单硝酸异山梨酯控释胶囊的药代动力学和生物利用度
作者：王建新 何林 李铜铃 秦永平 邹远高
单位：王建新 (上海市中药研究所，上海 200127)；何林 (四川省人民医院药剂科)；李铜铃 李芚 (华西医科大学药学院)；秦永平 邹远高 (华西医科大学附属第一医院临床药理研究所)
关键词：单硝酸异山梨酯；药代动力学；相对生物利用度；高效液相色谱法
中国新药杂志990808 王建新 何林 李铜铃 秦永平 邹远高
摘要 目的：以单硝酸异山梨酯(5-ISMN)普通片为参比制剂, 研究5-ISMN控释胶囊的药代动力学性质和相对生物利用度。方法：采用自身对照法,12名健康志愿者分别单剂量和多剂量口服控释胶囊与对照片,采用正相高效液相色谱法测定血药浓度变化情况。结果：单剂量口服50 mg控释胶囊与40 mg片剂的AUC分别为(9 594.46±1 590.18)，(7 251.79±1 181.46)ng.h/ml, Cmax分别为(563.50±101.05)，(819.80±127.99)ng/ml, Tmax分别为(6.30±0.67)，(1.33±0.48)h, 相对生物利用度为(94.48±13.43)%。多剂量口服5-ISMN控释胶囊(50 mg/次, qd)其波动度为(118.89±11.66)%，以配对t检验与双单侧t检验对上述参数进行统计分析,两种制剂的AUC无显著性差异(P>0.05), 而其他参数有显著性差异(P<0.05)。结论：两种制剂具生物等效性，单硝酸异山梨酯控释胶囊具有显著的控释特征。
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THE PHARMACOKINETICS AND RELATIVE BIOAVAILABILITY OF ISOSORBIDE-5-MONONITRATE CONTROLLED-RELEASE CAPSULE IN HEALTHY VOLUNTEERS
Wang Jianxin,He Lin,Li Tongling,et al.
(Shanghai Institute of Chinese Materia Medica,Shanghai 200127)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the pharmacokinetics and relative bioavailability of isosorbide-5-mononitrate controlled-release(5-ISMN-CR)capsule in healthy volunteers using a tablet of isosorbide-5-mononitrate as reference.METHODS:The crossover self-control study of single dose and multiple doses was conducted in 12 healthy volunteers.Plasma drug concentrations were determined by HPLC.RESULTS:The pharmacokinetic parameters after single dose of 5-ISMN-CR capsule were:AUC0→∞=(9 594.46±1 590.18) ng.h/ml,Cmax=(563.50±101.05) ng/ml,Tmax=(6.30±0.67)h.The relative bioavailability was(94.48±13.43)%.The degree of fluctuation for steady state of multi-doses was (118.89±11.66)%,which was significantly lower than that of the reference tablet.CONCLUSION:The two formulations were of bioequivalence and the controlled-released capsule obviously possesses the characteristics of its kind.
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KEY WORDS Isosorbide-5-mononitrate；Pharmacokinetics；Bioavailability；HPLC
5-单硝酸异山梨酯(isosorbide-5-mononitrate,5-ISMN)为血管扩张药, 是硝酸异山梨酯的主要活性代谢产物, 用于冠心病的长期治疗和预防心绞痛发作等。为使药效平稳并方便患者用药, 降低服用普通片剂经常产生的耐受性和反跳现象的发生, 研制了5-ISMN控释胶囊。本文采用正相高效液相色谱法分别测定10名健康男性志愿者单剂量口服和12名健康男性志愿者多剂量口服5-ISMN控释胶囊或普通片后的血药浓度, 计算其药代动力学参数和相对生物利用度, 并评价其生物等效性,为临床合理用药提供依据。
材料与方法
1 药品与仪器
1.1 药品及试剂 5-ISMN控释胶囊(乐山市三民药物研究所提供,批号:970701,规格:50 mg/粒);普通片(商品名为鲁南欣康，鲁南制药有限公司产品, 批号:961018,规格:20 mg/片);5-ISMN对照品(乐山三民药物研究所提供);卡马西平(内标,中国药品生物制品检定所提供); 乙腈为色谱纯, 其余试剂均为分析纯。
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1.2 主要仪器 680型高效液相色谱仪(美国Waters公司); 486型可变波长紫外检测器、510型高压泵、7725型进样阀(美国Waters公司); CR-7Ae型色谱数据处理机(日本岛津);YKH-Ⅱ型液体快速混合器(江西医疗器械厂); TGL-16高速离心机(上海医用分析仪器厂)；TOPCON586微机。
2 研究对象
12例健康男性,年龄21～25岁，平均(22.25±1.60)岁；体重58～66kg，平均(62.50±2.15)kg；身高1.64～1.73m，平均(1.70±0.025)m。单剂量试验时选取其中10名,签署“志愿受试者志愿书”，于试验前进行健康检查及肝、肾功能和心电图检查均正常。试验中禁服其他药物,受试期间禁烟、酒、茶及果汁,食用统一饮食。
3 血药浓度测定方法
3.1 色谱条件 色谱柱: Nuclbosil 5 silica 100A柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流动相为二氯甲烷∶正己烷∶乙腈∶甲醇＝92∶4∶1.5∶2.5 ，流速为1.0 ml/min，柱温 30℃，检测波长为234 nm。
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3.2 标准曲线制备方法 精密量取正常人空白血浆0.5 ml共7份,分别加入一系列不同浓度的5-ISMN标准溶液100 μl,混匀,使血浆中药物浓度分别为25，50，100，200，400，800，1 600 ng/ml,分别加入内标工作液100 μl (内含卡马西平12.6 ng)及0.25 mol/L NaOH溶液 100 μl, 混匀后用3.0 ml二氯甲烷旋涡混合萃取3min, 3 000 r/min离心5 min,负压吸弃上层液, 倾二氯甲烷层于尖底试管内,于40℃水浴中通空气流挥干, 残渣溶于100 μl流动相中, 进样50 μl。在上述色谱条件下分离测定,记录色谱图，制备标准曲线。
3.3 血浆样品的处理与测定 精密量取血浆样品0.5 ml,加入重蒸馏水100 μl代替5-ISMN标准溶液,依法测定药物和内标的峰高比, 由标准曲线求出各样品中5-ISMN浓度。
3.4 回收率试验 精密量取空白血浆0.5 ml, 按标准曲线的制备方法, 配制含高、中、低3种不同浓度5-ISMN的血浆样品,依法测定回收率。
, 百拇医药
3.5 精密度 精密量取空白血浆0.5 ml, 按标准曲线的制备方法,配制含高、中、低3种不同浓度5-ISMN的血浆样品,依法测定日内与日间精密度。
4 生物利用度试验的设计与方法
4.1 单剂量相对生物利用度 采用随机分组交叉试验设计方法进行实验。10名志愿受试者随机分为2组,禁食12 h后,供试制剂组与参比制剂组分别以200 ml温开水口服5-ISMN控释胶囊50mg(1粒)或鲁南欣康片40 mg(2片), 服药后在规定时间点肘静脉采血4 ml。取血时间供试制剂组为服药前和服药后1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，9.0，12.0，15.0，24.0，36.0h；参比制剂组为服药前和服药后0.33，0.67，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，10.0，14.0，24.0h。间隔1周后交叉服药,同样时间点静脉采血。服药后2h内禁止饮水, 4h内禁食。
, 百拇医药 4.2 多剂量达稳态时相对生物利用度 采用随机分组交叉试验设计方法进行试验。12名志愿受试者随机分为2组,供试制剂组口服5-ISMN控释胶囊50 mg/次(服药时间为7∶30),qd, 连续服药7d, 于d5从第5次给药起开始计时,由肘静脉采血4 ml，取血时间点为0(服药前)，24.0(服药前)，48.0(服药前)，49.0，50.0，51.0，52.0，53.0，54.0，55.0，57.0，60.0，63.0及72.0 h；参比制剂组服鲁南欣康片20 mg/次(服药时间为7∶30和19∶30),bid, 连续服药6d,于d5从第9次给药起开始计时,由肘静脉采血4 ml，取血时间点为0(服药前)，12.0(服药前)，24.0(服药前)，24.25，24.5，24.75，25.0，25.5，26.0，27.0，28.0，30.0，33.0及36.0 h。间隔1周后交叉给药,同样时间点肘静脉采血。最末一次给药后,2h内禁水,4h内禁食。
血样置肝素化离心管中,离心,分离血浆,于-40℃冷冻保存供测定。
, 百拇医药
结 果
1 血浆中5-ISMN的测定方法
按选定的色谱条件,测得的空白血浆及血浆样品的色谱图见图1。由图可见,血浆中物质几乎不影响5-ISMN与卡马西平的分离测定，血浆中两者保留时间分别为5.6 min与6.2 min。
图1 空白血浆与血浆样品色谱图
测得血浆样品的内标峰高(Hs)和5-ISMN峰高(Hi), 计算Y=Hs/Hi,以Y值为纵坐标, 5-ISMN浓度C(ng/ml)为横坐标,进行线性回归。得标准曲线方程为Y=-0.0001293+0.001286C, r=0.9991。结果表明, 血浆中5-ISMN浓度在25～1 600 ng/ml范围内,浓度与峰高比有良好的线性关系。
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最低检测浓度,以s/n≥3计,为10 ng/ml,最低检出量为2 ng。
计算出血浆中5-ISMN浓度,以测得值与加入值之比计算回收率,结果见表1。3种浓度的平均回收率为(100.17±3.63)%。
表1 回收率试验结果 (n=5) 加入浓度(ng/ml)
测得浓度(ng/ml)
回收率(%)
±s
50.0
49.4
98.9
200.0
, 百拇医药
203.8
101.8
101.17±3.63
800.0
798.6
99.8
取精密度试验项下1d内测得的5-ISMN浓度计算日内相对标准差,以5d内5次测定的浓度计算日间相对标准差, 结果见表2。3种浓度的日内相对标准差≤4.3%,日间相对标准差≤4.8%。表2 精密度试验结果 (n=5) 加入浓度(ng/ml)
日 内
日 间
测得浓度(ng/ml)
, 百拇医药
RSD(%)
测得浓度(ng/ml)
RSD(%)
50.0
49.4
3.1
47.7
4.2
200.0
203.8
4.3
202.4
4.2
, 百拇医药
800.0
798.6
3.4
812.2
4.8
2 单剂量给药药代动力学和相对生物利用度
2.1 药时曲线 见图2。
图2 单剂量口服5-ISMN控释胶囊与鲁南欣康片后的均值药时曲线
2.2 药代动力学参数 结果见表3。
表3 单剂量口服5-ISMN控释胶囊与鲁南欣康片后的药代动力学参数 (±s) 参 数
, 百拇医药
控释胶囊
普通片
A(ng/ml)
2 146.23±1 598.56
920.32±185.17
Ka(1/h)
0.32±0.13
3.03±2.41
Ke(1/h)
0.11±0.02
0.12±0.02
V/F(L)
, 百拇医药
0.05±0.01
0.05±0.01
t1/2(h)
6.64±1.67
5.76±0.84
Tmax(h)
6.30±0.67
1.33±0.48
Cmax(ng/ml)
563.50±101.05
819.80±127.99
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AUC0→∞(ng.h/ml)
9 594.46±1 590.18
7 251.79±1 181.46
MRT(h)
13.15±1.71
8.85±1.37
2.3 相对生物利用度 以鲁南欣康为标准参比制剂, 以
计算控释胶囊的相对生物利用度为(94.48±13.43)%。
3 多剂量达稳态时相对生物利用度
, 百拇医药
3.1 药时曲线 见图3。
图3 多剂量口服5-ISMN控释胶囊与鲁南欣康片达稳态药时曲线
3.2 药代动力学参数 对图3中最末一个给药周期的数据进行处理, 采用非室模型, 以统计矩计算AUC0→τ;Cssmax和Tmax根据实际血药浓度经时数据读出;以实测的4个谷浓度平均值计算Cssmin;以Cav=AUC0→τ/τ计算平均稳态血药浓度; 分别以DF(%)=[(Cssmax-Cssmin)/Cav]×100%和FI(%)=2(Cssmax-Cssmin)/(Cssmax+Cssmin)×100%计算多剂量口服5-ISMN控释胶囊和鲁南欣康达稳态时血药浓度的波动度和波动系数,结果见表4。
, 百拇医药
表4 多剂量口服5-ISMN控释胶囊与鲁南欣康片达稳态时药代动力学参数 (±s) 参 数
控释胶囊
普通片
AUC0→τ(ng*h/ml)
9 938.96±1 612.18
4 083.40±680.13
Cssmax(ng/ml)
659.23±93.12
747.10±159.63
, 百拇医药
Cssmin(ng/ml)
168.42±38.04
144.81±24.08
Tmax(h)
5.42±1.16
0.96±0.37
Cav(ng/ml)
414.12±67.17
340.28±56.68
DF(%)
118.89±11.66
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176.26±33.02
FI(%)
118.82±13.08
133.15±15.56
3.3 相对生物利用度 F为(102.71±9.16)%。
4 统计分析
对单剂量和多剂量口服5-ISMN控释胶囊达稳态后所得药代动力学参数分别用配对t检验和双单侧t检验进行统计分析，其中双单侧t检验时,AUC，Cmax，Cmin，Cav等参数均先经对数转换后再进行处理。经F检验(α=0.05),无论是单剂量或多剂量给药, 两种制剂的AUC均无显著性差异(P>0.05), 说明两种制剂具生物等效性。而其他参数如Cmax，Tmax和FI等均存在显著性差异(P<0.05)。
, 百拇医药
讨 论
单剂量给药时, 与鲁南欣康相比,5-ISMN控释胶囊在保持生物等效的同时, 峰浓度显著降低而达峰时间明显延长, 而且起效迅速, 口服后1h已达到有效血药浓度范围, 并在较长时间内维持此浓度。多剂量给药达稳态时, 控释胶囊的峰浓度显著降低而谷浓度明显升高,波动系数显著降低, 间隔24h给药的平均稳态血药浓度显著高于5-ISMN的有效血药浓度100 ng/ml。因此,5-ISMN控释胶囊在体内具有明显的控释特征, 既可保持最佳治疗效果,又能降低不良反应,使峰谷波动效应明显减小。所以可以认为,5-ISMN控释胶囊50 mg/次,qd给药, 其治疗效果优于普通片20 mg/次,bid给药, 且可大大方便患者长期用药, 解决由于服药间隔和服药剂量掌握不严造成的疗效不佳等诸多问题。控释胶囊与普通片的消除半衰期无显著性差异, 说明它主要是通过控制有效成分的释放而减缓吸收, 从而达到控释的目的。
由于5-ISMN的热不稳定性和低的血浆浓度, 近年来国内外多采用毛细管气相色谱-电子捕获检测器进行测定[1～7], 这些方法不仅对仪器有较高的要求, 而且多需衍生化, 提取条件下干扰较大, 操作繁琐。本实验首次采用正相高效液相色谱-紫外检测器测定5-ISMN的体内血药浓度,方法简便, 仪器普及, 而且分析耗时短, 萃取率高, 内标易得,血样中无其他组分干扰,方法的灵敏度、准确度和重现性均能满足血药浓度测定的要求, 结果令人满意。
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波动度和波动系数分别是美国FDA和我国卫生部推荐使用的评价制剂血药浓度波动情况的计算公式, 本研究分别以两个公式进行计算, 结果存在一定差异, 我们认为波动度的计算结果更能反应制剂的实际波动情况。
参考文献
1 夏桂珠,傅贻柯, 董善年, 等. 毛细管气相色谱电子捕获法测定人血浆中单硝酸异山梨醇酯的浓度和药代动力学参数. 药学学报, 1994,29(8)∶634
2 赵奕, 周莹, 袁虹, 等. 5-单硝酸异山梨醇酯在正常人体的药代动力学和生物利用度的研究. 中国临床药理学杂志, 1995,11(1)∶33
3 Marzo A, Treffner. Gas-liquid chromatographic determination of isosorbide 5-mononitrate derivatized with perfluorinated anhydrides for pharmacokinetic and bioavailability investigation.J Chromatogr, 1985,315(2)∶390
, 百拇医药
4 Straehl P, Gamleazzi RL. Determination of isosorbide 5-mononitrate in human plasma by capillary colomn gas chromatography.J Pharm Sci,1984,73(9)∶1317
5 Michel G, Cefibra Z. Determination of Isosorbide dinitrate and its metabolites in plasma by gas chromatography on a capillary column with electron capture detection.J Chromatogr,1989,493(1)∶188
6 Hutt V,Theodor R,Pabst G,et al. Evaluation of bioavailability and pharmacokinetics of two Isosorbide-5-mononitrate preparations in healthy volunteers. J Clin Pharmacol, 1992,32(6)∶553
7 Lanfen H, Leitold M, Wildfeuer A. Comparative pharmacokinetics isosorbide nitrates after repeated doses of sustained release isosorbide dinitrate. Arzneim.Forsch./Drug Res，1988,38(9)∶1336
(收稿：1998-09-11 修回：1998-10-28), 百拇医药
单位：王建新 (上海市中药研究所，上海 200127)；何林 (四川省人民医院药剂科)；李铜铃 李芚 (华西医科大学药学院)；秦永平 邹远高 (华西医科大学附属第一医院临床药理研究所)
关键词：单硝酸异山梨酯；药代动力学；相对生物利用度；高效液相色谱法
中国新药杂志990808 王建新 何林 李铜铃 秦永平 邹远高
摘要 目的：以单硝酸异山梨酯(5-ISMN)普通片为参比制剂, 研究5-ISMN控释胶囊的药代动力学性质和相对生物利用度。方法：采用自身对照法,12名健康志愿者分别单剂量和多剂量口服控释胶囊与对照片,采用正相高效液相色谱法测定血药浓度变化情况。结果：单剂量口服50 mg控释胶囊与40 mg片剂的AUC分别为(9 594.46±1 590.18)，(7 251.79±1 181.46)ng.h/ml, Cmax分别为(563.50±101.05)，(819.80±127.99)ng/ml, Tmax分别为(6.30±0.67)，(1.33±0.48)h, 相对生物利用度为(94.48±13.43)%。多剂量口服5-ISMN控释胶囊(50 mg/次, qd)其波动度为(118.89±11.66)%，以配对t检验与双单侧t检验对上述参数进行统计分析,两种制剂的AUC无显著性差异(P>0.05), 而其他参数有显著性差异(P<0.05)。结论：两种制剂具生物等效性，单硝酸异山梨酯控释胶囊具有显著的控释特征。
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THE PHARMACOKINETICS AND RELATIVE BIOAVAILABILITY OF ISOSORBIDE-5-MONONITRATE CONTROLLED-RELEASE CAPSULE IN HEALTHY VOLUNTEERS
Wang Jianxin,He Lin,Li Tongling,et al.
(Shanghai Institute of Chinese Materia Medica,Shanghai 200127)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the pharmacokinetics and relative bioavailability of isosorbide-5-mononitrate controlled-release(5-ISMN-CR)capsule in healthy volunteers using a tablet of isosorbide-5-mononitrate as reference.METHODS:The crossover self-control study of single dose and multiple doses was conducted in 12 healthy volunteers.Plasma drug concentrations were determined by HPLC.RESULTS:The pharmacokinetic parameters after single dose of 5-ISMN-CR capsule were:AUC0→∞=(9 594.46±1 590.18) ng.h/ml,Cmax=(563.50±101.05) ng/ml,Tmax=(6.30±0.67)h.The relative bioavailability was(94.48±13.43)%.The degree of fluctuation for steady state of multi-doses was (118.89±11.66)%,which was significantly lower than that of the reference tablet.CONCLUSION:The two formulations were of bioequivalence and the controlled-released capsule obviously possesses the characteristics of its kind.
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KEY WORDS Isosorbide-5-mononitrate；Pharmacokinetics；Bioavailability；HPLC
5-单硝酸异山梨酯(isosorbide-5-mononitrate,5-ISMN)为血管扩张药, 是硝酸异山梨酯的主要活性代谢产物, 用于冠心病的长期治疗和预防心绞痛发作等。为使药效平稳并方便患者用药, 降低服用普通片剂经常产生的耐受性和反跳现象的发生, 研制了5-ISMN控释胶囊。本文采用正相高效液相色谱法分别测定10名健康男性志愿者单剂量口服和12名健康男性志愿者多剂量口服5-ISMN控释胶囊或普通片后的血药浓度, 计算其药代动力学参数和相对生物利用度, 并评价其生物等效性,为临床合理用药提供依据。
材料与方法
1 药品与仪器
1.1 药品及试剂 5-ISMN控释胶囊(乐山市三民药物研究所提供,批号:970701,规格:50 mg/粒);普通片(商品名为鲁南欣康，鲁南制药有限公司产品, 批号:961018,规格:20 mg/片);5-ISMN对照品(乐山三民药物研究所提供);卡马西平(内标,中国药品生物制品检定所提供); 乙腈为色谱纯, 其余试剂均为分析纯。
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1.2 主要仪器 680型高效液相色谱仪(美国Waters公司); 486型可变波长紫外检测器、510型高压泵、7725型进样阀(美国Waters公司); CR-7Ae型色谱数据处理机(日本岛津);YKH-Ⅱ型液体快速混合器(江西医疗器械厂); TGL-16高速离心机(上海医用分析仪器厂)；TOPCON586微机。
2 研究对象
12例健康男性,年龄21～25岁，平均(22.25±1.60)岁；体重58～66kg，平均(62.50±2.15)kg；身高1.64～1.73m，平均(1.70±0.025)m。单剂量试验时选取其中10名,签署“志愿受试者志愿书”，于试验前进行健康检查及肝、肾功能和心电图检查均正常。试验中禁服其他药物,受试期间禁烟、酒、茶及果汁,食用统一饮食。
3 血药浓度测定方法
3.1 色谱条件 色谱柱: Nuclbosil 5 silica 100A柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流动相为二氯甲烷∶正己烷∶乙腈∶甲醇＝92∶4∶1.5∶2.5 ，流速为1.0 ml/min，柱温 30℃，检测波长为234 nm。
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3.2 标准曲线制备方法 精密量取正常人空白血浆0.5 ml共7份,分别加入一系列不同浓度的5-ISMN标准溶液100 μl,混匀,使血浆中药物浓度分别为25，50，100，200，400，800，1 600 ng/ml,分别加入内标工作液100 μl (内含卡马西平12.6 ng)及0.25 mol/L NaOH溶液 100 μl, 混匀后用3.0 ml二氯甲烷旋涡混合萃取3min, 3 000 r/min离心5 min,负压吸弃上层液, 倾二氯甲烷层于尖底试管内,于40℃水浴中通空气流挥干, 残渣溶于100 μl流动相中, 进样50 μl。在上述色谱条件下分离测定,记录色谱图，制备标准曲线。
3.3 血浆样品的处理与测定 精密量取血浆样品0.5 ml,加入重蒸馏水100 μl代替5-ISMN标准溶液,依法测定药物和内标的峰高比, 由标准曲线求出各样品中5-ISMN浓度。
3.4 回收率试验 精密量取空白血浆0.5 ml, 按标准曲线的制备方法, 配制含高、中、低3种不同浓度5-ISMN的血浆样品,依法测定回收率。
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3.5 精密度 精密量取空白血浆0.5 ml, 按标准曲线的制备方法,配制含高、中、低3种不同浓度5-ISMN的血浆样品,依法测定日内与日间精密度。
4 生物利用度试验的设计与方法
4.1 单剂量相对生物利用度 采用随机分组交叉试验设计方法进行实验。10名志愿受试者随机分为2组,禁食12 h后,供试制剂组与参比制剂组分别以200 ml温开水口服5-ISMN控释胶囊50mg(1粒)或鲁南欣康片40 mg(2片), 服药后在规定时间点肘静脉采血4 ml。取血时间供试制剂组为服药前和服药后1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，9.0，12.0，15.0，24.0，36.0h；参比制剂组为服药前和服药后0.33，0.67，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，10.0，14.0，24.0h。间隔1周后交叉服药,同样时间点静脉采血。服药后2h内禁止饮水, 4h内禁食。
, 百拇医药 4.2 多剂量达稳态时相对生物利用度 采用随机分组交叉试验设计方法进行试验。12名志愿受试者随机分为2组,供试制剂组口服5-ISMN控释胶囊50 mg/次(服药时间为7∶30),qd, 连续服药7d, 于d5从第5次给药起开始计时,由肘静脉采血4 ml，取血时间点为0(服药前)，24.0(服药前)，48.0(服药前)，49.0，50.0，51.0，52.0，53.0，54.0，55.0，57.0，60.0，63.0及72.0 h；参比制剂组服鲁南欣康片20 mg/次(服药时间为7∶30和19∶30),bid, 连续服药6d,于d5从第9次给药起开始计时,由肘静脉采血4 ml，取血时间点为0(服药前)，12.0(服药前)，24.0(服药前)，24.25，24.5，24.75，25.0，25.5，26.0，27.0，28.0，30.0，33.0及36.0 h。间隔1周后交叉给药,同样时间点肘静脉采血。最末一次给药后,2h内禁水,4h内禁食。
血样置肝素化离心管中,离心,分离血浆,于-40℃冷冻保存供测定。
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结 果
1 血浆中5-ISMN的测定方法
按选定的色谱条件,测得的空白血浆及血浆样品的色谱图见图1。由图可见,血浆中物质几乎不影响5-ISMN与卡马西平的分离测定，血浆中两者保留时间分别为5.6 min与6.2 min。
图1 空白血浆与血浆样品色谱图
测得血浆样品的内标峰高(Hs)和5-ISMN峰高(Hi), 计算Y=Hs/Hi,以Y值为纵坐标, 5-ISMN浓度C(ng/ml)为横坐标,进行线性回归。得标准曲线方程为Y=-0.0001293+0.001286C, r=0.9991。结果表明, 血浆中5-ISMN浓度在25～1 600 ng/ml范围内,浓度与峰高比有良好的线性关系。
, 百拇医药
最低检测浓度,以s/n≥3计,为10 ng/ml,最低检出量为2 ng。
计算出血浆中5-ISMN浓度,以测得值与加入值之比计算回收率,结果见表1。3种浓度的平均回收率为(100.17±3.63)%。
表1 回收率试验结果 (n=5) 加入浓度(ng/ml)
测得浓度(ng/ml)
回收率(%)
±s50.0
49.4
98.9
200.0
, 百拇医药
203.8
101.8
101.17±3.63
800.0
798.6
99.8
取精密度试验项下1d内测得的5-ISMN浓度计算日内相对标准差,以5d内5次测定的浓度计算日间相对标准差, 结果见表2。3种浓度的日内相对标准差≤4.3%,日间相对标准差≤4.8%。表2 精密度试验结果 (n=5) 加入浓度(ng/ml)
日 内
日 间
测得浓度(ng/ml)
, 百拇医药
RSD(%)
测得浓度(ng/ml)
RSD(%)
50.0
49.4
3.1
47.7
4.2
200.0
203.8
4.3
202.4
4.2
, 百拇医药
800.0
798.6
3.4
812.2
4.8
2 单剂量给药药代动力学和相对生物利用度
2.1 药时曲线 见图2。
图2 单剂量口服5-ISMN控释胶囊与鲁南欣康片后的均值药时曲线
2.2 药代动力学参数 结果见表3。
表3 单剂量口服5-ISMN控释胶囊与鲁南欣康片后的药代动力学参数 (
±s) 参 数, 百拇医药
控释胶囊
普通片
A(ng/ml)
2 146.23±1 598.56
920.32±185.17
Ka(1/h)
0.32±0.13
3.03±2.41
Ke(1/h)
0.11±0.02
0.12±0.02
V/F(L)
, 百拇医药
0.05±0.01
0.05±0.01
t1/2(h)
6.64±1.67
5.76±0.84
Tmax(h)
6.30±0.67
1.33±0.48
Cmax(ng/ml)
563.50±101.05
819.80±127.99
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AUC0→∞(ng.h/ml)
9 594.46±1 590.18
7 251.79±1 181.46
MRT(h)
13.15±1.71
8.85±1.37
2.3 相对生物利用度 以鲁南欣康为标准参比制剂, 以
计算控释胶囊的相对生物利用度为(94.48±13.43)%。3 多剂量达稳态时相对生物利用度
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3.1 药时曲线 见图3。
图3 多剂量口服5-ISMN控释胶囊与鲁南欣康片达稳态药时曲线
3.2 药代动力学参数 对图3中最末一个给药周期的数据进行处理, 采用非室模型, 以统计矩计算AUC0→τ;Cssmax和Tmax根据实际血药浓度经时数据读出;以实测的4个谷浓度平均值计算Cssmin;以Cav=AUC0→τ/τ计算平均稳态血药浓度; 分别以DF(%)=[(Cssmax-Cssmin)/Cav]×100%和FI(%)=2(Cssmax-Cssmin)/(Cssmax+Cssmin)×100%计算多剂量口服5-ISMN控释胶囊和鲁南欣康达稳态时血药浓度的波动度和波动系数,结果见表4。
, 百拇医药
表4 多剂量口服5-ISMN控释胶囊与鲁南欣康片达稳态时药代动力学参数 (
±s) 参 数控释胶囊
普通片
AUC0→τ(ng*h/ml)
9 938.96±1 612.18
4 083.40±680.13
Cssmax(ng/ml)
659.23±93.12
747.10±159.63
, 百拇医药
Cssmin(ng/ml)
168.42±38.04
144.81±24.08
Tmax(h)
5.42±1.16
0.96±0.37
Cav(ng/ml)
414.12±67.17
340.28±56.68
DF(%)
118.89±11.66
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176.26±33.02
FI(%)
118.82±13.08
133.15±15.56
3.3 相对生物利用度 F为(102.71±9.16)%。
4 统计分析
对单剂量和多剂量口服5-ISMN控释胶囊达稳态后所得药代动力学参数分别用配对t检验和双单侧t检验进行统计分析，其中双单侧t检验时,AUC，Cmax，Cmin，Cav等参数均先经对数转换后再进行处理。经F检验(α=0.05),无论是单剂量或多剂量给药, 两种制剂的AUC均无显著性差异(P>0.05), 说明两种制剂具生物等效性。而其他参数如Cmax，Tmax和FI等均存在显著性差异(P<0.05)。
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讨 论
单剂量给药时, 与鲁南欣康相比,5-ISMN控释胶囊在保持生物等效的同时, 峰浓度显著降低而达峰时间明显延长, 而且起效迅速, 口服后1h已达到有效血药浓度范围, 并在较长时间内维持此浓度。多剂量给药达稳态时, 控释胶囊的峰浓度显著降低而谷浓度明显升高,波动系数显著降低, 间隔24h给药的平均稳态血药浓度显著高于5-ISMN的有效血药浓度100 ng/ml。因此,5-ISMN控释胶囊在体内具有明显的控释特征, 既可保持最佳治疗效果,又能降低不良反应,使峰谷波动效应明显减小。所以可以认为,5-ISMN控释胶囊50 mg/次,qd给药, 其治疗效果优于普通片20 mg/次,bid给药, 且可大大方便患者长期用药, 解决由于服药间隔和服药剂量掌握不严造成的疗效不佳等诸多问题。控释胶囊与普通片的消除半衰期无显著性差异, 说明它主要是通过控制有效成分的释放而减缓吸收, 从而达到控释的目的。
由于5-ISMN的热不稳定性和低的血浆浓度, 近年来国内外多采用毛细管气相色谱-电子捕获检测器进行测定[1～7], 这些方法不仅对仪器有较高的要求, 而且多需衍生化, 提取条件下干扰较大, 操作繁琐。本实验首次采用正相高效液相色谱-紫外检测器测定5-ISMN的体内血药浓度,方法简便, 仪器普及, 而且分析耗时短, 萃取率高, 内标易得,血样中无其他组分干扰,方法的灵敏度、准确度和重现性均能满足血药浓度测定的要求, 结果令人满意。
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波动度和波动系数分别是美国FDA和我国卫生部推荐使用的评价制剂血药浓度波动情况的计算公式, 本研究分别以两个公式进行计算, 结果存在一定差异, 我们认为波动度的计算结果更能反应制剂的实际波动情况。
参考文献
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2 赵奕, 周莹, 袁虹, 等. 5-单硝酸异山梨醇酯在正常人体的药代动力学和生物利用度的研究. 中国临床药理学杂志, 1995,11(1)∶33
3 Marzo A, Treffner. Gas-liquid chromatographic determination of isosorbide 5-mononitrate derivatized with perfluorinated anhydrides for pharmacokinetic and bioavailability investigation.J Chromatogr, 1985,315(2)∶390
, 百拇医药
4 Straehl P, Gamleazzi RL. Determination of isosorbide 5-mononitrate in human plasma by capillary colomn gas chromatography.J Pharm Sci,1984,73(9)∶1317
5 Michel G, Cefibra Z. Determination of Isosorbide dinitrate and its metabolites in plasma by gas chromatography on a capillary column with electron capture detection.J Chromatogr,1989,493(1)∶188
6 Hutt V,Theodor R,Pabst G,et al. Evaluation of bioavailability and pharmacokinetics of two Isosorbide-5-mononitrate preparations in healthy volunteers. J Clin Pharmacol, 1992,32(6)∶553
7 Lanfen H, Leitold M, Wildfeuer A. Comparative pharmacokinetics isosorbide nitrates after repeated doses of sustained release isosorbide dinitrate. Arzneim.Forsch./Drug Res，1988,38(9)∶1336
(收稿：1998-09-11 修回：1998-10-28), 百拇医药