赤土茯苓苷对不完全脑缺血小鼠的保护作用
作者：丁岩 新华.那比 帕尔哈提 周承明 张克锦
单位：新疆医科大学药理教研室，乌鲁木齐，83005
关键词：赤土茯苓苷；不完全脑缺血；脂质过氧化
中国新药杂志000410
摘要 目的:探讨赤土茯苓苷对不完全脑缺血小鼠的保护作用及其相关机制。方法：采用结扎小鼠双侧颈总动脉造成不完全脑缺血模型，分别测定赤土茯苓苷在离体、在体 情况下的抗脂质过氧化作用。结果：赤土茯苓苷可明显延长不完全脑缺血小鼠的平均存活时间，提高脑组织中超氧化物 歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力，降低脑组织中脂质过氧化产物丙二醛含量，缩小脑梗塞 面积。离体研究发现，赤土茯苷抗氧化作用极为明显。结论：赤土茯苓苷对不完全脑缺血小鼠有保护作用，机制可能与其抗脂质过氧化反应有关。
PROTECTIVE EFFECT OF SMIGLABRIN ON INCOMPLETE CEREBRAL ISCH EMIA OF MICE
, 百拇医药
Ding Yan Xinhua Nabi Parahart et al.
(Department of Pharmacology,Xin Jiang Medical University,Urumqi 830054)
ABSTRACT OBJECTIVE:To investigate the protective effect of Smiglabrin on i ncomplete cerebral ischemia and its mechanism. METHODS:The model of cerebral incomplete ischemia in mice was pro duced by occlusion of bilateral arteria carotis communis and the anti-lipid-pe roxidation effect of Smiglabrin was evaluated in vitro and in vivo. RESULTS:Smiglabrin significantly prolonged the survival time of mice model, increased the SOD and GSH-Px vitality of brain tissue, decreased th e MDA level in brain tissue and reduced the infract size in cerebellum. It is di scovered in vivo study that the anti-oxidation activity of Smiglabrin was very pronounce. CONCLUSIONS:The results obtained suggested that Smiglabrin is ef fective in protection of incomplete cerebral ischemia of mice, probably due to i nhibition of free radical and its antagonist action on lipid peroxidation.
, 百拇医药
KEY WORDS Smiglabrin; Incomplete cerebral ischemia; Lipid perox ide(LPO)
赤土茯苓苷(smiglabrin,Smi)系从赤土茯苓中提取分离制得的黄酮类化合物(纯度为99.5%以上)。我们发现其有抗动脉粥样硬化[1]、血栓形成[2]及保护心肌缺血[3]的作用，但对脑缺血的作用尚未见报道。本研究采用阻断小鼠双侧颈 总动脉造成不完全脑缺血模型，观察赤土茯苓苷的抗脑缺血作用，并对其机制进行了初步探讨。
材料和方法
1 药品及试剂
赤士茯苓苷本(室提取分离制得)；维脑路通(Venoruton,Veno)注射剂(江苏扬州制药厂，批号 960718)，临用前制成0.5%溶液；SOD，GSH-Px活力及MDA含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；721分光光度计(上海第三分析仪器厂)；S HG-1型化学发光仪(上海上立检测仪器厂)。
, 百拇医药
2 动物及分组
昆明种小鼠，雌雄兼用，体重(20±2)g，由新疆医学实验动物中心提供。动物随机分为5组 ：① 假手术组；② 缺血组；③ 缺血+赤士茯苓苷50mg/(kg.d)×6d；④ 缺血+赤士茯苓苷100mg/(kg.d)×6d；⑤ 缺血+赤士茯苓苷2 00mg/(kg.d)×6d；⑥ 缺血+维脑路通100mg/(kg.d)×6d。
3 动物模型及给药方法
各组动物每天1次腹腔注射给药，①及②组腹腔注射等容积生理盐水。于d6给药1h后，用20 %乌拉坦1.2g/kg腹腔注射麻醉，用丝线双重结扎双侧颈总动脉造成急性实验性不完全性脑缺 血模型[5，6]，假手术组不结扎动脉。
4 指标测定
, 百拇医药
平均生存时间参照文献4，5，结扎双侧颈总动脉后，立即记录死亡时间(每1mi n呼吸≤5次为死亡)，以死亡时刻减去结扎末时刻，为存活时间；体外实验：通过测定IC 50观察赤士茯苓苷对羟自由基(OH.)，超氧阳离子(
)、过氧化氢(H 2O2)的抑制率。
结扎双侧颈总动脉10min后，断头取脑，称取左、右侧前脑组织100mg，制备成5%匀浆。按亚硝盐法测SOD活力[6]，硫代巴比妥酸比色法测MDA含量，DTNB法测GSH-Px活性 [7]，蛋白质定量用考马斯亮蓝法。
脑梗塞体积测定[8]：断头取脑后，剔除嗅脑，低位脑干及小脑，在冰上将脑沿冠状面切成厚度基本相同的5片，37℃的四氮唑蓝染料中温育30min。正常脑组织呈玫瑰红，脑梗塞区为白色。再将脑片置于100g/L的甲醛中固定，称取脑片的总重量及梗塞区 重量，计算后者占前者的百分比，即为梗塞区占全脑的百分比。
, 百拇医药
5 统计分析
结果以(
±s)表示，差异显著性用t检验。
结果
1 平均生存时间
①组(n=21)小鼠在120min内无1只死亡，②组(n=19),③组(n=18),④组 (n=21),⑥(n=20)组平均生存时间分别为26.58,45.52,66.63,82.53min。这说明赤 士茯苓苷50与100mg/kg均可明显延长不完全脑缺血小鼠的存活时间(P<0.05，P <0.01)；赤士茯苓苷100mg/kg与维脑路通100mg/kg比无显著性差异(P>0.05)。
2 体外实验
, 百拇医药 赤士茯苓苷对OH.，及H2O2均有不同抑制作用，其抑制率(IC50 )分别为0.19，0.22，0.41mg/L，其中对OH.抑制作用最 强。
3 体内抗氧化作用
见表1。
表1 赤士茯苓苷对双侧颈总动脉结扎所致脑缺血小鼠脑组织中
SOD及GSH-Px活性及MDA含量的影响 (±s) 组别
n
, 百拇医药 SOD
(×10-3nU/g)
GSH-Px
(μmol/(min.g))
MDA
(μmol/g)
①组
13
182.37±18.40c
24.37±2.93c
4.86±0.64c
, 百拇医药
②组
10
126.54±15.50
14.66±2.71
8.26±1.55
③组
10
152.82±23.66b e
16.97±1.47a d
6.56±1.07a d
④组
, 百拇医药
12
151.57±23.19b e
18.51±3.12b d
5.99±0.80b d
⑥组
11
176.17±10.58c
19.18±4.50b
6.42±0.98b
与②组比，a:P<0.05,b:P<0.01,C:P<0.001;与⑥组比，d:P>0 .05,e:P<0.05
, http://www.100md.com
4 脑梗塞体积
①组(n=14)，②组(n=11)，④组(n=11)和⑤组(n=12)，⑥组( =10)脑梗塞面积分别为0，33.78%，28.82%,26.62%，24.07%，④和⑤组与②组相比， 可明显减少小鼠脑梗塞面积(P<0.05，P<0.01)；⑥组也可明显减少小鼠脑梗 塞面积(P<0.01),且与⑤组之间无显著性差异(P>0.05)。
讨论
赤士茯苓苷能使双侧颈总动脉结扎造成的不完全脑缺血小鼠的生存时间延长，减轻脑梗塞面积，表明赤士茯苓苷有明显的抗脑缺血作用。
正常机体氧自由基产生与清除处于动态平衡，但脑缺血时，氧自由基清除酶活力下降，同时氧自由基生成增加，攻击生物膜上丰富的多价不饱和脂肪酸，生成毒性中间产物(如脂氢过氧化物)及终末产物丙二醛等。丙二醛可交联蛋白质和磷脂上的氨基，生成Schiff碱，降低膜流动性，致细胞变形、功能受损。本实验通过不完全脑缺血模型观察到，缺血组织内MDA含量增加，SOD，GSH-Px活性降低，说明缺血期间自由基产生增加，而自由基清除系统功能低下，导致脂质过氧化作用增加，赤土茯苓苷50，100mg/kg能明显提高SOD,GSH-Px 活性，降低MDA水平，体外实验证实，赤土茯苓苷本身即能清除氧自由基，而且对毒性强的O H.作用最强，提示其抗脑缺血机制可能与其提高氧自由基清除酶活力及直接清除氧自由基 ，从而防止脂质过氧化等作用有关。由于缺血致脑损伤机制非常复杂，赤土茯苓苷是否还通 过其他途径发挥作用有待进一步探讨。
, 百拇医药
参考文献
1，张克锦，邹玉玲，周承明.赤土茯苓提取物对实验性鹌鹑动脉粥样硬化的 预防作用.中草药，1991，22(9)∶411
2， 艾尼瓦尔.吾买尔，周承明.赤土茯苓苷对血小板聚集的影响.中草药，1997，28 (Suppl)∶S97
3，李玉琪，周承明，张克锦.赤土茯苓苷对异丙肾上腺素诱发的小鼠急性心肌缺血的 保护作用.中草药，1996，27(7)∶418
4，袁淑华，郝晓敏，李亦秀，等.盐酸小檗胺对小白鼠脑缺血作用的研究.哈尔滨医 科大学学报，1988，22(1)∶14
5，Ye CL,Li BH.Protective effects of clonidine on cerebral ischemia in mic e andcats. Chin J Pharmacol Toxicol,1993,7(1)∶42
, 百拇医药
6，郭秀丽，张爱琴.抗氧化及自由基实验方法与技术.见∶张均田,等主编.现代药理 实验方法(下册).北京:北京医科大学协和医科大学联合出版社,1997.1223
7，夏奕明，朱莲玲.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活性的测定方法.卫生研究，198 7，16(4)∶29
8，Lundy EF,Solik BS,Frank RS.Morphometric evaluation of brain infarcts in rats and gerbils. J Pharm Med,1986,16(1)∶201
收稿∶1999-10-18
修回∶2000-01-18, 百拇医药
单位：新疆医科大学药理教研室，乌鲁木齐，83005
关键词：赤土茯苓苷；不完全脑缺血；脂质过氧化
中国新药杂志000410
摘要 目的:探讨赤土茯苓苷对不完全脑缺血小鼠的保护作用及其相关机制。方法：采用结扎小鼠双侧颈总动脉造成不完全脑缺血模型，分别测定赤土茯苓苷在离体、在体 情况下的抗脂质过氧化作用。结果：赤土茯苓苷可明显延长不完全脑缺血小鼠的平均存活时间，提高脑组织中超氧化物 歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力，降低脑组织中脂质过氧化产物丙二醛含量，缩小脑梗塞 面积。离体研究发现，赤土茯苷抗氧化作用极为明显。结论：赤土茯苓苷对不完全脑缺血小鼠有保护作用，机制可能与其抗脂质过氧化反应有关。
PROTECTIVE EFFECT OF SMIGLABRIN ON INCOMPLETE CEREBRAL ISCH EMIA OF MICE
, 百拇医药
Ding Yan Xinhua Nabi Parahart et al.
(Department of Pharmacology,Xin Jiang Medical University,Urumqi 830054)
ABSTRACT OBJECTIVE:To investigate the protective effect of Smiglabrin on i ncomplete cerebral ischemia and its mechanism. METHODS:The model of cerebral incomplete ischemia in mice was pro duced by occlusion of bilateral arteria carotis communis and the anti-lipid-pe roxidation effect of Smiglabrin was evaluated in vitro and in vivo. RESULTS:Smiglabrin significantly prolonged the survival time of mice model, increased the SOD and GSH-Px vitality of brain tissue, decreased th e MDA level in brain tissue and reduced the infract size in cerebellum. It is di scovered in vivo study that the anti-oxidation activity of Smiglabrin was very pronounce. CONCLUSIONS:The results obtained suggested that Smiglabrin is ef fective in protection of incomplete cerebral ischemia of mice, probably due to i nhibition of free radical and its antagonist action on lipid peroxidation.
, 百拇医药
KEY WORDS Smiglabrin; Incomplete cerebral ischemia; Lipid perox ide(LPO)
赤土茯苓苷(smiglabrin,Smi)系从赤土茯苓中提取分离制得的黄酮类化合物(纯度为99.5%以上)。我们发现其有抗动脉粥样硬化[1]、血栓形成[2]及保护心肌缺血[3]的作用，但对脑缺血的作用尚未见报道。本研究采用阻断小鼠双侧颈 总动脉造成不完全脑缺血模型，观察赤土茯苓苷的抗脑缺血作用，并对其机制进行了初步探讨。
材料和方法
1 药品及试剂
赤士茯苓苷本(室提取分离制得)；维脑路通(Venoruton,Veno)注射剂(江苏扬州制药厂，批号 960718)，临用前制成0.5%溶液；SOD，GSH-Px活力及MDA含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；721分光光度计(上海第三分析仪器厂)；S HG-1型化学发光仪(上海上立检测仪器厂)。
, 百拇医药
2 动物及分组
昆明种小鼠，雌雄兼用，体重(20±2)g，由新疆医学实验动物中心提供。动物随机分为5组 ：① 假手术组；② 缺血组；③ 缺血+赤士茯苓苷50mg/(kg.d)×6d；④ 缺血+赤士茯苓苷100mg/(kg.d)×6d；⑤ 缺血+赤士茯苓苷2 00mg/(kg.d)×6d；⑥ 缺血+维脑路通100mg/(kg.d)×6d。
3 动物模型及给药方法
各组动物每天1次腹腔注射给药，①及②组腹腔注射等容积生理盐水。于d6给药1h后，用20 %乌拉坦1.2g/kg腹腔注射麻醉，用丝线双重结扎双侧颈总动脉造成急性实验性不完全性脑缺 血模型[5，6]，假手术组不结扎动脉。
4 指标测定
, 百拇医药
平均生存时间参照文献4，5，结扎双侧颈总动脉后，立即记录死亡时间(每1mi n呼吸≤5次为死亡)，以死亡时刻减去结扎末时刻，为存活时间；体外实验：通过测定IC 50观察赤士茯苓苷对羟自由基(OH.)，超氧阳离子(
)、过氧化氢(H 2O2)的抑制率。结扎双侧颈总动脉10min后，断头取脑，称取左、右侧前脑组织100mg，制备成5%匀浆。按亚硝盐法测SOD活力[6]，硫代巴比妥酸比色法测MDA含量，DTNB法测GSH-Px活性 [7]，蛋白质定量用考马斯亮蓝法。
脑梗塞体积测定[8]：断头取脑后，剔除嗅脑，低位脑干及小脑，在冰上将脑沿冠状面切成厚度基本相同的5片，37℃的四氮唑蓝染料中温育30min。正常脑组织呈玫瑰红，脑梗塞区为白色。再将脑片置于100g/L的甲醛中固定，称取脑片的总重量及梗塞区 重量，计算后者占前者的百分比，即为梗塞区占全脑的百分比。
, 百拇医药
5 统计分析
结果以(
±s)表示，差异显著性用t检验。结果
1 平均生存时间
①组(n=21)小鼠在120min内无1只死亡，②组(n=19),③组(n=18),④组 (n=21),⑥(n=20)组平均生存时间分别为26.58,45.52,66.63,82.53min。这说明赤 士茯苓苷50与100mg/kg均可明显延长不完全脑缺血小鼠的存活时间(P<0.05，P <0.01)；赤士茯苓苷100mg/kg与维脑路通100mg/kg比无显著性差异(P>0.05)。
2 体外实验
, 百拇医药 赤士茯苓苷对OH.，
及H2O2均有不同抑制作用，其抑制率(IC50 )分别为0.19，0.22，0.41mg/L，其中对OH.抑制作用最 强。3 体内抗氧化作用
见表1。
表1 赤士茯苓苷对双侧颈总动脉结扎所致脑缺血小鼠脑组织中
SOD及GSH-Px活性及MDA含量的影响 (
±s) 组别n
, 百拇医药 SOD
(×10-3nU/g)
GSH-Px
(μmol/(min.g))
MDA
(μmol/g)
①组
13
182.37±18.40c
24.37±2.93c
4.86±0.64c
, 百拇医药
②组
10
126.54±15.50
14.66±2.71
8.26±1.55
③组
10
152.82±23.66b e
16.97±1.47a d
6.56±1.07a d
④组
, 百拇医药
12
151.57±23.19b e
18.51±3.12b d
5.99±0.80b d
⑥组
11
176.17±10.58c
19.18±4.50b
6.42±0.98b
与②组比，a:P<0.05,b:P<0.01,C:P<0.001;与⑥组比，d:P>0 .05,e:P<0.05
, http://www.100md.com
4 脑梗塞体积
①组(n=14)，②组(n=11)，④组(n=11)和⑤组(n=12)，⑥组( =10)脑梗塞面积分别为0，33.78%，28.82%,26.62%，24.07%，④和⑤组与②组相比， 可明显减少小鼠脑梗塞面积(P<0.05，P<0.01)；⑥组也可明显减少小鼠脑梗 塞面积(P<0.01),且与⑤组之间无显著性差异(P>0.05)。
讨论
赤士茯苓苷能使双侧颈总动脉结扎造成的不完全脑缺血小鼠的生存时间延长，减轻脑梗塞面积，表明赤士茯苓苷有明显的抗脑缺血作用。
正常机体氧自由基产生与清除处于动态平衡，但脑缺血时，氧自由基清除酶活力下降，同时氧自由基生成增加，攻击生物膜上丰富的多价不饱和脂肪酸，生成毒性中间产物(如脂氢过氧化物)及终末产物丙二醛等。丙二醛可交联蛋白质和磷脂上的氨基，生成Schiff碱，降低膜流动性，致细胞变形、功能受损。本实验通过不完全脑缺血模型观察到，缺血组织内MDA含量增加，SOD，GSH-Px活性降低，说明缺血期间自由基产生增加，而自由基清除系统功能低下，导致脂质过氧化作用增加，赤土茯苓苷50，100mg/kg能明显提高SOD,GSH-Px 活性，降低MDA水平，体外实验证实，赤土茯苓苷本身即能清除氧自由基，而且对毒性强的O H.作用最强，提示其抗脑缺血机制可能与其提高氧自由基清除酶活力及直接清除氧自由基 ，从而防止脂质过氧化等作用有关。由于缺血致脑损伤机制非常复杂，赤土茯苓苷是否还通 过其他途径发挥作用有待进一步探讨。
, 百拇医药
参考文献
1，张克锦，邹玉玲，周承明.赤土茯苓提取物对实验性鹌鹑动脉粥样硬化的 预防作用.中草药，1991，22(9)∶411
2， 艾尼瓦尔.吾买尔，周承明.赤土茯苓苷对血小板聚集的影响.中草药，1997，28 (Suppl)∶S97
3，李玉琪，周承明，张克锦.赤土茯苓苷对异丙肾上腺素诱发的小鼠急性心肌缺血的 保护作用.中草药，1996，27(7)∶418
4，袁淑华，郝晓敏，李亦秀，等.盐酸小檗胺对小白鼠脑缺血作用的研究.哈尔滨医 科大学学报，1988，22(1)∶14
5，Ye CL,Li BH.Protective effects of clonidine on cerebral ischemia in mic e andcats. Chin J Pharmacol Toxicol,1993,7(1)∶42
, 百拇医药
6，郭秀丽，张爱琴.抗氧化及自由基实验方法与技术.见∶张均田,等主编.现代药理 实验方法(下册).北京:北京医科大学协和医科大学联合出版社,1997.1223
7，夏奕明，朱莲玲.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活性的测定方法.卫生研究，198 7，16(4)∶29
8，Lundy EF,Solik BS,Frank RS.Morphometric evaluation of brain infarcts in rats and gerbils. J Pharm Med,1986,16(1)∶201
收稿∶1999-10-18
修回∶2000-01-18, 百拇医药