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编号:10275205
利用茉莉酸类结合mRNA差示技术研究紫杉醇生物合成机制
http://www.100md.com 《中国新药杂志》 2000年第4期
     作者:邱德有 朱蔚华 吴蕴祺 张大勇 胡秋

    单位:邱德有(中国林业科学院林业所,北京 100091);朱蔚华 吴蕴祺 张大勇 胡秋(中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所,北京 100050)

    关键词:差示技术;茉莉酸类;生物合成

    中国新药杂志000404

    摘要 利用差示技术从红豆杉悬浮细胞中克隆出茉莉酸类诱导表达的基因,并用异源表达系 统对有关基因进行功能鉴定,从而阐明紫杉醇生物合成机制,为今后解决红豆杉悬浮法生产 细胞紫杉醇产量低且不稳定的难题提供理论依据和技术手段。

    STUDY ON MECHANISM OF TAXOL BIOSYNTHSIS BY JASAMONATES AND
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    MRNA DIFFERENTIAL DISPLAY

    Qiou Deyou Zhu Weihua Wu Yunqi et al.

    (Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091)

    ABSTRACT In order to understand the mechanism of taxol biosynthesis, a new idea of using Jasamonates and mRNA differential display to clone the jasamonates elicited gene in taxus suspension cells and their functional analysis with heterologous expre ssion system is proposed. This strategy may provided a solution to the problem o f low and unstable taxol yield in taxus suspension cells.
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    KEY WORDS mRNA differential display; Jasmonates; Taxol biosynth esis

    1 茉莉酸类物质的研究概况及功能

    茉莉酸类物质是一类特殊的环戊烷衍生物型植物激素,已知 的约有20余种[1]。在自然界最早发现的是左旋茉莉酸甲酯[(-)-Ja-Me]。196 2年,Demole 等[2](Jasminum officinale var.grandiflorum)把它作为一种有香气的化合物从茉莉属的素馨花中分离出来,并用作香料工业生产中的一个重要 原料成分。到19 67年,Crabalona 又从白花迷迭香(Rosmarium grandiflorum)发现并分离出了这类物质, 以后 发现苦蒿(Artemisia absinthium)的叶片和茎中也有Ja-Me[3]。游离的茉莉 酸 ( Ja) 首先是从真菌(Lasiodiplodia theobromae)培养液中分离出来的[4], 后 来发 现许多植物都含有Ja。迄今在多达150个科206 种植物中发现有茉莉酸类物质的存在。茉莉 酸类物质在植物组织中的含量高的可达10~30μg/g鲜重,低的仅为10~100ng/g鲜重。而 植 物悬浮细胞中茉莉酸类物质的含量仅为0.1~1ng/g,比植物组织中茉莉酸类物质的含量要 低2个数量级[5]。研究表明,茉莉酸类物质的生物合成是通过脂氧合酶途径,即亚 麻酸经脂氧合酶催化加氧作用,产生脂肪氢过氧化物, 然后在氢过氧化物脱氢酶的作用下,产 生环氧亚麻酸,之后再在丙二烯氧化物环化酶的作用下,形成环戊烯衍生物12-氧-植物二烯 酸,再经还原及3次β-氧化作用,最后形成(+)-7-epi-Ja。 通过对茉莉酸类物质生理功 能 的研究,发现它对植物的生长发育具有广泛的生理功能,这些生理功能主要集中表现在2个方 面,即对生长的抑制作用和对衰老的促进作用[6]
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    用来源于真菌的激发子或真菌的细胞壁制剂可诱导悬浮培养的植物细胞产生相对分子质 量低的次生代谢物质, 这类物质在植物防止病原体侵害中起重要作用。研究结果表明,真菌激发子能刺激双子叶植物、 单子叶植物和裸子植物悬浮培养细胞内源3R,7S-茉莉酸的累积,例如灰白毛萝芙悬浮培养细胞在受到真菌激发子作用后,茉莉酸水平迅速从25上升到1 370ng/( g.dw),相对分子质量低的次生代谢物质的合成量与内源3R,7S-茉莉酸的累积具有相关 性[7 ] 。Francesch等[8]在1991 年发现低含量的挥发性外源茉莉酸甲酯可诱导大豆小苗 花色素苷和营养贮藏蛋白的合成。Gundlach等于1992年也报道外源茉莉酸甲酯处理可诱导黄 堇、猪屎豆、花菱草、大豆、莴苣、番茄、萝芙木、茜草、芸香等36种单子叶及双子叶植物 悬浮培养细胞苯丙氨酸氨基裂解酶基因的重新转录,最终导致相对分子质量低次生代谢物质 的积累 。用茉莉酸生物合成前体及中间产物,如α-亚麻酸和12-氧-植物二烯酸处理也能诱导悬 浮培养的植物细胞大量合成的次生代谢物质[9]。外源茉莉酸甲酯还可促进紫草悬 浮细胞迷迭香酸和长春花小苗生物碱的积累[10,11]。1996年Yukimune等[12 ]在培养 基中加入100μmol茉莉酸甲酯后使杂种红豆杉(Taxus.media)、欧洲红豆杉(T.b acca) 和太平洋红豆杉(T.brevifolia)培养细胞紫杉醇的产量由原来的(28.2±2.4),(0.4±0.0)和(0.2±0.0)mg/L分别提高到(1 10.3±4.9),(48.3±2.5)和(0.5±0.1)mg/L。同年Mirjalili等[13]也 发现10mol的茉莉酸甲酯和0.0005%乙烯可使东北红豆杉(T.cuspidata) 悬浮细胞的 紫杉醇产量提高了19倍(由原来的0.19提高到3.4mg/L)。茉莉酸甲酯对紫杉醇生物合成 的这种作用又被Furmanowa等[14]和Moon等[15]的试验结果所证实,他们分 别把杂种红豆杉和欧洲红豆杉培养细胞紫杉醇的产量由原来的2.37μg/g和1.6mg/L干重提高到90μg/g和2.3mg/L干重。Yukimune等[12]和Moon等[15]同时发现茉莉酸甲酯还可使红豆杉培养细 胞另一种紫杉烷类化合物baccatin III的产量大幅度提高。上述结果充分表明,茉莉酸类物质是 诱导植物次生代谢物质生物合成的一种信号分子。
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    2 紫杉醇生物合成的研究概况

    作为红豆杉植物次生代谢产物之一的紫杉醇是近20年来抗癌药物研究领域的重 要发现。临床试验结果表明,紫杉醇对晚期卵巢癌、转移性乳腺癌和非小细胞肺癌有很好的疗效,对头部、颈部、 淋巴组织、膀胱、骨髓、食管等癌症也有一定疗效。该药于1992年底被美国 食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗晚期卵巢癌,是一种具有发展前途的新药,预计该药在2 1世纪全球每年的销售额可达60亿美元。

    红豆杉属植物全世界有11个种,我国也有4种和1个变种, 即西藏红豆杉(Taxus walli chiana Zucc)、云南红豆杉(Taxus yunnanensis Cheng et L. K. Fu)、红豆杉[T. chinensi s (pilger) Rehd.]、东北红豆杉(T. cuspidata Sieb. et Zucc.)和南方红豆杉(变种)(T. chinen sis Rehd. var. mairei Cheng et L. K. Fu.),但全世界资源总量却极其有限,且常常散 生分布于天然林中。据估计,在我国红豆杉仅有100万株左右。 目前 , 紫杉醇主要利用红豆 杉科红豆杉属植物的树皮来分离提取。
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    为了从根本上解决紫杉醇的长期供应问题,国内外学者在红豆杉的人工栽培、紫杉醇的化学合成、内生真菌或微生物的分离与培养和细胞培养等领域进行了许多有意义的探索,取得了一些进展。紫杉醇的化学合成已经成功,但需要近30步化学反应,产率低、成本高, 虽然利用baccatinⅢ或10-deacetylbaccatinⅢ 为原料通过4步反应可合成紫杉醇及其类似物, 但这种半合成法仍然依赖于红豆杉枝叶这一有限的自然资源,且成本也很高;红豆杉在自然条件下生长非常缓慢, 而且大多数红豆杉枝叶中紫杉醇的含量仅为树皮中的五分之一, 因此利用人工栽培方法来获取大量的紫杉醇也面临不少问题。而采用红豆杉细胞法获得紫杉醇不仅周期短(约30d) ,而且还具有不受自然条件限制的优点, 是解决紫杉醇药源问题的较优途径之一。目前世界至少有十几家实验室从事这方面的研究,已有不少文章发表和专利公布[12~15]。到现在 为止,国内外红豆杉培养细胞中紫杉醇产量通常都不高, 即使是偶尔报道获得较高的产量也 都存在产量不稳定的问题[12~15]。很显然,现在利用红豆杉细胞悬浮培养法还无 法进行紫杉醇的工业化生产。究其原因, 主要是由于人们对紫杉醇生物合成的部位、途径及 其调控机制还不甚清楚,特别是对紫杉醇生物合成途径中的关键步骤(即限速步骤)及其调控 机制了解不多所致。
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    有关紫杉醇生物合成部位的研究已有一些报道。Strobel等[16]认为对整株 红豆杉植物而言,树冠上部枝条、根、根茎连结处以及侧枝的树皮合成能力都不如主茎树皮的合成能力强 ,而树皮中合成紫杉醇的能力又以内层韧皮部和白色的形成层组织最强。Smith 等利用免疫金标记的紫杉醇抗体发现金颗粒存在于红豆杉细胞的大的质体中,从而认为紫杉醇的生物合成是在红豆杉细胞的质体中进行[17]。这一结果被Srinivasan等 [18]的试验所证实:用1和10μmol环己亚胺(细胞质蛋白质合成抑制剂)处理 红豆杉细胞,其紫杉醇的产量均不受影响; 当加入1μmol的链霉素(质体蛋白质合成抑制剂) 几乎不影响红豆 杉细胞紫杉醇的产量,而10μmol链霉素则完全抑制了红豆杉细胞紫杉醇的生物合成,致 使培养 细胞中检测不到紫杉醇的存在。除了质体中检测到紫杉醇的存在外,原生质体外的细 胞壁(红豆杉幼茎韧皮部、维管束形成层以及木质部细胞的细胞壁)也检测到了大量的紫杉醇的存在[19]。所以,紫杉醇可能是在红豆杉细胞质体中合成后最终积累在原生质体外的 细胞壁中。
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    有关紫杉醇生物合成途径的研究也有一些报道。一般认为, 紫杉醇的生物合成包括紫杉醇侧链的生物合成和紫杉醇骨架的生物合成两部分。用酸水解紫杉碱后形成(3R) -二甲基-3-苯丙氨酸( winterstein acid),而苯丙氨酸被认为是其最好 的前体[20]。用放射性同位素标记的前体进行喂饲试验的结果表明,紫杉醇C13位酯基侧链 上C6H5CHCH(OH)COO基团来自苯丙氨酸。Fleming等[21]用同位素标记技术证明, 苯丙氨酸首先在氨基变位酶的作用下形成β-苯丙氨酸,β- 苯丙氨酸经C2位羟基化后形成苯基异丝氨酸(phenylisoserine),苯基异丝氨酸与紫杉醇的骨架部分(如Baccatin III)相连且苯基异丝氨 酸的NH2 基团被苯基化后才合成其完整的侧链部分[21]。中国红豆杉 细胞系PRO1-95 紫杉醇的产量已被证明受其细胞把苯丙氨酸转变为苯基异丝氨酸的能力的限制,而不受紫杉醇骨架和侧链相连结的酰基转移酶的限制[18]
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    紫杉醇的骨架是由?牛儿?牛儿基焦磷酸(GGPP)环化而成 的, 而且很可能是通过cembrenehe 和verticillene 这两种中间产物而形成的。但通过对cembrenehe,verticill ene 和环氧verticillene的环化都无法得到具有紫杉醇骨架的化合物。迄今为止,由于从自然界红豆杉植物中分离到的紫杉烷类化合物都在C4和C20以及C11和C12 之间含有双键,即都是taxa-4(20),11(12)-diene类型。因此,GGPP曾被认为是首先环化形成taxa-4(20),11( 12)-diene。美国华盛顿州立大学生化系Croteau研究小组的结果却不是这样, [1-3H]标记 的GGPP先形成taxa-4(5),11(12)-diene,这种产物与红豆杉幼茎共培养后便可得到10-去乙酰巴 可亭III(10-deacetyl baccatin III) 和紫杉醇在内的多种紫杉烷类化合物。参与这一环化反 应的二萜烯环化酶(Taxadiene synthase)已从太平洋红豆杉细胞中得到部分纯化,该酶是一个单体 蛋白,相对分子质量为79,000道尔顿[22]。其作用机制是使GGPP先形成verticillyl 阳离子, 接着verticillyl 阳离子C11上的质子转移到C7位上,最后C5位去质子便形成taxa-4(5),11(12) -diene[23]。利用聚合酶链式反应(PCR) 已经克隆到编码该酶的cDNA 片段,它由2 5 86个核苷酸碱基组成, 在大肠杆菌中表达出的蛋白质具有把GGPP 转化成taxa-4(5),11(12)-diene 的生物活性[24]。对加拿大红豆杉悬浮细胞培养过程中二萜烯环化酶( Taxadiene sy nthase)活性分析的结果表明,尽管此步反应速度很慢, 但它仍然不是紫杉醇生物合成的限速步骤[2 5]。用东北红豆杉茎段或太平洋红豆杉悬浮细胞的细胞微粒体制备物 ( microsome preparations ) 可离体催化taxa-4(5),11(12)-diene成taxa-4(20),11(12)-dien-5a-ol, 并被太平洋 红豆杉茎段切片进一步转变成到10-去乙酰巴可亭III(10- deacetyl baccatin III)、cephalomannine 和紫杉醇。这种加氧酶( taxadiene-5-hydroxylase)是红豆杉细胞微粒体细胞色素P450(cyto chrome P450),由它催化紫杉醇骨架生物合成的第1步氧化反应。由于此步反应速度相当慢,因此很可能是紫杉醇骨架生物合成的限速步骤[26]。紫杉醇骨架生物合成的第3步可能是taxa -4(20),11(12)-dien-5a-ol在C5的酰基化,然后很可能依次在C10,C2,C9及C13位发生羟基化反应并开始合成紫杉醇骨架的D环(oxetane),最后在C7和C1 位发生加氧反应而完成紫杉醇骨架生物合成的全过程。紫杉醇骨架生物合成时发生在C5 的羟基化反应是由P45 0参与完成,发生在C10,C2,C9,C13,C7和C1的羟基化反应也很可能也是P450催化的结果。
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    3 茉莉酸类物质作用机制的研究进展

    既然真菌激发子能够诱导内源茉莉酸类物质的累积, 而且真菌激发子和外源茉莉酸类物质都能够诱导许多植物次生代谢物质的生物合成, 尤其是茉莉酸类物质其作用浓度低且在 促进悬浮细胞次生代谢物质合成时具有比真菌激发子更容易控制的优点,因此弄清楚它们作 用机制十分必要。Ohta等和Ebel最近发现真菌激发子可诱导细胞色素P450基因的转录 ,进而诱导大豆的次生代谢物质的生物合成。细胞色素P450在高等植物许多生物碱( 如vindolin.)的生物合成中参与有关氧化和水解反应,是一种十分重要的单氧酶。已有足够 的证据表明,茉莉酸类物质也是通过诱导细胞色素P450酶的活性的提高来促进植物次 生代谢物质的生物合成。Suzuki等人利用差示显示 ( differential display)技术克隆到一个受茉莉酸甲酯诱导表达的新基因CYP93A1,根据其核苷酸序列推断该基因编码的是一种细胞色素P450。最近, Pauli等[27]利用RT-PCR技术从Es chholzia californica克隆到受茉莉酸甲酯诱导表达的细胞色素P450基因CYP80B1的2个等位基因和另1种 细胞色素P450基因CYP82B1,其中CYP80B1基因在Saccharomyces cerevisiae中表达 出的蛋白是细胞色素P450并且能够水解(S)-N-methylcoclaurinne,参与benzylisoq uinoline的生物合成。这就进一步证明了茉莉酸类物质是通过诱导细胞色素P450 基 因的表达,从而诱导细胞色素P450酶的活性来促进植物次生代谢物质的生物合成的。 在芫荽和转基因烟草中发现,受真菌激发子和外源茉莉酸类物诱导表达的基因的mRNA累积的时间和水平存在差异。大豆悬浮培养细胞中也发现真菌激发子诱导细胞色素P450基因表达不 象茉莉酸甲酯那样需要叶绿体电子传递链的参与, 两者作用不完全一样,茉莉酸甲酯只是部分地代替真菌激发子的作用。由此看来, 与真菌激发子相比, 茉莉酸类物质诱导植物次生代谢物质的生物合成机制有其独特的方面。
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    4 利用茉莉酸类结合mRNA差示技术研究紫杉醇生物合成机制的可能性

    如果茉莉酸类物质诱导红豆杉细胞紫杉醇的生物合成确实是象其诱导植物其他次生代谢物质的合成一样是通过诱导细胞色素P450基因的表达 ,进而诱导细胞色素P450酶的活性来起作用, 那么,我们对茉莉酸类物质诱导红豆杉细胞紫杉醇的生物合成的作用机制便有一个定论。除此之外,我们还想进一步知道,受茉莉酸诱导的红豆杉细胞色素P450基因有多少,是什么,参与催化t axa-4(5),11(12)-diene成taxa-4(20),11(12) - dien-5a-ol这一紫杉醇骨架生物合 成的第1步氧化反应的细胞色素P450基因是否也包括其中,有关细胞色素P450 基因各自在紫杉醇生物合成中起何作用。由于红豆杉遗传转化系统已经成功建立,使我 们还可通过人为方法特别是分子生物学技术中的基因工程技术来增加关键酶基因的表达,提 高和稳定红豆杉悬浮细胞紫杉醇的产量,从而彻底解决利用红豆杉细胞悬浮培养工业化生产 紫杉醇的所面临的紫杉醇产量低且不稳定的难题,真正实现利用红豆杉细胞培养技术工业化 生产紫杉醇的目的。
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    差示显示技术是由Liang等[28]在1992 年建立的一种分子 生物学新技术,其原理是通过部分扩增mRNA 的逆转录产物,再使所有扩增片段经序列胶显示出来。尽管该方法存在假阳性和差别条带短小的缺限,但由于此方法简便直观,并 可对不同细胞的mRNA进行比较,特别是可以对不同细胞低丰度差别表达的mRNA进行比较,从而寻找到特异表达的基因,所以从一开始就受到分子生物学研究者们的欢迎。目前在动、植物中都有很多成功的应用。就植物而言,受生长素、细胞分裂素、乙烯、赤霉素等植物激素控制表达的基因片段都通过该技术得到成功地分离。利用此项技术已经成功地从大豆悬浮细胞中克隆到受真菌激发子诱导表达的8个P450基因的cDNA克隆和受到茉莉酸甲酯诱导表达的细胞色素P450基因CYP93A1。可以预计, 利用差示显示技术也能够从红豆杉悬浮细 胞中克 隆到受茉莉酸类植物激素诱导表达的基因, 进而了解茉莉酸类促进红豆杉细胞紫杉醇生物合 成机制。因此,开展茉莉酸类促进红豆杉细胞紫杉醇生物合成机制的研究,不仅在技术上是可 行的,而且在理论上及实践中均具有十分重要的意义。
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    本项目为国家自然科学基金资助项目(39970603)

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    收稿:1999-11-05

    修回:2000-01-23, http://www.100md.com