高速逆流色谱分离制备白果内酯
作者：佘佳红 柳正良 蔡定国
单位：佘佳红(第二军医大学基础部新药评价中心，上海 200433)；柳正良(第二军医大学药学院药物分析教研室，上海 200433)；蔡定国(海军411医院，上海 200433)
关键词：高速逆流色谱；薄层色谱法；白果内酯
中国新药杂志000613 【摘要】 目的：以银杏叶粗提物为原料，利用高速逆流色谱法(HSCCC)分离制备得到白果内酯单体。方法：采用氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)的溶剂系统，待两相溶剂充分混合后，临用前将其分开，在室温下，下相作流动相，上相作固定相，以2.0 ml/min的流速，由首端向尾端洗脱，主机正转，转速为800r/min，固定相保留值为78%，进样2.0ml，定时收集馏分，用TLC鉴定。结果：经一次HSCCC即可分离制得白果内酯单体，TLC方法可用于银杏内酯的定性检测。结论：本方法简便、快速，为中草药有效成分的制备提供了一条新途径。
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【中图分类号】R914 【文献标识码】A
【文章编号】1003-3734(2000)06-0392-03
Separation and preparation of bilobalide by high speed
countercurrent liquid chromatigraphy
SHE Jia-hong
(Center of New Drugs Estimation,The Second Military University,Shanghai 200433)
LIU Zheng-liang
(Department of Pharmaceutical Analysis,The Second Military University,Shanghai 200433)
, 百拇医药
CAI Ding-guo
(The No.411 Hospital of Navy,Shanghai 200433)
【Abstract】 Objective:To establish a method for isolating bilobalide from crude Ginkgo Biloba extract(GBE).Methods:High speed countercurrent liquid chromatographic(HSCC)method was adopted.The solvent system was prepared by thoroughly mixing chloroform,methanol and water in proportions of 4∶3∶2,set aside at room temperature,before use the two layers were separated.The lower layer was used as mobile phase and the upper layer as stationary phase and eluted in a flow rate of 2.0 ml/min;and the apparatus was rotated in 800r/min.The eluant was collected and samples obtained were identified by TLC.Results:Bilobalide monomer can be obtained via a single separation and can be identified by TLC.Conclusions:A simple and rapid HSCC method is established for separation of bilobalide from crude Ginkgo Biloba extract and a new rout is provided for separation of active ingredients from traditional Chinese herbmedicines.
, 百拇医药
【Key words】 high speed countercurrent chromatography; TLC; bilobalide
银杏萜类内酯具有特殊的药理作用，为银杏叶中特有的生物活性成分，由于其含量较低且紫外吸收很弱，检测较困难，对照品尚不能通过合成获得，因此直接影响到对银杏萜类内酯研究工作的深入进行。高速逆流色谱(HSCCC)具有特殊的分离方式，性能稳定，目前，该技术已成功制备了多种标准品[1]。本研究采用HSCCC-TLC从银杏叶粗提物一次流程中分离出白果内酯单体，方法简便、快速，为中草药有效成分的制备提供了一条新途径。
材料与方法
1 仪器与试药
89-A型高速逆流色谱仪 (北京新技术应用研究所)，银杏内酯A，B和白果内酯对照品(Sigma公司)，银杏内酯C对照品(中国药品生物制品鉴定所)，硅胶H(60型，青岛海洋化工厂)， 酸性氧化铝(100～200目，上海五四化学试剂厂)，甲醇、甲苯、乙酸乙酯、丙酮、无水醋酸钠、乙醇等均为分析纯，水为重蒸水。
, 百拇医药
2 实验方法
2.1 对照品溶液的配制 分别精密称取银杏内酯A，B，C和白果内酯对照品(干燥至恒重)适量，加甲醇配成浓度各为1 mg/ml的对照品溶液。
2.2 样品溶液的制备 取一根20mm×360mm的玻璃柱，称取经400℃下活化5h的酸性氧化铝适量，按湿法装柱，称取银杏叶粗提物0.5g，用10ml甲醇溶解，上柱，用60ml甲醇洗脱，洗脱液挥发至干。配制氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)的两相系统，上下两相各取0.25ml，用此溶剂溶解经柱层析后的挥干物，配制成浓度约为1g/ml的样品液(以粗提物计)。
2.3 薄层层析条件 以银杏内酯A，B，C和白果内酯对照品溶液为标准对照，取4%醋酸钠改性的硅胶H 薄层板，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(4∶6∶2.7∶0.8)为展开剂，上行展开10cm，晾干，以醋酐熏20min，160℃下烘30min，然后在紫外灯(λ=365nm)下观察荧光，各内酯斑点呈不同程度的亮黄色。
, 百拇医药
2.4 高速逆流色谱条件 采用氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)的溶剂系统，待两相溶剂充分混合后，临用前将其分开，在室温下，下相作流动相，上相作固定相，采用2.0 ml/min的流速，由首端向尾端洗脱，主机正转，转速为800r/min，固定相保留值为78%，进样2.0ml，定时收集馏分，用TLC鉴定。实验结束时，用氮气将固定相由首端向尾端推出，并依次用乙醇30ml，水40ml冲洗。
结 果
1 分离结果分析
由于银杏萜类内酯的紫外吸收较弱，因此在色谱图上未见有明显的吸收峰，我们采用TLC的方法对实验结果进行分析。从进样后25min开始，每隔5min收集馏分，经浓缩后与银杏萜类内酯对照品分别点样于薄层板上，按薄层层析条件展开、显色，发现50min以后收集的馏分出现银杏萜类内酯。因此，从进样后50min开始，每隔4min收集馏分，依次记为1，2，……共18份(运行120min)，将收集的馏分浓缩后点样于薄层板上，经展开、显色，与对照品比较，结果见图1。从图1可见：86～90，90～94min(第10,11号斑点)，2个馏分只显1个斑点，其Rf值与白果内酯(BB)一致；50～66min(第1～4号斑点)收集的馏份存在2个斑点，其Rf值与银杏内酯A(GA),银杏内酯B(GB)相似；66～86 min收集的馏分，与BB，银杏内酯C(GC)的Rf值对应位置有较弱的荧光斑点，且同时存在其他杂质；94min以后收集的馏分(第12～18斑点)呈复杂的混合斑点，Rf值偏小。
, 百拇医药
图1 HSCCC收集馏份的TLC图
A为白果内酯对照斑点；1～18为各时间段收集的馏分的TLC结果
2 分离鉴定
经TLC鉴定馏出物，我们专门收集86～94min的馏分，并经多次进样，合并馏出物，挥干，对馏出物进行MS，IR光谱分析，MS：m/z:327(M)，270(M-56)，196(M-129),178,129,57(基峰),44；IRmax(cm-1)：3450(羟基),1800,1780, 1760(r-内酯) 。并经高效液相色谱分析，为单一峰，经与标准图谱对照确认为白果内酯。
讨 论
1 薄层层析展开剂的选择
按文献报道[3，4]的展开系统，分别进行考察后发现，其分离效果不令人满意，我们对此作了改进。采用甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇 (6∶4∶2.7∶0.8)为展开剂，其溶剂强度为3.99，分离效果好，斑点清晰集中，其Rf值GC,GB,GA,BB分别为0.28,0.46,0.54,0.65。
, 百拇医药
2 溶剂系统的选择
2.1 溶剂配比、分层时间及两相比的测定 分别按不同的配比配制3种溶剂系统，在容积为10ml刻度试管中剧烈振荡1min，使溶液充分混合，然后立即垂直静置，记录溶剂从静置到分为澄清两层的时间，同时记录上下两相的比值,结果见表1。
表1 溶剂配比、分层时间及两相体积比 溶剂系统
配 比
分层时间(s)
上相/下相
四氯化碳-甲醇-水
5∶4∶1
22
, http://www.100md.com 1.47
氯仿-甲醇-水
4∶3∶2
20
0.96
氯仿-正丙醇-甲醇-水
9∶1∶10.5∶8
26
1.22
2.2 分配比的测定 用60ml的分液漏斗，将上述3种溶剂系统配制20～30ml，分别取上下相各2ml，然后再将对应的两相等体积混合于10ml试管中，分别加入约0.1g的银杏叶粗提物，充分振荡，使样品在两相中完全溶解，然后分别取3个体系中上下相的粗提物溶液点样于TLC板上，按TLC条件展开观察，我们估算出银杏叶萜类内酯在氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)体系中的分配比最接近1，其次为氯仿-正丙醇-甲醇-水(9∶1∶10.5∶8)体系；在四氯化碳-甲醇-水(5∶4∶1)体系中，下相基本没有银杏叶萜类内酯存在。
, 百拇医药
在用HSCCC进行分离时，溶剂系统要求分层速度快、两相体积大体相等，分配比一般选择0.3
3 操作参数的考察
对确定的溶剂系统分别采用两种条件作考察，由首端向尾端洗脱，主机正转作为溶剂系统的上机操作条件，发现在转速恒定的条件下，以下相作流动相，上相作固定相时其保留值可达78%。同时发现增大转速或减少流速，都可以降低或消除固定相的带出现象；但流速过低时，分离时间延长，分离效率降低；而长期高速旋转，产生的热量将影响分离的稳定性。
4 样品的制备对分离的影响
由于样品不能单独溶于上相或下相，而采用等体积的上下两相配制样品溶液，可完全溶解样品，因此我们采用等体积的上下两相混合液溶解样品。
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5 检测手段
银杏萜类内酯的检测方法多采用示差折光检测器、蒸发激光散射检测器，由于仪器设备要求高，因此很难推广。我们采用TLC为检测手段，对馏分进行定性分析，能较准确反映馏分的组成，对实验结果进行分析鉴别，在此条件下，准确分离制得BB单体。 【参考文献】
[1] 蔡定国,缪平,顾明娟.高速逆流法从银杏叶分离异鼠李素、山奈素和槲皮素对照品[J].中药新药与临床药理,1999,10(1)∶44～45
[2] Guth A,Scheid F,Anton R. Analysis of terpenes from Ginkgo biloba L.by high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr, 1983,267(2)∶431～444
[3] Stephen G,Tallevi WG ,Kurz W.Detection of Ginkgolides by thin-layer chromatography[J].J Natur Produ,1991,54(2)∶624～630
[4] 颜玉贞，谢培山，钱浩泉.银杏叶萜类内酯的荧光薄层色谱鉴别研究[J].中药新药与临床药理, 1996,7(2)∶36～38
(收稿：2000-01-07 修回：2000-03-30), 百拇医药
单位：佘佳红(第二军医大学基础部新药评价中心，上海 200433)；柳正良(第二军医大学药学院药物分析教研室，上海 200433)；蔡定国(海军411医院，上海 200433)
关键词：高速逆流色谱；薄层色谱法；白果内酯
中国新药杂志000613 【摘要】 目的：以银杏叶粗提物为原料，利用高速逆流色谱法(HSCCC)分离制备得到白果内酯单体。方法：采用氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)的溶剂系统，待两相溶剂充分混合后，临用前将其分开，在室温下，下相作流动相，上相作固定相，以2.0 ml/min的流速，由首端向尾端洗脱，主机正转，转速为800r/min，固定相保留值为78%，进样2.0ml，定时收集馏分，用TLC鉴定。结果：经一次HSCCC即可分离制得白果内酯单体，TLC方法可用于银杏内酯的定性检测。结论：本方法简便、快速，为中草药有效成分的制备提供了一条新途径。
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【中图分类号】R914 【文献标识码】A
【文章编号】1003-3734(2000)06-0392-03
Separation and preparation of bilobalide by high speed
countercurrent liquid chromatigraphy
SHE Jia-hong
(Center of New Drugs Estimation,The Second Military University,Shanghai 200433)
LIU Zheng-liang
(Department of Pharmaceutical Analysis,The Second Military University,Shanghai 200433)
, 百拇医药
CAI Ding-guo
(The No.411 Hospital of Navy,Shanghai 200433)
【Abstract】 Objective:To establish a method for isolating bilobalide from crude Ginkgo Biloba extract(GBE).Methods:High speed countercurrent liquid chromatographic(HSCC)method was adopted.The solvent system was prepared by thoroughly mixing chloroform,methanol and water in proportions of 4∶3∶2,set aside at room temperature,before use the two layers were separated.The lower layer was used as mobile phase and the upper layer as stationary phase and eluted in a flow rate of 2.0 ml/min;and the apparatus was rotated in 800r/min.The eluant was collected and samples obtained were identified by TLC.Results:Bilobalide monomer can be obtained via a single separation and can be identified by TLC.Conclusions:A simple and rapid HSCC method is established for separation of bilobalide from crude Ginkgo Biloba extract and a new rout is provided for separation of active ingredients from traditional Chinese herbmedicines.
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【Key words】 high speed countercurrent chromatography; TLC; bilobalide
银杏萜类内酯具有特殊的药理作用，为银杏叶中特有的生物活性成分，由于其含量较低且紫外吸收很弱，检测较困难，对照品尚不能通过合成获得，因此直接影响到对银杏萜类内酯研究工作的深入进行。高速逆流色谱(HSCCC)具有特殊的分离方式，性能稳定，目前，该技术已成功制备了多种标准品[1]。本研究采用HSCCC-TLC从银杏叶粗提物一次流程中分离出白果内酯单体，方法简便、快速，为中草药有效成分的制备提供了一条新途径。
材料与方法
1 仪器与试药
89-A型高速逆流色谱仪 (北京新技术应用研究所)，银杏内酯A，B和白果内酯对照品(Sigma公司)，银杏内酯C对照品(中国药品生物制品鉴定所)，硅胶H(60型，青岛海洋化工厂)， 酸性氧化铝(100～200目，上海五四化学试剂厂)，甲醇、甲苯、乙酸乙酯、丙酮、无水醋酸钠、乙醇等均为分析纯，水为重蒸水。
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2 实验方法
2.1 对照品溶液的配制 分别精密称取银杏内酯A，B，C和白果内酯对照品(干燥至恒重)适量，加甲醇配成浓度各为1 mg/ml的对照品溶液。
2.2 样品溶液的制备 取一根20mm×360mm的玻璃柱，称取经400℃下活化5h的酸性氧化铝适量，按湿法装柱，称取银杏叶粗提物0.5g，用10ml甲醇溶解，上柱，用60ml甲醇洗脱，洗脱液挥发至干。配制氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)的两相系统，上下两相各取0.25ml，用此溶剂溶解经柱层析后的挥干物，配制成浓度约为1g/ml的样品液(以粗提物计)。
2.3 薄层层析条件 以银杏内酯A，B，C和白果内酯对照品溶液为标准对照，取4%醋酸钠改性的硅胶H 薄层板，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(4∶6∶2.7∶0.8)为展开剂，上行展开10cm，晾干，以醋酐熏20min，160℃下烘30min，然后在紫外灯(λ=365nm)下观察荧光，各内酯斑点呈不同程度的亮黄色。
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2.4 高速逆流色谱条件 采用氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)的溶剂系统，待两相溶剂充分混合后，临用前将其分开，在室温下，下相作流动相，上相作固定相，采用2.0 ml/min的流速，由首端向尾端洗脱，主机正转，转速为800r/min，固定相保留值为78%，进样2.0ml，定时收集馏分，用TLC鉴定。实验结束时，用氮气将固定相由首端向尾端推出，并依次用乙醇30ml，水40ml冲洗。
结 果
1 分离结果分析
由于银杏萜类内酯的紫外吸收较弱，因此在色谱图上未见有明显的吸收峰，我们采用TLC的方法对实验结果进行分析。从进样后25min开始，每隔5min收集馏分，经浓缩后与银杏萜类内酯对照品分别点样于薄层板上，按薄层层析条件展开、显色，发现50min以后收集的馏分出现银杏萜类内酯。因此，从进样后50min开始，每隔4min收集馏分，依次记为1，2，……共18份(运行120min)，将收集的馏分浓缩后点样于薄层板上，经展开、显色，与对照品比较，结果见图1。从图1可见：86～90，90～94min(第10,11号斑点)，2个馏分只显1个斑点，其Rf值与白果内酯(BB)一致；50～66min(第1～4号斑点)收集的馏份存在2个斑点，其Rf值与银杏内酯A(GA),银杏内酯B(GB)相似；66～86 min收集的馏分，与BB，银杏内酯C(GC)的Rf值对应位置有较弱的荧光斑点，且同时存在其他杂质；94min以后收集的馏分(第12～18斑点)呈复杂的混合斑点，Rf值偏小。
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图1 HSCCC收集馏份的TLC图
A为白果内酯对照斑点；1～18为各时间段收集的馏分的TLC结果
2 分离鉴定
经TLC鉴定馏出物，我们专门收集86～94min的馏分，并经多次进样，合并馏出物，挥干，对馏出物进行MS，IR光谱分析，MS：m/z:327(M)，270(M-56)，196(M-129),178,129,57(基峰),44；IRmax(cm-1)：3450(羟基),1800,1780, 1760(r-内酯) 。并经高效液相色谱分析，为单一峰，经与标准图谱对照确认为白果内酯。
讨 论
1 薄层层析展开剂的选择
按文献报道[3，4]的展开系统，分别进行考察后发现，其分离效果不令人满意，我们对此作了改进。采用甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇 (6∶4∶2.7∶0.8)为展开剂，其溶剂强度为3.99，分离效果好，斑点清晰集中，其Rf值GC,GB,GA,BB分别为0.28,0.46,0.54,0.65。
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2 溶剂系统的选择
2.1 溶剂配比、分层时间及两相比的测定 分别按不同的配比配制3种溶剂系统，在容积为10ml刻度试管中剧烈振荡1min，使溶液充分混合，然后立即垂直静置，记录溶剂从静置到分为澄清两层的时间，同时记录上下两相的比值,结果见表1。
表1 溶剂配比、分层时间及两相体积比 溶剂系统
配 比
分层时间(s)
上相/下相
四氯化碳-甲醇-水
5∶4∶1
22
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氯仿-甲醇-水
4∶3∶2
20
0.96
氯仿-正丙醇-甲醇-水
9∶1∶10.5∶8
26
1.22
2.2 分配比的测定 用60ml的分液漏斗，将上述3种溶剂系统配制20～30ml，分别取上下相各2ml，然后再将对应的两相等体积混合于10ml试管中，分别加入约0.1g的银杏叶粗提物，充分振荡，使样品在两相中完全溶解，然后分别取3个体系中上下相的粗提物溶液点样于TLC板上，按TLC条件展开观察，我们估算出银杏叶萜类内酯在氯仿-甲醇-水(4∶3∶2)体系中的分配比最接近1，其次为氯仿-正丙醇-甲醇-水(9∶1∶10.5∶8)体系；在四氯化碳-甲醇-水(5∶4∶1)体系中，下相基本没有银杏叶萜类内酯存在。
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在用HSCCC进行分离时，溶剂系统要求分层速度快、两相体积大体相等，分配比一般选择0.3
3 操作参数的考察
对确定的溶剂系统分别采用两种条件作考察，由首端向尾端洗脱，主机正转作为溶剂系统的上机操作条件，发现在转速恒定的条件下，以下相作流动相，上相作固定相时其保留值可达78%。同时发现增大转速或减少流速，都可以降低或消除固定相的带出现象；但流速过低时，分离时间延长，分离效率降低；而长期高速旋转，产生的热量将影响分离的稳定性。
4 样品的制备对分离的影响
由于样品不能单独溶于上相或下相，而采用等体积的上下两相配制样品溶液，可完全溶解样品，因此我们采用等体积的上下两相混合液溶解样品。
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5 检测手段
银杏萜类内酯的检测方法多采用示差折光检测器、蒸发激光散射检测器，由于仪器设备要求高，因此很难推广。我们采用TLC为检测手段，对馏分进行定性分析，能较准确反映馏分的组成，对实验结果进行分析鉴别，在此条件下，准确分离制得BB单体。 【参考文献】
[1] 蔡定国,缪平,顾明娟.高速逆流法从银杏叶分离异鼠李素、山奈素和槲皮素对照品[J].中药新药与临床药理,1999,10(1)∶44～45
[2] Guth A,Scheid F,Anton R. Analysis of terpenes from Ginkgo biloba L.by high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr, 1983,267(2)∶431～444
[3] Stephen G,Tallevi WG ,Kurz W.Detection of Ginkgolides by thin-layer chromatography[J].J Natur Produ,1991,54(2)∶624～630
[4] 颜玉贞，谢培山，钱浩泉.银杏叶萜类内酯的荧光薄层色谱鉴别研究[J].中药新药与临床药理, 1996,7(2)∶36～38
(收稿：2000-01-07 修回：2000-03-30), 百拇医药