新的基因工程药物骨形成蛋白-2的研究应用进展
作者：陈执中
单位：陈执中(上海医科大学，上海 200032)
关键词：骨形成蛋白-2；基因表达；药效学；临床应用
新的基因工程药物骨形成蛋白
摘 要：综述骨形成蛋白类(BMPs)基因工程药物的发展、分类，骨形成蛋白-2(BMP-2)的基因表达及蛋白纯化、生物作用和药效学研究以及其在骨科和口腔科许多病种治疗上的应用进展。
PROGRESS IN STUDIES AND APPLICATIONS OF RECOMBINANT HUMAN BONE MORPHOGENETIC PROTEIN-2，A NEW BIOTECHNOLOGICAL DRUG
Chen Zhizhong
, 百拇医药
(Shanghai Medical University, Shanghai 200032)
ABSTRACT：The development in bone morphogenetic proteins, recombi nant DNA technology and in pharmacodynamics and clinical application studies of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) are reviewed.
KEY WORDS：Bone morphogenetic protein-2;Gene expression; Pharmaco dynamics; Clinical application▲
人类机体的免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌小分子的多肽类因子，它们调节多种细胞的生理功能和免疫应答，这些因子统称为细胞因子。主要有集落刺激因子类(CSFs)、干扰素类(INF)、白细胞介素(IL)以及各种生长因子素(growth factors)等。
, 百拇医药
骨形成蛋白类(BMPs)是转化生长因子β(TGF-β)家族的成员，属于二硫键交联的生长和分化因子。骨形成蛋白-2(BMP-2)是其中的一种，对骨组织形成、生长和修复有促进作用，是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子。近年来，随着基因工程药物的不断发展，BMP-2的研究和应用更有了新的进展。
1 BMPs药物的发展及分类
1988年Wozney等[1]发表了骨形成调节剂类的分子克隆和活性。美国Genetic I nstitute发表了骨形成蛋白1-7(BMP1-7)核苷酸序列后，BMPs的研究有了长足的发展。
1989年Wozney[2]对BMPs的种类作了综述，至少有6种人骨形成蛋白显示骨形成活性，BMP- 2(又称BMP-2A)，BMP-4(又称BMP-2B)，BMP-5，BMP-6，BMP-7(也归类于成骨蛋白(OP- 1))及BMP-8(OP-2)。另外，新近发现的许多分子包括生长分化因子(GDFs) ，主要的有GDF-1，GDF-6及GDF-7(也是BMP-9)也可以考虑包括在骨形成蛋白类[2, 3]。
, http://www.100md.com
1996年Inada等[4]报告了BMPs中的新的成员--骨形成蛋白-12(BMP-12)及骨形成蛋白-13(BMP-13)。
C2C12及L-6肌芽与BMP-12及BMP-13培养的体外试验，结果BMP-12和BMP-13对肌浆蛋白的分化作用的抑制效应与BMP-2相似，但其效力低于BMP-2。与BMP-2不同, BMP-12及BMP- 13不能引起肌芽分化为成骨细胞。
2 BMP-2的基因表达及蛋白质纯化
构建大鼠成骨细胞cDNA文库，用小鼠BMP-2 genomic DNA exon 3 DNA探针筛选该cDNA 文库，进行BMP-2 cDNA核苷酸序列分析。将BMP-2 cDNA克隆到CMV5真核细胞表达载体上，然后将BMP-2 cDNA表达载体转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，克隆和筛选高表达细胞株，用N orthern和Western blot分析法检测BMP-2 mRNA和蛋白质的表达。收集表达BMP-2的CHO培养基用亲和色谱法、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法及反相高效液相色谱法进行纯化。
, 百拇医药
重组人骨形成蛋白(rhBMP-2)前体蛋白质由396个氨基酸残基组成，氨基酸序列见图1 [1]。
图1 从cDNA克隆的BMP-2氨基酸序列
3 rhBMP-2的生物作用和药效学研究
1991年Takuwa等[5]报道了在成骨细胞MC373-E1培养基中BMP-2刺激碱性磷酸酶活性和胶原合成的研究结果。成骨细胞用BMP-2处理48h，产生增加细胞中磷酸酶活性。在BMP-2浓度低至20 ng/ml即显示此刺激作用。在β-雌二醇、地塞米松存在时增进了BMP-2对碱性磷酸酶活性的增加同样也增进了胶原的合成。这些结果表明∶BMP-2直接作用于成骨细胞，刺激成骨细胞表观型的表达。
, 百拇医药
1995年Gao等[6]发表了BMP对人牙周类成骨细胞的诱发效应，研究表明BMP具有以下功能：①在非骨组织如肌肉中骨的形成；②促进人牙细胞的增长和转化；③诱发骨性牙质和规律的小管牙质两者的早期形成。此外，当BMP植入在牙周缺损，刺激再生牙周组织。Gao等用免疫组织化学方法研究了体外牙周类成纤细胞以探索由BMP诱发效应，结果说明 BMP不仅有再生性而且具有对未分化的牙周间质细胞的诱发效应。
重组BMP-2在许多动物模型中显示显著的成骨活性[7]。rhBMP-2已进行了广泛的药效学研究，并在几种动物模型的骨形成中作了评价。rhBMP-2对关键大小的骨缺损的愈合疗效从大鼠的股骨至大动物如羊的股骨及犬桡骨[8～10]。在上颌面区域rhBMP -2在犬及猴子的下颌骨可诱发骨的生长和愈合骨的缺损[11，12]，此外犬的模型中可能加强牙槽嵴[13]。1996年Boyne[14]对rhBMP-2用成年雄性猕猴属簇生的恒河猴进行的动物试验也表明rhBMP-2对恒河猴的关键大小的半下颌切除缺损能产生骨的再生。Schimanole等[15]曾对rhBMP-2对动物脊柱的融合进行了评价。
, http://www.100md.com
4 rhBMP-2的临床应用
1994年Sailer等[16]总结了他们用rhBMP-2在面部和颅面的145例患者中的应用。用髂骨的骨移植及钛螺丝植入物前期修复的再造。全部患者是解决骨或软组织条件的病例，在6～8 .5月后从临床实验及CT图像进行鉴定，结果表明rhBMP-2能明确地诱发骨。
1996年国外已广泛应用于以下几方面：①骨科：包括大块骨缺损的治疗、植入固定、整形外科应用、脊柱融合、难愈合性骨折及股骨坏死的治疗；②口腔科：包括牙周再造、牙髓组织修复、根管疗法及颅面颌骨再造等。此外，由于rhBMP-2的作用并不局限于骨组织，现在发现在心脏、脑组织、肾上腺等机体许多其他部位也有BMP的合成，因此rhBMP对机体会有更广泛的作用，已经发现BMP-2对动物的早期胚胎发育和细胞的定向分化有重要作用[17]。
5 讨论
, http://www.100md.com
rhBMP-2的研究和应用历史虽短，但由于其具有骨形成的作用，在骨科和口腔科许多疾病的治疗上已获得了广泛的应用，据发现对动物的早期胚胎发育和细胞的定向分化具有重要的作用，因而rhBMP-2在临床上将有其广阔的应用前景。
参考文献：
[1]Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ,et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities..Science, 1988, 242(12) ∶1528
[2]Wozney JM. Bone morphogenetic proteins. Prog Growth Factor Res, 1989, 1(4)∶267
[3]Wozney JM. Bone morphogenetic protein and their gene expression. In: Noda M, ed. Cellular and molecular biology of bone. New York: Academic press, 1993.131
, http://www.100md.com
[4]Inada M, Katagiri T, Akiyama S, et al. Bone morphogenetic protein-12 and -13 inhibit terminal differentiation of myoblasts, but do not induce their differentiation into osteoblasts. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 222(2)∶ 317
[5]Takuwa Y, Ohse C, Wang EA, et al. Bone morphogenetic protein-2 stimulating alkaline phosphatase activity and collagen synthesis in cultured osteoblatic cells, MC3-El. Biochem Biophys Res Commun, 1991, 174(1)∶96
, 百拇医药
[6]Gao Y, Yang L, Fang YR, et al. The inductive effect of bone morphogenetic protein (BMP) on human periodontal fibroplst-like cells vitro. J Osaka Dent Univ, 1995, 29(1)∶9
[7]Wozney JM. BMPs roles in bone development and repair. Portland Bone Symposium, Aug 2-5, 1995, Portland Ore.
[8]Yasko AW, Lan JM, Felliinger EJ,et al. The healing of seg mental bone defects induced by recombinant human bone morphogenetic protein (rhB MP-2). A radiographic, histological and biomechanical study in rats. J Bone Joint Surg, 1992, 74A(4)∶659
, 百拇医药
[9]Kirker-Head CA, Gerhart TN, Schelling SH, et al. Long-tem healing of bone using recombinant human bone morphogenetic protein-2. Clin Or thop, 1995, (318)∶222
[10]Sciadini MF, Dawason JM, Berman LM, et al.Dose-respones characteristics of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) in a canine segmental defect model. In: Transactions of the 41st Annual meeting of orthopeadic Reserch Society: February 13-1, Orlando, Fla 5594
, 百拇医药
[11]Toriumi DM, Kotler HS, Lurenberg DP, et al. Mandibular re construction with a recombinant bone-inducing factor. Arch Otolaryngol Head Neck Sug, 1991,117(11)∶1101
[12]Boyne PJ. Reconstruction of discontinuity mandibular defects in rhesus monkeys using rhBMP-2. J Maxiilofac Surg, 1995, 53(Suppl 4)∶S9 2
[13]Sigurdsson TJ, Lee MB, Kubota K, et al. Periodontal repai rin dogs: recombinant human bone morphogenetic protein-2 significantly enhance s periodontal regeneration. J Periodontal, 1995, 66(2)∶131
, 百拇医药
[14]Boyne PJ. Animal studies of application of rhBMP-2 in maxill ofacial reconstruction. Bone, 1996, 19(Suppl 1)∶S83
[15]Schimanole J, Boden S, Hutton W. Experimental spinal fusion with recombinant human bone morphogenetic protein-2. Spine, 1995, 20(12)∶ 1326
[16]Sailer HF, Kolb E. Application of purified bone morphogeneti cprotein(BMP) in cranio-maxillo-facial surgery. BMP in compronised surgical re construction using titanium implants. J Craniomuxillofac Sug, 1994, 22(1)∶ 2
[17]Furata Y, Piston DW, Hogan BL. Bone morphogenetic proteins (BMPs) as regulator for dorsal forebrain development. Development, 1997, 124( 11)∶2203
收稿日期：1999-10-11
修稿日期：1999-11-12, 百拇医药
单位：陈执中(上海医科大学，上海 200032)
关键词：骨形成蛋白-2；基因表达；药效学；临床应用
新的基因工程药物骨形成蛋白
摘 要：综述骨形成蛋白类(BMPs)基因工程药物的发展、分类，骨形成蛋白-2(BMP-2)的基因表达及蛋白纯化、生物作用和药效学研究以及其在骨科和口腔科许多病种治疗上的应用进展。
PROGRESS IN STUDIES AND APPLICATIONS OF RECOMBINANT HUMAN BONE MORPHOGENETIC PROTEIN-2，A NEW BIOTECHNOLOGICAL DRUG
Chen Zhizhong
, 百拇医药
(Shanghai Medical University, Shanghai 200032)
ABSTRACT：The development in bone morphogenetic proteins, recombi nant DNA technology and in pharmacodynamics and clinical application studies of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) are reviewed.
KEY WORDS：Bone morphogenetic protein-2;Gene expression; Pharmaco dynamics; Clinical application▲
人类机体的免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌小分子的多肽类因子，它们调节多种细胞的生理功能和免疫应答，这些因子统称为细胞因子。主要有集落刺激因子类(CSFs)、干扰素类(INF)、白细胞介素(IL)以及各种生长因子素(growth factors)等。
, 百拇医药
骨形成蛋白类(BMPs)是转化生长因子β(TGF-β)家族的成员，属于二硫键交联的生长和分化因子。骨形成蛋白-2(BMP-2)是其中的一种，对骨组织形成、生长和修复有促进作用，是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子。近年来，随着基因工程药物的不断发展，BMP-2的研究和应用更有了新的进展。
1 BMPs药物的发展及分类
1988年Wozney等[1]发表了骨形成调节剂类的分子克隆和活性。美国Genetic I nstitute发表了骨形成蛋白1-7(BMP1-7)核苷酸序列后，BMPs的研究有了长足的发展。
1989年Wozney[2]对BMPs的种类作了综述，至少有6种人骨形成蛋白显示骨形成活性，BMP- 2(又称BMP-2A)，BMP-4(又称BMP-2B)，BMP-5，BMP-6，BMP-7(也归类于成骨蛋白(OP- 1))及BMP-8(OP-2)。另外，新近发现的许多分子包括生长分化因子(GDFs) ，主要的有GDF-1，GDF-6及GDF-7(也是BMP-9)也可以考虑包括在骨形成蛋白类[2, 3]。
, http://www.100md.com
1996年Inada等[4]报告了BMPs中的新的成员--骨形成蛋白-12(BMP-12)及骨形成蛋白-13(BMP-13)。
C2C12及L-6肌芽与BMP-12及BMP-13培养的体外试验，结果BMP-12和BMP-13对肌浆蛋白的分化作用的抑制效应与BMP-2相似，但其效力低于BMP-2。与BMP-2不同, BMP-12及BMP- 13不能引起肌芽分化为成骨细胞。
2 BMP-2的基因表达及蛋白质纯化
构建大鼠成骨细胞cDNA文库，用小鼠BMP-2 genomic DNA exon 3 DNA探针筛选该cDNA 文库，进行BMP-2 cDNA核苷酸序列分析。将BMP-2 cDNA克隆到CMV5真核细胞表达载体上，然后将BMP-2 cDNA表达载体转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，克隆和筛选高表达细胞株，用N orthern和Western blot分析法检测BMP-2 mRNA和蛋白质的表达。收集表达BMP-2的CHO培养基用亲和色谱法、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法及反相高效液相色谱法进行纯化。
, 百拇医药
重组人骨形成蛋白(rhBMP-2)前体蛋白质由396个氨基酸残基组成，氨基酸序列见图1 [1]。
图1 从cDNA克隆的BMP-2氨基酸序列
3 rhBMP-2的生物作用和药效学研究
1991年Takuwa等[5]报道了在成骨细胞MC373-E1培养基中BMP-2刺激碱性磷酸酶活性和胶原合成的研究结果。成骨细胞用BMP-2处理48h，产生增加细胞中磷酸酶活性。在BMP-2浓度低至20 ng/ml即显示此刺激作用。在β-雌二醇、地塞米松存在时增进了BMP-2对碱性磷酸酶活性的增加同样也增进了胶原的合成。这些结果表明∶BMP-2直接作用于成骨细胞，刺激成骨细胞表观型的表达。
, 百拇医药
1995年Gao等[6]发表了BMP对人牙周类成骨细胞的诱发效应，研究表明BMP具有以下功能：①在非骨组织如肌肉中骨的形成；②促进人牙细胞的增长和转化；③诱发骨性牙质和规律的小管牙质两者的早期形成。此外，当BMP植入在牙周缺损，刺激再生牙周组织。Gao等用免疫组织化学方法研究了体外牙周类成纤细胞以探索由BMP诱发效应，结果说明 BMP不仅有再生性而且具有对未分化的牙周间质细胞的诱发效应。
重组BMP-2在许多动物模型中显示显著的成骨活性[7]。rhBMP-2已进行了广泛的药效学研究，并在几种动物模型的骨形成中作了评价。rhBMP-2对关键大小的骨缺损的愈合疗效从大鼠的股骨至大动物如羊的股骨及犬桡骨[8～10]。在上颌面区域rhBMP -2在犬及猴子的下颌骨可诱发骨的生长和愈合骨的缺损[11，12]，此外犬的模型中可能加强牙槽嵴[13]。1996年Boyne[14]对rhBMP-2用成年雄性猕猴属簇生的恒河猴进行的动物试验也表明rhBMP-2对恒河猴的关键大小的半下颌切除缺损能产生骨的再生。Schimanole等[15]曾对rhBMP-2对动物脊柱的融合进行了评价。
, http://www.100md.com
4 rhBMP-2的临床应用
1994年Sailer等[16]总结了他们用rhBMP-2在面部和颅面的145例患者中的应用。用髂骨的骨移植及钛螺丝植入物前期修复的再造。全部患者是解决骨或软组织条件的病例，在6～8 .5月后从临床实验及CT图像进行鉴定，结果表明rhBMP-2能明确地诱发骨。
1996年国外已广泛应用于以下几方面：①骨科：包括大块骨缺损的治疗、植入固定、整形外科应用、脊柱融合、难愈合性骨折及股骨坏死的治疗；②口腔科：包括牙周再造、牙髓组织修复、根管疗法及颅面颌骨再造等。此外，由于rhBMP-2的作用并不局限于骨组织，现在发现在心脏、脑组织、肾上腺等机体许多其他部位也有BMP的合成，因此rhBMP对机体会有更广泛的作用，已经发现BMP-2对动物的早期胚胎发育和细胞的定向分化有重要作用[17]。
5 讨论
, http://www.100md.com
rhBMP-2的研究和应用历史虽短，但由于其具有骨形成的作用，在骨科和口腔科许多疾病的治疗上已获得了广泛的应用，据发现对动物的早期胚胎发育和细胞的定向分化具有重要的作用，因而rhBMP-2在临床上将有其广阔的应用前景。
参考文献：
[1]Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ,et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities..Science, 1988, 242(12) ∶1528
[2]Wozney JM. Bone morphogenetic proteins. Prog Growth Factor Res, 1989, 1(4)∶267
[3]Wozney JM. Bone morphogenetic protein and their gene expression. In: Noda M, ed. Cellular and molecular biology of bone. New York: Academic press, 1993.131
, http://www.100md.com
[4]Inada M, Katagiri T, Akiyama S, et al. Bone morphogenetic protein-12 and -13 inhibit terminal differentiation of myoblasts, but do not induce their differentiation into osteoblasts. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 222(2)∶ 317
[5]Takuwa Y, Ohse C, Wang EA, et al. Bone morphogenetic protein-2 stimulating alkaline phosphatase activity and collagen synthesis in cultured osteoblatic cells, MC3-El. Biochem Biophys Res Commun, 1991, 174(1)∶96
, 百拇医药
[6]Gao Y, Yang L, Fang YR, et al. The inductive effect of bone morphogenetic protein (BMP) on human periodontal fibroplst-like cells vitro. J Osaka Dent Univ, 1995, 29(1)∶9
[7]Wozney JM. BMPs roles in bone development and repair. Portland Bone Symposium, Aug 2-5, 1995, Portland Ore.
[8]Yasko AW, Lan JM, Felliinger EJ,et al. The healing of seg mental bone defects induced by recombinant human bone morphogenetic protein (rhB MP-2). A radiographic, histological and biomechanical study in rats. J Bone Joint Surg, 1992, 74A(4)∶659
, 百拇医药
[9]Kirker-Head CA, Gerhart TN, Schelling SH, et al. Long-tem healing of bone using recombinant human bone morphogenetic protein-2. Clin Or thop, 1995, (318)∶222
[10]Sciadini MF, Dawason JM, Berman LM, et al.Dose-respones characteristics of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) in a canine segmental defect model. In: Transactions of the 41st Annual meeting of orthopeadic Reserch Society: February 13-1, Orlando, Fla 5594
, 百拇医药
[11]Toriumi DM, Kotler HS, Lurenberg DP, et al. Mandibular re construction with a recombinant bone-inducing factor. Arch Otolaryngol Head Neck Sug, 1991,117(11)∶1101
[12]Boyne PJ. Reconstruction of discontinuity mandibular defects in rhesus monkeys using rhBMP-2. J Maxiilofac Surg, 1995, 53(Suppl 4)∶S9 2
[13]Sigurdsson TJ, Lee MB, Kubota K, et al. Periodontal repai rin dogs: recombinant human bone morphogenetic protein-2 significantly enhance s periodontal regeneration. J Periodontal, 1995, 66(2)∶131
, 百拇医药
[14]Boyne PJ. Animal studies of application of rhBMP-2 in maxill ofacial reconstruction. Bone, 1996, 19(Suppl 1)∶S83
[15]Schimanole J, Boden S, Hutton W. Experimental spinal fusion with recombinant human bone morphogenetic protein-2. Spine, 1995, 20(12)∶ 1326
[16]Sailer HF, Kolb E. Application of purified bone morphogeneti cprotein(BMP) in cranio-maxillo-facial surgery. BMP in compronised surgical re construction using titanium implants. J Craniomuxillofac Sug, 1994, 22(1)∶ 2
[17]Furata Y, Piston DW, Hogan BL. Bone morphogenetic proteins (BMPs) as regulator for dorsal forebrain development. Development, 1997, 124( 11)∶2203
收稿日期：1999-10-11
修稿日期：1999-11-12, 百拇医药