避免网状内皮系统的清除[1]。制成pH敏脂质体可在一定程度上避免溶酶体降解并增加包封物摄取量和稳定性，有效地将包封物转运到胞浆[2～6]。
转染技术上应用pH-敏脂质体是目前生物大分子转运的重要手段，在体外实验成功的同时，显示体内基因靶向的特点；经结合抗体或采用特殊组成制备的特殊pH-敏脂质体能达到提高靶向、延长体内循环时间等目的。
1 pH-敏脂质体
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减少病毒介导基因转染的方法是采用非病毒载体。采用脂质体介导DNA进入细胞已有19年历史。根据与溶酶体融合前的细胞内空泡融合而设计的pH-敏脂质体，DNA释放入胞浆而不被溶酶体的降解酶破坏[7]。
pH-敏脂质体的组成影响pH-敏脂质体的pH敏感性。由于脂膜中含有不饱和PE(磷脂酰乙醇胺)，不易水化，它在中性生理环境下可形成六角晶相，须加入某些脂肪酸以制成稳定的脂质。当pH<6.5时，脂肪酸的羟基端质子化，形成六角晶相引起膜的融合，这一点已用共振能量转换分析(resonance energy transfer assay)证实。脑硫脂对二硫酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)小单室脂质体有双重稳定作用[8]，脑硫脂是一种酸性糖脂，含有疏水基和一种可水化及硫化的残基。摩尔百分比为30的脑硫脂和摩尔百分比为50的DOPE在N2保护下超声后转移到试管中，用N2挥干；样品在真空条件4℃贮存24 h。试管壁上的脂薄膜用缓冲液水化，在N2保护、冰浴下超声10 min，即得。
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激光扫描检测降钙素pH-敏脂质体显示：当脑硫脂摩尔百分比为30时，生理pH条件下形成稳定的DOPE/脑硫脂脂质体，且在人血浆中稳定。在pH6.0或存在pH梯度时双层脂膜泄漏。在37℃条件下24 h，降钙素释放量与pH7.4条件下相比增加1倍。显示：脑硫脂端基的水化和部分水化在pH改变时取决于DOPE/脑硫脂脂质体的pH敏感性 ，而糖磷脂对双层脂膜的凝聚作用不显著。
两亲极性组成的pH敏脂质体，作为一种可质子化的成分[9] 组成为可离子化的跨膜两亲极性物质——二半琥珀酰氧己基-粘康酸酯(DHM)的脂质体，其在各种pH的磷酸盐缓冲液中， 37℃孵育1 h显示出pH敏的特点。 即在中性pH时脂质体是稳定的， 在酸性条件下是不稳定的。组成为DOPE和二硫酰磷脂酰胆碱(DOPC)(摩尔比1∶1)脂质体在弱酸条件下无不稳定性，表明DHM作为脂质体的一个酸性成分。由于DHM中粘性基团为硬性部分，能防止两亲物质在脂质体膜中变为U型，同时防止酸性成分受外界血清的影响，所以DHM组成的pH敏脂质体在37℃血浆中稳定。
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采用释放包封的水溶性成分的方法(释放动力学)研究磷脂酰乙醇胺脂质体的pH-诱导不稳定的机制和离子化胆固醇酰酯。水溶性荧光基团8-氨基萘—1，3，6三磺酸结合萃灭剂吡啶嗡用荧光分析法检测组成为磷脂酰乙醇胺和胆固醇的脂质体包含物的释放，显示出pH敏的功能、磷脂酰乙醇胺对胆固醇半琥珀酰盐的比例和磷脂酰乙醇胺的乙酰链组成的功能。 在pH5.5时, 释放值低,当降到pH4.0时, 释放值明显地提高。采用磷脂酰胆碱代替磷脂酰乙醇胺消除了pH影响的泄漏作用。质量作用模型释放动力学分析发现双层膜具有不稳定性作用并在聚集后产生了完整性双层不稳定作用。就酸性的磷脂双层膜而言， 要求在二价阳离子存在下及在低于放热的相转变温度时对饱和磷脂酰胆碱双层具有一定作用。
胆固醇半琥珀酰(CHEMS)磷脂酰乙醇胺膜对质子和给予离子的敏感性稳定作用研究表明：① 中性pH时，摩尔百分比为8的胆固醇半琥珀酰和酯基转移的蛋黄磷脂酰乙醇胺(TPE)可提高片状六角形TPE的相变温度达11℃。② 低于pH5.5时,当结合的CHEMS浓度超过20摩尔百分比。CHEMS的质子化提高了TPE的六角晶相(HII)的形成。③ 在CHEMS摩尔百分比为25时, 相变温度低于30℃(pH4.5) 仍可发生酸诱导的相变。
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pH-敏脂质体在心血管疾病基因治疗中也得到应用[10]。利用病毒细胞融合脂质体的特点，将日本血细胞凝集病毒(HVJ)与脱氧寡核苷酸或质粒DNA脂质体复合，能诱导DNA直接进入细胞浆。另外，DNA连接的核蛋白经HVJ-脂质体包封增强了质粒基因表达，表明：融合病毒基因脂质体能有效地在体内、外介导寡聚脱氧核苷酸和基因片段；同时表明，这种脂质体适宜在多种动物组织的靶向DNA转移。目前已成功地应用这种基因治疗手段治疗心血管增生，例如用反义脱氧寡核苷酸融合基因病毒脂质体对抗细胞循环基因、对抗转移基因编码一氧化氮合成酶的表达。
2 pH-敏免疫脂质体
pH敏免疫脂质体是靶向细胞的有效载体[1]。作用机制为受体介导的内吞作用。脂质体进入核内体或溶酶体的酸性环境中不稳定并且变成融合成分，表明该新型脂质体是一种有效的质粒DNA转运系统(抗癌药)。病毒茶叶碱激酶基因的质粒包入表面嵌合抗体的靶向脂质体，这些脂质体显示出长期DNA活性，且对靶细胞有效。机制为pH-敏脂质体诱导核内体或溶酶体部分溶解，表明有效的胞浆转运。pH-敏脂质体是相对大量的稳定制剂，转染可采用将脂质体与质粒DNA混合的方法导入细胞。
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流感病毒通过内吞途径而感染细胞，细胞内的空泡内为弱酸性(pH 5～6)，酸性pH触发了血液凝集素蛋白的改变，并促进病毒膜与核内体融合。由这一机制设计的在中性pH时脂双层结构，在酸性pH时通过膜-膜融合而发生胶团转变的pH敏免疫脂质体[6],显示体内基因靶向的特点，经结合单克隆抗体的pH敏脂质体，显著提高对肿瘤细胞表面抗原的靶向性。将脂质体结合肿瘤细胞表面抗原的抗体经小鼠腹膜内给药，进而表达质粒编码的在诱导启动子后的报告基因。表明：在给抗体靶向的pH敏脂质体肿瘤细胞内的报告基因活性最高。
pH-敏免疫脂质体在大鼠神经元(neuron)和神经蚀质(glial)的转染实验表明:抗体5-113(导向大鼠神经蚀质细胞外表面抗原)、抗体THy1.1和一种非免疫抗体通过N-戊二酰基-磷脂酰乙醇胺结合型脂质体，包封标记的质粒后，可在神经原、星型细胞、血细胞中见到X-gal反应产物。动物注射抗体THy1.1结合脂质体后，在神经原处标记物的量增加，同时动物注射抗体5-113结合脂质体后，在神经蚀质处的标记物量增加。在脊髓中，免疫脂质体穿透距离较大，从注射部位经几厘米转染神经原。这些资料表明：该脂质体包封β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)质粒可控制细胞巨化病毒启动子。采用3种不同抗体之一构建的脂质体注入成年大鼠脑或脊髓腔内，在神经系统基因转运上免疫脂质体为有效转染系统[11]。
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pH-敏免疫脂质体(磷脂酰乙醇胺和叶酸摩尔比为8∶2)转运白喉毒素A片段靶向细胞浆；而游离片段A、包封在无抗体的脂质体中片段A、包封在非pH-敏免疫脂质体中的片段A都不能抑制细胞内蛋白合成。包封白喉毒素A片段pH-敏免疫脂质体对非靶向的抗白喉A31细胞或对非靶向白喉毒素敏Vero细胞敏感。用弱碱氯喹或氯化铵预处理靶细胞L-929，均可提高核内体/溶酶体pH值。过多的游离抗体或过量的空免疫脂质体也能阻止细胞毒效果。因未经脂质体包封的白喉毒素A片段不能透过脂膜，而研究发现，pH-敏免疫脂质体能将白喉毒素转运到细胞浆，可能是在受体介导的免疫脂质体内吞之后，与核内体膜融合所致。
pH敏免疫脂质体能提高寡核苷酸在人骨髓和淋巴白细胞内的转运[12]，实验表明：细胞摄取脂质体包封的抗-myb寡核苷酸比摄取游离型寡核苷酸量高3～5倍。另外，带有专一性抗体如抗-CD32或抗-CD2的免疫脂质体与白血病细胞上受体的作用使寡核苷酸转运至白血病细胞效果增强， 其摄取量为单独采用脂质体或非专属性脂质体使人白血病细胞摄取量的2倍。免疫脂质体经过特定的抗体连接促进寡核苷酸进入有合适受体的白血病细胞。
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结合棕榈酰抗体的磷脂酰乙醇胺pH-敏脂质体主动靶向细胞，提高包封的阿糖胞苷或无环鸟苷的抗病毒效果和细胞毒性。小鼠感染单疱疹病毒的纤维细胞L929在低的分裂期时应用阿糖胞苷靶敏感性免疫脂质体(组成为蛋黄磷脂酰乙醇胺)能有效地抑制病毒复制并且细胞毒性比游离药物低。细胞毒性结果表明：游离的阿糖胞苷、pH敏感阿糖胞苷脂质体CD50分别为0.3 ng/ml和1 μg/ml，包封的阿糖胞苷病毒抑制半数有效量ED50为1.8 ng/ml，而同等的抗病毒活性则要求游离药物浓度剂量至少高1 000倍，表明pH敏免疫脂质体在药物转运上的优越性，特别是对有细胞性的药物转运更有效。采用靶非敏感免疫脂质体可在某些程度上使活性增强，但比靶敏感免疫脂质体低7倍；该结果也说明经靶敏感免疫脂质体的细胞核苷转运系统为专一性位点的核苷类似物转运的作用机制。
3 延长体内循环时间的pH-敏脂质体
细胞内立体稳定的pH-敏脂质体转运水溶性物质并延长体内循环时间。在弱酸性pH条件下，不稳定的脂质体为转运水溶性药物进入胞浆的有效载体。然而，体内使用则因被网状内皮系统摄取而受限制。由于聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)有立体稳定作用而延长脂质体的循环时间[13]。这一修饰显著降低了脂质体内pH依赖性的荧光标记降钙素的释放，而且降钙素从脂质体中释放后被细胞内化，同时受到核内体酸化作用的抑制剂氯化铵的限制，显示其体内独特性质。大鼠静脉注射二油酰磷脂酰乙醇胺/PEG-PE脂质体后，碘的分布动力学的药动学参数与立体稳定的二硬脂酰磷脂酰胆碱/PEG-PE脂质体相似。反之，无PEG-PE成分的pH-敏脂质体则被迅速清除，立体稳定的pH-敏脂质体对体内转运基因、反义核苷酸和核酶等高密度阴离子分子很有潜力。
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4 聚合物修饰的pH-敏脂质体
pH-敏聚乙二醇衍生物修饰的蛋黄卵磷脂脂质体介导降钙素的细胞浆给药[14]组成为蛋黄磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生物(琥珀酰化聚缩水甘油)的一种新型脂质体，在弱酸或酸性条件下具有融合能力。降钙素由琥珀酰化聚缩水甘油修饰的脂质体向胞浆转运。CV-1细胞、绿猴肾细胞与非修饰降钙素脂质体在37℃孵育，胞浆内降钙素发散微弱的荧光，相反，聚合物修饰的降钙素脂质体则显示出很强的发散荧光，表明降钙素转运至细胞浆。表明：用大量的聚合物修饰脂质体使胞浆转染更有效。融合分析显示，在修饰脂质体和核内体和/或溶酶体膜之间，发生了融合。而且，用大量聚合物修饰脂质体在细胞内化后具有更高的融合百分率。在细胞内吞后，共振能量转换分析显示在聚合物修饰的脂质体和核内体/或溶酶体膜之间发生了融合。并且，聚合物含量越高内吞后融合百分率越高。这些结果表明，通过细胞内吞途径，在细胞内化后经过与核内体膜融合，聚合物修饰脂质体转运内含物进入胞浆。
, http://www.100md.com 总之，pH-敏脂质体的研究，越来越离不开对细胞内细胞器的相互作用、融合、释放及体内过程的探索，从而有针对性地载药、释药，最终达到靶向目的；药剂学上pH-敏脂质体技术水平的提高也越来越离不开与生化、生理、药理、分子生物学等学科的联系与融合。
参考文献
1 Okayama R, Noji M, Nakanishi M. Cationic cholesterol with a hydroxyethylamino head group promotes significantly liposome-mediated gene transfection.FEBS Lett,1997,408(2)∶232
2 Juliano RL, Akhtar S. Liposome as a drug delivery system for antisense oligonucleotides.Antisense Res Dev,1992,2(1)∶165
, 百拇医药
3 Ropert C, Lavignon M, Dubernet C,et al. Oligonucliotides encapsulated in pH sensitive liposomes are efficient toward friend retrovirus. Biochem Biophys Res Commun,1992,183(2)∶879
4 Ropert C, Malvy C,Couvreur P. Inhibition of the friend retrovirus by antisense oligonucleotide encapsulated in liposome: mechanism of action. Pharma Res,1993,10(10)∶1427
5 Tari AM, Tucker SD, Deisseroth A, et al. Liposome delivery of methyphosphonate antisense oligodeoxynucleotide in chronic myelogenous leukemia.Blood,1994, 84(2)∶601
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6 Lasic DD, Templeton NS. Liposomes in Gene Therapy.Adv Drug Del Rev, 1996,20(2,3)∶221
7 Sean M, Sullivan . Liposome-based gene transfer vehicles. Biopharm，1996, 50～51∶65
8 Wu XF, Lee KH, Li QT. Stability and pH sensitivity of sulfatide-containing phosphatidylethanolamine small unilamellar vesicles.Biochim Biophy Acta, 1996,1284(1)∶13
9 Jeong MH, Lee YS, Jin JY,et al. pH-Sensitive liposomes containing a bipolar amphiphile as a protonatable component.Bull Korean Chem Soc，1996，17(10)∶875
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10 Dzau VJ, Mann MJ, Morishita R,et al. Fusigenic viral liposome for gene therapy in cardiovascular diseases.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(21)∶11421
11 Geisert EE, Mar NAD, Owens JL,et al. Transfecting neurons and glia in the rat using pH-sensitive immunoliposomes.Neurosci Lett,1995,184(1)∶40
12 Ma DDF, Wei AQ. Enhanced delivery of synthetic oligonucleotides to human leukemic cells by liposomes and immunoliposomes.Leuk Res，1996,20(11/12)∶925
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13 Slepushkin VA, Simoes S, Dazin P,et al. Sterically stabilized pH-sensitive liposomes. Intracellular delivery of aqueous contents and prolonged circulation in vivo.J Biolchem，1997, 272(4),2382
14 Kono K , Igawa T, Takagishi T. Cytoplasmic delivery calcein mediated by liposomes modified with a pH-sensitive poly(ethylene glycol) derivative.Biochim Biophy Acta,1997, 1325(2)∶143
(收稿：1999-01-14 修回：1999-05-27), 百拇医药
单位：(军事医学科学院放射医学研究所， 北京 100850)
关键词：脂质体；pH-敏脂质体；非病毒载体
pH 摘要 综述近几年pH-敏脂质体的研究的新方法和新思路，为此类脂质体的开发和应用提供参考。
RECENT DEVELOPMENT IN pH-SENSITIVE LIPOSOMES’ RESEARCH
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ABSTRACT The new methods and thinking in pH-sensitive liposomes research in recent years were reviewed in an attempt to provide references for development and application of agents of this kind.
KEY WORDS Liposomes;pH-sensitive liposomes; Negative virus carrier
脂质体是具有双层膜的封闭式粒子。脂质体技术主要是利用生物膜的物理化学性质作为药物载体。脂质体转运DNA原理是脂质体加速大分子、荷电多的分子透过细胞膜。此过程相当复杂，尤其在包封较大片段上。由于这种技术在实践中只在体外使用且要用融合剂，荷电越多用途越少；同时由于脂质体稳定性和在环境中相互作用的特点而不能广泛使用。采用pH敏脂质体可以改善转运并且不改变方向。立体稳定性的pH-敏脂质体在血循环中极稳定，避免了在血循环中被迅速清除，可在血管部位渗出并在肿瘤组织发挥作用，已成功地用于人体肿瘤治疗的临床前和临床试验。
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pH-敏脂质体是一种具有细胞内靶向和控制药物(如基因、核酸、肽、蛋白质)释放的功能性脂质体。其原理是pH低时可导致脂肪酯羧基的质子化而引起六角晶相的形成，这是膜融合的主要机制。在酸性条件下，即在核内体(endosome)形成后几分钟内，进入溶酶体之前， pH从7.4减至5.3～6.3左右时，pH-敏脂质体膜发生结构改变，促使脂质体膜与核内体/溶酶体膜的融合，将包封的物质导入胞浆及主动靶向病变组织，避免网状内皮系统的清除[1]。制成pH敏脂质体可在一定程度上避免溶酶体降解并增加包封物摄取量和稳定性，有效地将包封物转运到胞浆[2～6]。
转染技术上应用pH-敏脂质体是目前生物大分子转运的重要手段，在体外实验成功的同时，显示体内基因靶向的特点；经结合抗体或采用特殊组成制备的特殊pH-敏脂质体能达到提高靶向、延长体内循环时间等目的。
1 pH-敏脂质体
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减少病毒介导基因转染的方法是采用非病毒载体。采用脂质体介导DNA进入细胞已有19年历史。根据与溶酶体融合前的细胞内空泡融合而设计的pH-敏脂质体，DNA释放入胞浆而不被溶酶体的降解酶破坏[7]。
pH-敏脂质体的组成影响pH-敏脂质体的pH敏感性。由于脂膜中含有不饱和PE(磷脂酰乙醇胺)，不易水化，它在中性生理环境下可形成六角晶相，须加入某些脂肪酸以制成稳定的脂质。当pH<6.5时，脂肪酸的羟基端质子化，形成六角晶相引起膜的融合，这一点已用共振能量转换分析(resonance energy transfer assay)证实。脑硫脂对二硫酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)小单室脂质体有双重稳定作用[8]，脑硫脂是一种酸性糖脂，含有疏水基和一种可水化及硫化的残基。摩尔百分比为30的脑硫脂和摩尔百分比为50的DOPE在N2保护下超声后转移到试管中，用N2挥干；样品在真空条件4℃贮存24 h。试管壁上的脂薄膜用缓冲液水化，在N2保护、冰浴下超声10 min，即得。
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激光扫描检测降钙素pH-敏脂质体显示：当脑硫脂摩尔百分比为30时，生理pH条件下形成稳定的DOPE/脑硫脂脂质体，且在人血浆中稳定。在pH6.0或存在pH梯度时双层脂膜泄漏。在37℃条件下24 h，降钙素释放量与pH7.4条件下相比增加1倍。显示：脑硫脂端基的水化和部分水化在pH改变时取决于DOPE/脑硫脂脂质体的pH敏感性 ，而糖磷脂对双层脂膜的凝聚作用不显著。
两亲极性组成的pH敏脂质体，作为一种可质子化的成分[9] 组成为可离子化的跨膜两亲极性物质——二半琥珀酰氧己基-粘康酸酯(DHM)的脂质体，其在各种pH的磷酸盐缓冲液中， 37℃孵育1 h显示出pH敏的特点。 即在中性pH时脂质体是稳定的， 在酸性条件下是不稳定的。组成为DOPE和二硫酰磷脂酰胆碱(DOPC)(摩尔比1∶1)脂质体在弱酸条件下无不稳定性，表明DHM作为脂质体的一个酸性成分。由于DHM中粘性基团为硬性部分，能防止两亲物质在脂质体膜中变为U型，同时防止酸性成分受外界血清的影响，所以DHM组成的pH敏脂质体在37℃血浆中稳定。
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采用释放包封的水溶性成分的方法(释放动力学)研究磷脂酰乙醇胺脂质体的pH-诱导不稳定的机制和离子化胆固醇酰酯。水溶性荧光基团8-氨基萘—1，3，6三磺酸结合萃灭剂吡啶嗡用荧光分析法检测组成为磷脂酰乙醇胺和胆固醇的脂质体包含物的释放，显示出pH敏的功能、磷脂酰乙醇胺对胆固醇半琥珀酰盐的比例和磷脂酰乙醇胺的乙酰链组成的功能。 在pH5.5时, 释放值低,当降到pH4.0时, 释放值明显地提高。采用磷脂酰胆碱代替磷脂酰乙醇胺消除了pH影响的泄漏作用。质量作用模型释放动力学分析发现双层膜具有不稳定性作用并在聚集后产生了完整性双层不稳定作用。就酸性的磷脂双层膜而言， 要求在二价阳离子存在下及在低于放热的相转变温度时对饱和磷脂酰胆碱双层具有一定作用。
胆固醇半琥珀酰(CHEMS)磷脂酰乙醇胺膜对质子和给予离子的敏感性稳定作用研究表明：① 中性pH时，摩尔百分比为8的胆固醇半琥珀酰和酯基转移的蛋黄磷脂酰乙醇胺(TPE)可提高片状六角形TPE的相变温度达11℃。② 低于pH5.5时,当结合的CHEMS浓度超过20摩尔百分比。CHEMS的质子化提高了TPE的六角晶相(HII)的形成。③ 在CHEMS摩尔百分比为25时, 相变温度低于30℃(pH4.5) 仍可发生酸诱导的相变。
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pH-敏脂质体在心血管疾病基因治疗中也得到应用[10]。利用病毒细胞融合脂质体的特点，将日本血细胞凝集病毒(HVJ)与脱氧寡核苷酸或质粒DNA脂质体复合，能诱导DNA直接进入细胞浆。另外，DNA连接的核蛋白经HVJ-脂质体包封增强了质粒基因表达，表明：融合病毒基因脂质体能有效地在体内、外介导寡聚脱氧核苷酸和基因片段；同时表明，这种脂质体适宜在多种动物组织的靶向DNA转移。目前已成功地应用这种基因治疗手段治疗心血管增生，例如用反义脱氧寡核苷酸融合基因病毒脂质体对抗细胞循环基因、对抗转移基因编码一氧化氮合成酶的表达。
2 pH-敏免疫脂质体
pH敏免疫脂质体是靶向细胞的有效载体[1]。作用机制为受体介导的内吞作用。脂质体进入核内体或溶酶体的酸性环境中不稳定并且变成融合成分，表明该新型脂质体是一种有效的质粒DNA转运系统(抗癌药)。病毒茶叶碱激酶基因的质粒包入表面嵌合抗体的靶向脂质体，这些脂质体显示出长期DNA活性，且对靶细胞有效。机制为pH-敏脂质体诱导核内体或溶酶体部分溶解，表明有效的胞浆转运。pH-敏脂质体是相对大量的稳定制剂，转染可采用将脂质体与质粒DNA混合的方法导入细胞。
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流感病毒通过内吞途径而感染细胞，细胞内的空泡内为弱酸性(pH 5～6)，酸性pH触发了血液凝集素蛋白的改变，并促进病毒膜与核内体融合。由这一机制设计的在中性pH时脂双层结构，在酸性pH时通过膜-膜融合而发生胶团转变的pH敏免疫脂质体[6],显示体内基因靶向的特点，经结合单克隆抗体的pH敏脂质体，显著提高对肿瘤细胞表面抗原的靶向性。将脂质体结合肿瘤细胞表面抗原的抗体经小鼠腹膜内给药，进而表达质粒编码的在诱导启动子后的报告基因。表明：在给抗体靶向的pH敏脂质体肿瘤细胞内的报告基因活性最高。
pH-敏免疫脂质体在大鼠神经元(neuron)和神经蚀质(glial)的转染实验表明:抗体5-113(导向大鼠神经蚀质细胞外表面抗原)、抗体THy1.1和一种非免疫抗体通过N-戊二酰基-磷脂酰乙醇胺结合型脂质体，包封标记的质粒后，可在神经原、星型细胞、血细胞中见到X-gal反应产物。动物注射抗体THy1.1结合脂质体后，在神经原处标记物的量增加，同时动物注射抗体5-113结合脂质体后，在神经蚀质处的标记物量增加。在脊髓中，免疫脂质体穿透距离较大，从注射部位经几厘米转染神经原。这些资料表明：该脂质体包封β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)质粒可控制细胞巨化病毒启动子。采用3种不同抗体之一构建的脂质体注入成年大鼠脑或脊髓腔内，在神经系统基因转运上免疫脂质体为有效转染系统[11]。
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pH-敏免疫脂质体(磷脂酰乙醇胺和叶酸摩尔比为8∶2)转运白喉毒素A片段靶向细胞浆；而游离片段A、包封在无抗体的脂质体中片段A、包封在非pH-敏免疫脂质体中的片段A都不能抑制细胞内蛋白合成。包封白喉毒素A片段pH-敏免疫脂质体对非靶向的抗白喉A31细胞或对非靶向白喉毒素敏Vero细胞敏感。用弱碱氯喹或氯化铵预处理靶细胞L-929，均可提高核内体/溶酶体pH值。过多的游离抗体或过量的空免疫脂质体也能阻止细胞毒效果。因未经脂质体包封的白喉毒素A片段不能透过脂膜，而研究发现，pH-敏免疫脂质体能将白喉毒素转运到细胞浆，可能是在受体介导的免疫脂质体内吞之后，与核内体膜融合所致。
pH敏免疫脂质体能提高寡核苷酸在人骨髓和淋巴白细胞内的转运[12]，实验表明：细胞摄取脂质体包封的抗-myb寡核苷酸比摄取游离型寡核苷酸量高3～5倍。另外，带有专一性抗体如抗-CD32或抗-CD2的免疫脂质体与白血病细胞上受体的作用使寡核苷酸转运至白血病细胞效果增强， 其摄取量为单独采用脂质体或非专属性脂质体使人白血病细胞摄取量的2倍。免疫脂质体经过特定的抗体连接促进寡核苷酸进入有合适受体的白血病细胞。
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结合棕榈酰抗体的磷脂酰乙醇胺pH-敏脂质体主动靶向细胞，提高包封的阿糖胞苷或无环鸟苷的抗病毒效果和细胞毒性。小鼠感染单疱疹病毒的纤维细胞L929在低的分裂期时应用阿糖胞苷靶敏感性免疫脂质体(组成为蛋黄磷脂酰乙醇胺)能有效地抑制病毒复制并且细胞毒性比游离药物低。细胞毒性结果表明：游离的阿糖胞苷、pH敏感阿糖胞苷脂质体CD50分别为0.3 ng/ml和1 μg/ml，包封的阿糖胞苷病毒抑制半数有效量ED50为1.8 ng/ml，而同等的抗病毒活性则要求游离药物浓度剂量至少高1 000倍，表明pH敏免疫脂质体在药物转运上的优越性，特别是对有细胞性的药物转运更有效。采用靶非敏感免疫脂质体可在某些程度上使活性增强，但比靶敏感免疫脂质体低7倍；该结果也说明经靶敏感免疫脂质体的细胞核苷转运系统为专一性位点的核苷类似物转运的作用机制。
3 延长体内循环时间的pH-敏脂质体
细胞内立体稳定的pH-敏脂质体转运水溶性物质并延长体内循环时间。在弱酸性pH条件下，不稳定的脂质体为转运水溶性药物进入胞浆的有效载体。然而，体内使用则因被网状内皮系统摄取而受限制。由于聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)有立体稳定作用而延长脂质体的循环时间[13]。这一修饰显著降低了脂质体内pH依赖性的荧光标记降钙素的释放，而且降钙素从脂质体中释放后被细胞内化，同时受到核内体酸化作用的抑制剂氯化铵的限制，显示其体内独特性质。大鼠静脉注射二油酰磷脂酰乙醇胺/PEG-PE脂质体后，碘的分布动力学的药动学参数与立体稳定的二硬脂酰磷脂酰胆碱/PEG-PE脂质体相似。反之，无PEG-PE成分的pH-敏脂质体则被迅速清除，立体稳定的pH-敏脂质体对体内转运基因、反义核苷酸和核酶等高密度阴离子分子很有潜力。
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4 聚合物修饰的pH-敏脂质体
pH-敏聚乙二醇衍生物修饰的蛋黄卵磷脂脂质体介导降钙素的细胞浆给药[14]组成为蛋黄磷脂酰胆碱和聚乙二醇衍生物(琥珀酰化聚缩水甘油)的一种新型脂质体，在弱酸或酸性条件下具有融合能力。降钙素由琥珀酰化聚缩水甘油修饰的脂质体向胞浆转运。CV-1细胞、绿猴肾细胞与非修饰降钙素脂质体在37℃孵育，胞浆内降钙素发散微弱的荧光，相反，聚合物修饰的降钙素脂质体则显示出很强的发散荧光，表明降钙素转运至细胞浆。表明：用大量的聚合物修饰脂质体使胞浆转染更有效。融合分析显示，在修饰脂质体和核内体和/或溶酶体膜之间，发生了融合。而且，用大量聚合物修饰脂质体在细胞内化后具有更高的融合百分率。在细胞内吞后，共振能量转换分析显示在聚合物修饰的脂质体和核内体/或溶酶体膜之间发生了融合。并且，聚合物含量越高内吞后融合百分率越高。这些结果表明，通过细胞内吞途径，在细胞内化后经过与核内体膜融合，聚合物修饰脂质体转运内含物进入胞浆。
, http://www.100md.com 总之，pH-敏脂质体的研究，越来越离不开对细胞内细胞器的相互作用、融合、释放及体内过程的探索，从而有针对性地载药、释药，最终达到靶向目的；药剂学上pH-敏脂质体技术水平的提高也越来越离不开与生化、生理、药理、分子生物学等学科的联系与融合。
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(收稿：1999-01-14 修回：1999-05-27), 百拇医药