总丹酚酸对局灶性脑缺血损伤及抗氧化酶活性的影响
作者：吴俊芳 王洁 张均田
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学药物研究所，北京 100050
关键词：总丹酚酸；局灶性脑缺血；缺血-再灌注；抗氧化酶；大鼠
中国新药杂志000706 【摘要】 目的：观察总丹酚酸(Sal)对大鼠局灶性脑缺血损伤及抗氧化酶活性的影响。方法：用插线法阻塞大鼠大脑中动脉(MCAO) 24 h再灌注2 h或24 h。梗塞灶面积用TTC染色分析，脑水含量用干湿重法，神经功能缺损采用8级评分。并分析缺血脑组织的4种抗氧化酶活性水平。结果：Sal 5.0, 10.0 mg/kg(于MCAO术后10 min及24 h由舌下静脉注射给药)可明显缩小脑梗塞面积，改善神经功能缺损，并减少脑水含量。大鼠MCAO 24 h再灌注初期(2 h)时，脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶(CAT)的活性明显升高，谷胱甘肽S-转移酶(GSH-ST)的活性显著下降。而在再灌注后期(24 h)，则SOD，GSH-PX及CAT活性显著下降，GSH-ST的活性进一步降低。Sal可在缺血再灌注状态下进一步升高SOD，GSH-PX及CAT活性，但对GSH-ST的水平无明显影响。结论：Sal对大鼠局灶性脑缺血损伤具有神经保护作用，此作用可能与SOD，GSH-PX及CAT活性水平的升高有关。：观察总丹酚酸(Sal)对大鼠局灶性脑缺血损伤及抗氧化酶活性的影响。方法：用插线法阻塞大鼠大脑中动脉(MCAO) 24 h再灌注2 h或24 h。梗塞灶面积用TTC染色分析，脑水含量用干湿重法，神经功能缺损采用8级评分。并分析缺血脑组织的4种抗氧化酶活性水平。结果：Sal 5.0, 10.0 mg/kg(于MCAO术后10 min及24 h由舌下静脉注射给药)可明显缩小脑梗塞面积，改善神经功能缺损，并减少脑水含量。大鼠MCAO 24 h再灌注初期(2 h)时，脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶(CAT)的活性明显升高，谷胱甘肽S-转移酶(GSH-ST)的活性显著下降。而在再灌注后期(24 h)，则SOD，GSH-PX及CAT活性显著下降，GSH-ST的活性进一步降低。Sal可在缺血再灌注状态下进一步升高SOD，GSH-PX及CAT活性，但对GSH-ST的水平无明显影响。结论：Sal对大鼠局灶性脑缺血损伤具有神经保护作用，此作用可能与SOD，GSH-PX及CAT活性水平的升高有关。
, 百拇医药
【中图分类号】R743.31 【文献标识码】A 【文章编号】1003-3734(2000)07-0452-04
Effects of total salvianolic acid on focal cerebral
ischemic injury and antioxidase activities
WU Jun-fang WANG Jie ZHANG Jun-tian
(Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences
and Peking Union Medical College,Beijing 100050)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective:To study the effects of total salvianolic acid(Sal)on focal cerebral ischemic injury and antioxidase activities.Methods:Focal cerebral ischemia in rats was produced by 24h occlusion of the middle cerebral artery(MCAO)and 2 or 24h reperfusion.The infarct area was measured by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)staining technique.The cerebral water content was determined by wet/dry weighing method and the content of neurological deficits were evaluated by 0～7 scales.The activities of 4 antioxidases in ischemic tissue of brain were analyzed.Results:The decrease in infarct area and water content as well as improvement in neurological deficits were significant by intravenous injection of Sal 5.0,10.0 mg/kg 24h post operation.A significant increase in activities of SOD,GSH-PX and catalase and significant decrease in activities of GSH-ST in rats were observed during the early stage of reperfusion.However,the activities of all the enzymes mentioned above were significantly decreased 24h after reperfusion.The activities of SOD,GSH-PX,and catalase under reperfusion could be risen further by Sal but no effect on GSH-ST.Conclusion:Sal has a neuroprotective effect against focal cerebral ischemic injury and this effect may be related to increase in activities of SOD,GSH-PX,and catalase.
, 百拇医药
【Key words】 total salvianolic acids; focal cerebral ischemia;ischemia-reperfusion; antioxidant enzyme;rats
总丹酚酸(total salvianolic acids, Sal)是从传统中药丹参中提取的含多个酚羟基的水溶性化合物。以往我室的研究发现[1～4]，Sal在体外能直接清除黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生的超氧阴离子及Fe2+-H2O2体系产生的羟自由基,可抗Fe2+-半胱氨酸诱导的肝微粒体脂质过氧化，对白内障和心肌缺血再灌注损伤有预防和治疗作用。丹酚酸A还能改善小鼠脑缺血再灌注所致的学习记忆功能障碍。新近的研究发现[5,6]，Sal具有抗脑缺血作用，可抑制小鼠脑突触体谷氨酸释放，并能抑制大鼠在体动静脉血栓形成。本实验在大鼠可逆性大脑中动脉阻塞(MCAO)模型上，观察Sal的神经保护作用及其对抗氧化酶活性的影响。
, 百拇医药
材料与方法
1 材料
药品与试剂：Sal由中国医学科学院药物研究所植化室提供，含丹酚酸A和B，迷迭香酸，原儿茶醛等酚类化合物，其中以高效液相分析法测得丹酚酸B的含量为40 %。临用前以生理盐水溶解成所需浓度。红四氮唑(TTC)为北京化工厂产品；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽S-转移酶(GSH-ST)测试试剂盒由南京建成生物工程公司提供。其余试剂均为市售分析纯。
动物：Wistar大鼠，雄性，体重320～380g，由中国医学科学院实验动物中心提供。
2 方法
2.1 局灶性脑缺血模型[7] 大鼠以水合氯醛350 mg/kg，ip麻醉，仰卧固定，颈正中切口，依次暴露右侧颈总、颈外和颈内动脉，结扎颈外动脉及其分枝和翼腭突动脉以阻断颅外来源的侧副循环血流。在颈总动脉远心端近分叉处插入一根经10 mol/L硝酸溶液处理的玻璃纤维 (直径 0.285 mm)，当进丝约19 mm时可明显感到阻力，同时可见颈内动脉颅外段弯曲、紧张，此时再插入约2 mm，表明线的头端已穿过大脑中动脉起始部。然后将颈总动脉残段用丝线结扎，以防插线脱落。再通时只须将纤维抽去。假手术组纤维仅进至颅底。
, 百拇医药
术中、术后室温严格控制在24～25 ℃，大鼠体温维持在36.5～37.5 ℃。
2.2 实验分组 大鼠被随机分为10组，8只/组，分别为：假手术组、缺血24 h再灌注2 h或24 h组、再灌2 h Sal组(于MCAO术后10 min及24 h iv Sal 2.5, 5.0, 10.0 mg/kg，再灌注2 h)、再灌24 h Sal组(于MCAO术后10 min、24 h及36 h iv Sal 2.5, 5.0, 10.0 mg/kg，再灌注24 h)、对照组(iv等容量生理盐水)。
2.3 神经功能缺损评分 大鼠MCAO 24 h再灌注2 h或24 h时进行行为评分。参照文献[8]方法，将神经功能缺损分为0～7级。
2.4 脑梗塞面积和水含量的测定 大鼠断头取脑，去掉嗅球、小脑及低位脑干，沿冠状面切成5片，立即置于TTC染液(含4 % TTC 1.5 ml, 1 mol/L K2HPO4 0.1 ml, 双蒸水3.4 ml) 5 ml中，避光37℃水浴孵育30 min。取出脑片放入10 %福尔马林中固定。正常组织染成玫瑰红色，坏死组织呈白色。用重量求积法测量梗塞面积，计算梗塞区域占全脑面积的百分比。用干湿重法测定脑水含量。大鼠MCAO 24 h时，断头取脑，去掉嗅球、小脑及低位脑干，立即称取湿重，置120 ℃的烤箱中烘烤约18 h后称取干重。
, 百拇医药
2.5 抗氧化酶活性的测定 大鼠断头取脑，去掉嗅球、小脑及低位脑干，在冰上用4 ml缓冲液(含250 mmol/L sucrose, Tris-HCl5 mmol/L, EDTA 0.1 mmol/L, pH 7.5) 制成10 %组织匀浆，经10 000×g于4 ℃离心20 min，取上清液按试剂盒说明书分别测定SOD，GSH-PX，CAT及GSH-ST的活性。蛋白质定量用Lowry法[9]。
3 统计方法
所有计量资料均以
±s表示，差异的显著性用t检验。
结 果
1 Sal对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用
大鼠MCAO 24 h再灌注2 h后，所有动物均出现了神经功能缺损，主要表现为提尾悬空时，左肩内旋，左前肢内收，肌力下降，行走时向左侧环转，生理盐水组尤为明显。脑组织出现明显的梗塞灶及水肿，见表1。
, 百拇医药
而在再灌注24 h时，由表2可见，大鼠的行为障碍更为明显，梗塞灶进一步扩大，脑水肿加重。于MCAO术后10 min，24 h或36 h iv Sal 2.5, 5.0, 10.0 mg/kg，能显著改善大鼠的神经功能缺损，缩小脑梗塞面积，减轻脑水含量。Sal的这种神经保护作用在MCAO后再灌注2 h尤为明显，其有效剂量低达2.5 mg/kg。
表1 Sal对MCAO 24 h再灌注2 h大鼠的神经
保护作用 (n=8,±s) 组 别
剂量
(mg/kg)
神经功能
评分 (%)
, 百拇医药
梗塞面积
(%)
脑水含量
(%)
假手术组
1.1±0.2
0
79.6±0.9
对照组
5.2±0.7a
27.7±3.2a
82.5±0.5a
, http://www.100md.com
Sal
2.5
4.3±0.6b
24.3±2.0b
81.8±0.6b
Sal
5.0
4.0±0.7c
19.8±1.9c
81.1±0.7b
Sal
, http://www.100md.com
10.0
3.4±0.5c
15.4±2.1c
80.4±0.7c
a：与假手术组比较P<0.01；与对照组比较b:P<0.05,c:P<0.01表2 Sal对MCAO 24 h再灌注24 h大鼠的神经
保护作用 (n=8,±s) 组 别
剂量
(mg/kg)
神经功能
, 百拇医药
评分 (%)
梗塞面积
(%)
脑水含量
(%)
假手术组
1.2±0.2
0
79.3±0.8
对照组
5.6±0.9a
30.2±3.9a
, http://www.100md.com
83.2±0.9a
Sal
2.5
5.0±0.8
28.2±3.7
82.7±0.9
Sal
5.0
4.7±0.6b
25.5±2.8b
82.2±0.6b
, http://www.100md.com
Sal
10.0
4.0±0.5c
19.3±2.3c
81.5±0.6c
a：与假手术组比较P<0.01；与对照组比较 b:P<0.05, c:P<0.01
2 Sal对抗氧化酶活性的影响
大鼠MCAO24 h再灌注2 h时，脑组织SOD，GSH-PX及CAT的活性明显升高，而GSH-ST的活性则显著下降，与假手术组比较，P<0.01。而至再灌注24 h时，上述4种抗氧化酶的活性均出现明显降低。于术后10 min，24 h或36 h iv Sal 2.5, 5.0, 10.0 mg/kg，可进一步升高缺血再灌2 h时脑组织SOD，GSH-PX及CAT的活性，显著抑制再灌24 h时脑组织SOD，GSH-PX及CAT活性的下降，而对GSH-ST活性则无明显影响，见表3，4。
, http://www.100md.com
表3 Sal对MCAO 24 h再灌注2 h大鼠脑组织抗氧化酶
活性的影响 (n=8,±s) 组 别
剂量
(mg/kg)
SOD
(kU/g蛋白)
GSH-PX
(kU/g蛋白)
CAT
(U/g蛋白)
, http://www.100md.com GSH-ST
(kU/g蛋白)
假手术组
5.02±0.64
12.5±0.9
155±18
29.7±1.5
对照组
7.84±0.65a
15.9±1.6a
204±19a
, 百拇医药 23.5±1.2a
Sal
2.5
8.81±0.87b
16.3±1.7
229±16b
23.1±1.6
Sal
5.0
8.95±0.82c
17.8±1.8b
, http://www.100md.com
246±22 c
24.2±2.0
Sal
10.0
9.45±1.21c
19.4±2.1c
273±45c
24.8±2.3
a：与假手术组比较P<0.01；与对照组比较b:P<0.05,c:P<0.01表4 Sal对MCAO 24 h再灌注24 h大鼠脑组织
抗氧化酶活性的影响 (n=8,±s) 组 别
, 百拇医药
剂量
(mg/kg)
SOD
(kU/g蛋白)
GSH-PX
(kU/g蛋白)
CAT
(U/g蛋白)
GSH-ST
(kU/g蛋白)
假手术组
5.37±0.82
, http://www.100md.com 13.8±1.1
162±19
27.6±1.4
对照组
3.66±0.71a
9.4±0.8a
129±12a
19.9±1.2a
Sal
2.5
3.82±0.85
, 百拇医药
9.8±1.0
135±15
19.2±0.9
Sal
5.0
4.69±0.93b
11.2±1.6b
148±17b
20.7±1.3
Sal
10.0
5.25±0.82c
, http://www.100md.com
12.7±1.8c
157±22c
22.8±1.7
a：与假手术组比较P<0.01；与对照组比较 b:P<0.05,c:P<0.01讨 论
临床上脑卒中患者以局部脑缺血为多见，而人类缺血性脑卒中的好发部位多在大脑中动脉及其分枝，故选择阻断大脑中动脉形成局灶性脑缺血的模型与人类脑卒中最为相似。本实验采用玻璃纤维自颈外动脉和颈总动脉的起始部导入颈内动脉，使其到达威利氏环及中脑动脉起始部位，从而阻断中脑动脉血流，减少了开颅电凝中脑动脉对脑组织的创伤和刺激，且可抽出玻璃纤维使其再通而造成缺血再灌注模型。用此模型研究药物对脑缺血再灌注损伤的影响，所获结果有实际应用价值。本实验在可逆性MCAO模型上观察到，Sal对局灶性脑缺血再灌注损伤具有明显的神经保护作用。这与我们在心肌缺血再灌注实验的结果是一致的。
, 百拇医药
众所周知，氧自由基在脑缺血尤其是脑缺血再灌注损伤中起着重要作用。因此，我们分析了大鼠脑缺血状态下4种抗氧化酶活性的变化。SOD能直接清除超氧阴离子，GSH-PX和CAT在细胞代谢过程中可还原或清除H2O2。我们的实验结果显示，在脑缺血再灌初期，脑组织SOD，GSH-PX及CAT的活性明显升高，这与Bidmon[10]和Ter-Horst[11]等的局部脑缺血缺氧损伤诱导抗氧化酶活性增高的报道是一致的。目前认为[12]，缺血初期抗氧化酶活性的升高是机体对氧自由基损害细胞的一种自我防御反应。而至缺血再灌后期，氧自由基大量产生，机体自身的抗氧化酶大量消耗，从而导致SOD，GSH-PX及CAT活性的显著下降。Sal通过进一步升高再灌初期抗氧化酶的活性，显著抑制再灌后期抗氧化酶活性的降低来保护脑组织免受缺血再灌损伤，这与其在体外具强大的抗氧化作用是一致的。
至于Sal的抗氧化作用机制，推测是由于Sal本身具有大量的酚羟基和很大的共扼π键，其自身可作为还原性物质接受氧化性物质如氧自由基的攻击，或作为电子转移媒介，改变自由基的氧化反应途径而保护机体免受氧化损伤。
, 百拇医药
GSH-ST具抗脂质过氧化及排除外来毒素作用。本实验显示，脑缺血再灌注损伤后，脑组织GSH-ST活性显著降低，这反映了脑缺血后神经元出现大量死亡。Sal对该酶的活性无明显影响。
综上所述，脑缺血再灌注损伤不同阶段对SOD，GSH-PX，CAT及GSH-ST活性的影响是不同的。再灌初期，SOD，GSH-PX及CAT活性明显升高，而再灌后期，这三种酶的活性显著下降。GSH-ST活性不论在再灌初期或后期，均处于降低水平。Sal通过升高SOD，GSH-PX及CAT活性发挥神经保护作用。
基金项目：国家科委1035工程新药基金资助(K95-12-27)及国家重点基础研究发展规划(973)支持项目(G1998051109)
【作者简介】 吴俊芳(1964-)，女，副研究员，博士学位。在中国医学科学院药物研究所读博士后2年，现为副研究员，硕士生导师。研究方向：抗脑缺血和抗老年痴呆新药研究。联系电话：(010)63165181。
, 百拇医药
【参考文献】
[1] Liu Y, Zhang JT. Hydroxyl radical scavenging effect of salvianolic acids[J]. J Chin Pharm Sci, 1994,3(1)∶43～50
[2] 黄诒森，张均田. 丹参中三种水溶性成分的体外抗氧化作用[J]. 药学学报, 1992, 27(2)∶96～100
[3] 王洁，吴俊芳，张均田. 总丹酚酸的抗脑缺血研究[J]. 中国药理学通报, 1999, 15(2)∶164～166
[4] 杜冠华, 张均田. 丹酚酸A对小鼠脑缺血再灌致学习记忆功能障碍的改善作用[J]. 药学学报, 1995，30∶151～158
[5] 王洁，张均田. 总丹酚酸抗脑缺血与抗血栓的关系[J]. 中国药理学通报, 1999, 15(3)∶237～239
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[6] 王洁，张均田. 总丹酚酸的抗脑缺血和抑制谷氨酸释放作用[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 1999, 13(3)∶197～199
[7] Longa EZ, Weinstein PR, Carison S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20(1)∶84～91
[8] Zhang YG, Liu TP, Qian ZY, et al. Influence of total saponins of Panax ginseng on infarct size and polyamine contents in rat brain after middle cerebral artery occlusion[J]. Chin J Pharmacol Toxicol, 1994, 8(4)∶250～253
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[9] Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, et al. Protein measurement with the folin phenol reagent[J]. J Biol Chem, 1951, 193(3)∶265～271
[10] Bidmon HJ, Oermann E, Schleicher A, et al. Copper-Zinc superoxide dismutaseand isolectin B4 binding are markers for associative and transhemispheric diaschisis induced by focal ischemia in rat cortex[J]. Neurosci Lett, 1997, 228∶163～166
[11] Ter-Horst GJ, Knollema S, Stuiver B, et al. Differential glutathione peroxidase mRNA up-regulations in rat forebrain areas after transient hypoxia-ischemia[J]. Ann NY Acad Sci, 1994, 738∶329～333
[12] Bidmon HJ, Kato K, Schleicher A, et al. Transient increase of manganese-superoxide dismutase in remote brain areas after focal photothrombotic cortical lesion[J]. Stroke, 1998, 29∶203～210
收稿：1999-10-29, 百拇医药
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学药物研究所，北京 100050
关键词：总丹酚酸；局灶性脑缺血；缺血-再灌注；抗氧化酶；大鼠
中国新药杂志000706 【摘要】 目的：观察总丹酚酸(Sal)对大鼠局灶性脑缺血损伤及抗氧化酶活性的影响。方法：用插线法阻塞大鼠大脑中动脉(MCAO) 24 h再灌注2 h或24 h。梗塞灶面积用TTC染色分析，脑水含量用干湿重法，神经功能缺损采用8级评分。并分析缺血脑组织的4种抗氧化酶活性水平。结果：Sal 5.0, 10.0 mg/kg(于MCAO术后10 min及24 h由舌下静脉注射给药)可明显缩小脑梗塞面积，改善神经功能缺损，并减少脑水含量。大鼠MCAO 24 h再灌注初期(2 h)时，脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶(CAT)的活性明显升高，谷胱甘肽S-转移酶(GSH-ST)的活性显著下降。而在再灌注后期(24 h)，则SOD，GSH-PX及CAT活性显著下降，GSH-ST的活性进一步降低。Sal可在缺血再灌注状态下进一步升高SOD，GSH-PX及CAT活性，但对GSH-ST的水平无明显影响。结论：Sal对大鼠局灶性脑缺血损伤具有神经保护作用，此作用可能与SOD，GSH-PX及CAT活性水平的升高有关。：观察总丹酚酸(Sal)对大鼠局灶性脑缺血损伤及抗氧化酶活性的影响。方法：用插线法阻塞大鼠大脑中动脉(MCAO) 24 h再灌注2 h或24 h。梗塞灶面积用TTC染色分析，脑水含量用干湿重法，神经功能缺损采用8级评分。并分析缺血脑组织的4种抗氧化酶活性水平。结果：Sal 5.0, 10.0 mg/kg(于MCAO术后10 min及24 h由舌下静脉注射给药)可明显缩小脑梗塞面积，改善神经功能缺损，并减少脑水含量。大鼠MCAO 24 h再灌注初期(2 h)时，脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和过氧化氢酶(CAT)的活性明显升高，谷胱甘肽S-转移酶(GSH-ST)的活性显著下降。而在再灌注后期(24 h)，则SOD，GSH-PX及CAT活性显著下降，GSH-ST的活性进一步降低。Sal可在缺血再灌注状态下进一步升高SOD，GSH-PX及CAT活性，但对GSH-ST的水平无明显影响。结论：Sal对大鼠局灶性脑缺血损伤具有神经保护作用，此作用可能与SOD，GSH-PX及CAT活性水平的升高有关。
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【中图分类号】R743.31 【文献标识码】A 【文章编号】1003-3734(2000)07-0452-04
Effects of total salvianolic acid on focal cerebral
ischemic injury and antioxidase activities
WU Jun-fang WANG Jie ZHANG Jun-tian
(Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences
and Peking Union Medical College,Beijing 100050)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective:To study the effects of total salvianolic acid(Sal)on focal cerebral ischemic injury and antioxidase activities.Methods:Focal cerebral ischemia in rats was produced by 24h occlusion of the middle cerebral artery(MCAO)and 2 or 24h reperfusion.The infarct area was measured by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)staining technique.The cerebral water content was determined by wet/dry weighing method and the content of neurological deficits were evaluated by 0～7 scales.The activities of 4 antioxidases in ischemic tissue of brain were analyzed.Results:The decrease in infarct area and water content as well as improvement in neurological deficits were significant by intravenous injection of Sal 5.0,10.0 mg/kg 24h post operation.A significant increase in activities of SOD,GSH-PX and catalase and significant decrease in activities of GSH-ST in rats were observed during the early stage of reperfusion.However,the activities of all the enzymes mentioned above were significantly decreased 24h after reperfusion.The activities of SOD,GSH-PX,and catalase under reperfusion could be risen further by Sal but no effect on GSH-ST.Conclusion:Sal has a neuroprotective effect against focal cerebral ischemic injury and this effect may be related to increase in activities of SOD,GSH-PX,and catalase.
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【Key words】 total salvianolic acids; focal cerebral ischemia;ischemia-reperfusion; antioxidant enzyme;rats
总丹酚酸(total salvianolic acids, Sal)是从传统中药丹参中提取的含多个酚羟基的水溶性化合物。以往我室的研究发现[1～4]，Sal在体外能直接清除黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生的超氧阴离子及Fe2+-H2O2体系产生的羟自由基,可抗Fe2+-半胱氨酸诱导的肝微粒体脂质过氧化，对白内障和心肌缺血再灌注损伤有预防和治疗作用。丹酚酸A还能改善小鼠脑缺血再灌注所致的学习记忆功能障碍。新近的研究发现[5,6]，Sal具有抗脑缺血作用，可抑制小鼠脑突触体谷氨酸释放，并能抑制大鼠在体动静脉血栓形成。本实验在大鼠可逆性大脑中动脉阻塞(MCAO)模型上，观察Sal的神经保护作用及其对抗氧化酶活性的影响。
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材料与方法
1 材料
药品与试剂：Sal由中国医学科学院药物研究所植化室提供，含丹酚酸A和B，迷迭香酸，原儿茶醛等酚类化合物，其中以高效液相分析法测得丹酚酸B的含量为40 %。临用前以生理盐水溶解成所需浓度。红四氮唑(TTC)为北京化工厂产品；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽S-转移酶(GSH-ST)测试试剂盒由南京建成生物工程公司提供。其余试剂均为市售分析纯。
动物：Wistar大鼠，雄性，体重320～380g，由中国医学科学院实验动物中心提供。
2 方法
2.1 局灶性脑缺血模型[7] 大鼠以水合氯醛350 mg/kg，ip麻醉，仰卧固定，颈正中切口，依次暴露右侧颈总、颈外和颈内动脉，结扎颈外动脉及其分枝和翼腭突动脉以阻断颅外来源的侧副循环血流。在颈总动脉远心端近分叉处插入一根经10 mol/L硝酸溶液处理的玻璃纤维 (直径 0.285 mm)，当进丝约19 mm时可明显感到阻力，同时可见颈内动脉颅外段弯曲、紧张，此时再插入约2 mm，表明线的头端已穿过大脑中动脉起始部。然后将颈总动脉残段用丝线结扎，以防插线脱落。再通时只须将纤维抽去。假手术组纤维仅进至颅底。
, 百拇医药
术中、术后室温严格控制在24～25 ℃，大鼠体温维持在36.5～37.5 ℃。
2.2 实验分组 大鼠被随机分为10组，8只/组，分别为：假手术组、缺血24 h再灌注2 h或24 h组、再灌2 h Sal组(于MCAO术后10 min及24 h iv Sal 2.5, 5.0, 10.0 mg/kg，再灌注2 h)、再灌24 h Sal组(于MCAO术后10 min、24 h及36 h iv Sal 2.5, 5.0, 10.0 mg/kg，再灌注24 h)、对照组(iv等容量生理盐水)。
2.3 神经功能缺损评分 大鼠MCAO 24 h再灌注2 h或24 h时进行行为评分。参照文献[8]方法，将神经功能缺损分为0～7级。
2.4 脑梗塞面积和水含量的测定 大鼠断头取脑，去掉嗅球、小脑及低位脑干，沿冠状面切成5片，立即置于TTC染液(含4 % TTC 1.5 ml, 1 mol/L K2HPO4 0.1 ml, 双蒸水3.4 ml) 5 ml中，避光37℃水浴孵育30 min。取出脑片放入10 %福尔马林中固定。正常组织染成玫瑰红色，坏死组织呈白色。用重量求积法测量梗塞面积，计算梗塞区域占全脑面积的百分比。用干湿重法测定脑水含量。大鼠MCAO 24 h时，断头取脑，去掉嗅球、小脑及低位脑干，立即称取湿重，置120 ℃的烤箱中烘烤约18 h后称取干重。
, 百拇医药
2.5 抗氧化酶活性的测定 大鼠断头取脑，去掉嗅球、小脑及低位脑干，在冰上用4 ml缓冲液(含250 mmol/L sucrose, Tris-HCl5 mmol/L, EDTA 0.1 mmol/L, pH 7.5) 制成10 %组织匀浆，经10 000×g于4 ℃离心20 min，取上清液按试剂盒说明书分别测定SOD，GSH-PX，CAT及GSH-ST的活性。蛋白质定量用Lowry法[9]。
3 统计方法
所有计量资料均以
±s表示，差异的显著性用t检验。结 果
1 Sal对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用
大鼠MCAO 24 h再灌注2 h后，所有动物均出现了神经功能缺损，主要表现为提尾悬空时，左肩内旋，左前肢内收，肌力下降，行走时向左侧环转，生理盐水组尤为明显。脑组织出现明显的梗塞灶及水肿，见表1。
, 百拇医药
而在再灌注24 h时，由表2可见，大鼠的行为障碍更为明显，梗塞灶进一步扩大，脑水肿加重。于MCAO术后10 min，24 h或36 h iv Sal 2.5, 5.0, 10.0 mg/kg，能显著改善大鼠的神经功能缺损，缩小脑梗塞面积，减轻脑水含量。Sal的这种神经保护作用在MCAO后再灌注2 h尤为明显，其有效剂量低达2.5 mg/kg。
表1 Sal对MCAO 24 h再灌注2 h大鼠的神经
保护作用 (n=8,
±s) 组 别剂量
(mg/kg)
神经功能
评分 (%)
, 百拇医药
梗塞面积
(%)
脑水含量
(%)
假手术组
1.1±0.2
0
79.6±0.9
对照组
5.2±0.7a
27.7±3.2a
82.5±0.5a
, http://www.100md.com
Sal
2.5
4.3±0.6b
24.3±2.0b
81.8±0.6b
Sal
5.0
4.0±0.7c
19.8±1.9c
81.1±0.7b
Sal
, http://www.100md.com
10.0
3.4±0.5c
15.4±2.1c
80.4±0.7c
a：与假手术组比较P<0.01；与对照组比较b:P<0.05,c:P<0.01表2 Sal对MCAO 24 h再灌注24 h大鼠的神经
保护作用 (n=8,
±s) 组 别剂量
(mg/kg)
神经功能
, 百拇医药
评分 (%)
梗塞面积
(%)
脑水含量
(%)
假手术组
1.2±0.2
0
79.3±0.8
对照组
5.6±0.9a
30.2±3.9a
, http://www.100md.com
83.2±0.9a
Sal
2.5
5.0±0.8
28.2±3.7
82.7±0.9
Sal
5.0
4.7±0.6b
25.5±2.8b
82.2±0.6b
, http://www.100md.com
Sal
10.0
4.0±0.5c
19.3±2.3c
81.5±0.6c
a：与假手术组比较P<0.01；与对照组比较 b:P<0.05, c:P<0.01
2 Sal对抗氧化酶活性的影响
大鼠MCAO24 h再灌注2 h时，脑组织SOD，GSH-PX及CAT的活性明显升高，而GSH-ST的活性则显著下降，与假手术组比较，P<0.01。而至再灌注24 h时，上述4种抗氧化酶的活性均出现明显降低。于术后10 min，24 h或36 h iv Sal 2.5, 5.0, 10.0 mg/kg，可进一步升高缺血再灌2 h时脑组织SOD，GSH-PX及CAT的活性，显著抑制再灌24 h时脑组织SOD，GSH-PX及CAT活性的下降，而对GSH-ST活性则无明显影响，见表3，4。
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表3 Sal对MCAO 24 h再灌注2 h大鼠脑组织抗氧化酶
活性的影响 (n=8,
±s) 组 别剂量
(mg/kg)
SOD
(kU/g蛋白)
GSH-PX
(kU/g蛋白)
CAT
(U/g蛋白)
, http://www.100md.com GSH-ST
(kU/g蛋白)
假手术组
5.02±0.64
12.5±0.9
155±18
29.7±1.5
对照组
7.84±0.65a
15.9±1.6a
204±19a
, 百拇医药 23.5±1.2a
Sal
2.5
8.81±0.87b
16.3±1.7
229±16b
23.1±1.6
Sal
5.0
8.95±0.82c
17.8±1.8b
, http://www.100md.com
246±22 c
24.2±2.0
Sal
10.0
9.45±1.21c
19.4±2.1c
273±45c
24.8±2.3
a：与假手术组比较P<0.01；与对照组比较b:P<0.05,c:P<0.01表4 Sal对MCAO 24 h再灌注24 h大鼠脑组织
抗氧化酶活性的影响 (n=8,
±s) 组 别, 百拇医药
剂量
(mg/kg)
SOD
(kU/g蛋白)
GSH-PX
(kU/g蛋白)
CAT
(U/g蛋白)
GSH-ST
(kU/g蛋白)
假手术组
5.37±0.82
, http://www.100md.com 13.8±1.1
162±19
27.6±1.4
对照组
3.66±0.71a
9.4±0.8a
129±12a
19.9±1.2a
Sal
2.5
3.82±0.85
, 百拇医药
9.8±1.0
135±15
19.2±0.9
Sal
5.0
4.69±0.93b
11.2±1.6b
148±17b
20.7±1.3
Sal
10.0
5.25±0.82c
, http://www.100md.com
12.7±1.8c
157±22c
22.8±1.7
a：与假手术组比较P<0.01；与对照组比较 b:P<0.05,c:P<0.01讨 论
临床上脑卒中患者以局部脑缺血为多见，而人类缺血性脑卒中的好发部位多在大脑中动脉及其分枝，故选择阻断大脑中动脉形成局灶性脑缺血的模型与人类脑卒中最为相似。本实验采用玻璃纤维自颈外动脉和颈总动脉的起始部导入颈内动脉，使其到达威利氏环及中脑动脉起始部位，从而阻断中脑动脉血流，减少了开颅电凝中脑动脉对脑组织的创伤和刺激，且可抽出玻璃纤维使其再通而造成缺血再灌注模型。用此模型研究药物对脑缺血再灌注损伤的影响，所获结果有实际应用价值。本实验在可逆性MCAO模型上观察到，Sal对局灶性脑缺血再灌注损伤具有明显的神经保护作用。这与我们在心肌缺血再灌注实验的结果是一致的。
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众所周知，氧自由基在脑缺血尤其是脑缺血再灌注损伤中起着重要作用。因此，我们分析了大鼠脑缺血状态下4种抗氧化酶活性的变化。SOD能直接清除超氧阴离子，GSH-PX和CAT在细胞代谢过程中可还原或清除H2O2。我们的实验结果显示，在脑缺血再灌初期，脑组织SOD，GSH-PX及CAT的活性明显升高，这与Bidmon[10]和Ter-Horst[11]等的局部脑缺血缺氧损伤诱导抗氧化酶活性增高的报道是一致的。目前认为[12]，缺血初期抗氧化酶活性的升高是机体对氧自由基损害细胞的一种自我防御反应。而至缺血再灌后期，氧自由基大量产生，机体自身的抗氧化酶大量消耗，从而导致SOD，GSH-PX及CAT活性的显著下降。Sal通过进一步升高再灌初期抗氧化酶的活性，显著抑制再灌后期抗氧化酶活性的降低来保护脑组织免受缺血再灌损伤，这与其在体外具强大的抗氧化作用是一致的。
至于Sal的抗氧化作用机制，推测是由于Sal本身具有大量的酚羟基和很大的共扼π键，其自身可作为还原性物质接受氧化性物质如氧自由基的攻击，或作为电子转移媒介，改变自由基的氧化反应途径而保护机体免受氧化损伤。
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GSH-ST具抗脂质过氧化及排除外来毒素作用。本实验显示，脑缺血再灌注损伤后，脑组织GSH-ST活性显著降低，这反映了脑缺血后神经元出现大量死亡。Sal对该酶的活性无明显影响。
综上所述，脑缺血再灌注损伤不同阶段对SOD，GSH-PX，CAT及GSH-ST活性的影响是不同的。再灌初期，SOD，GSH-PX及CAT活性明显升高，而再灌后期，这三种酶的活性显著下降。GSH-ST活性不论在再灌初期或后期，均处于降低水平。Sal通过升高SOD，GSH-PX及CAT活性发挥神经保护作用。
基金项目：国家科委1035工程新药基金资助(K95-12-27)及国家重点基础研究发展规划(973)支持项目(G1998051109)
【作者简介】 吴俊芳(1964-)，女，副研究员，博士学位。在中国医学科学院药物研究所读博士后2年，现为副研究员，硕士生导师。研究方向：抗脑缺血和抗老年痴呆新药研究。联系电话：(010)63165181。
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【参考文献】
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收稿：1999-10-29, 百拇医药