薄层色谱扫描法检测茶碱中毒者和哮喘患者血清中茶碱浓度
作者：贠克明 王秀汝 田树华 卫满升
单位：贠克明(山西医科大学，太原 030001)；王秀汝(首都医科大学宣武医院，北京 100053)；田树华(山西医科大学，太原 030001)；卫满升(山西省运城地区公安处技术科，运城 044300)
关键词：茶碱；薄层色谱扫描；血清
中国新药杂志000910 [摘要]目的：建立血清中茶碱的提取和薄层色谱扫描定性和定量检测方法。方法：血清用1%盐酸酸化，乙醚-二氯甲烷(6∶4)或氯仿萃取，点于GF254薄层板上，正庚烷∶三氯甲烷∶无水乙醇∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸(5∶2∶2∶1.5∶2.5∶0.5)展开；薄层扫描检测。结果：茶碱薄层层析Rf值为0.35；最大吸收波长为275nm；血中茶碱线性检测范围为1～24μg/ml，最小检出浓度为0.4μg/ml。结论：本法快速、简便、定性定量准确，可用于茶碱中毒的快速诊断和体内药物浓度监测。
, http://www.100md.com
[中图分类号]R927.11；R974.3 [文献标识码]B [文章编号]1003-3734(2000)09-0618-03
Determination of serum theophylline by TLC scanning
in cases of theophylline poison
YUN Ke-ming TIAN Shu-hua
(Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)
WANG Xiu-ru
(Xuanwu Hospital，Capital University of Medical Sciences,Beijing 100053，China)
, 百拇医药
WEI Man-sheng
(Technical Section,Local Public Department of Yuncheng City,Yuncheng 044300,China)
[Abstract]Objective:To establish a rapid method for determination of theophylline in serum.Methods:Serum sample is acidified with 1% HCl,then extracted with ether-dicholromethane(v/v=6/4) or chloroform.The extract is applied to a GF254 TLC plate and developed with a solvent mixture of n-heptane∶chloroform∶ethanol∶ethyl acetate∶methanol∶acetic acid(5∶2∶2∶1.5∶2.5∶0.5) and then determined by TLC scanning.Results:The Rf value for theophylline is 0.35 with a maximum absorption at 275 nm.The liner range of theophylline is 1～24μg/ml with a detection limit of 0.4μg/ml.Conclusion:A rapid,convinient,and accurate method for qualitative and quantitative determination of theophylline in serum is established.Theophylline poisoning and serum theophylline level can be determined by this method.
, 百拇医药
[Key words] theophylline;TLC scanning;serum
茶碱(theophylline,TP)是临床常用的抗哮喘药，临床常用其衍生物氨茶碱(aminophylline,AP)。TP在人体内代谢与年龄、肝肾功能和配伍用药等因素有关[1～3]，其治疗窗狭窄，有效血药浓度为10～20μg/ml，用药时间较长，易出现不良反应，必须进行血药浓度监测。偶见口服大量氨茶碱中毒者，需进行血中茶碱快速定性定量检测。TP的血药浓度检测方法有GC法、HPLC法、荧光分光光度法、UV法、EIA法、RIA法和FPIA法[1，2，4～6]，以UV法、HPLC法和FPIA法应用较多，但定性效果较差。血中TP的TLC法检测报道较少，但定性效果较好。本实验从临床茶碱中毒快速诊断需要出发，建立血清中茶碱的提取和薄层扫描定性定量检测方法，并应用于服药过量中毒的诊断和哮喘患者血药浓度监测。
材料和方法
, 百拇医药
1 试剂和药品
TP(纯度97%)对照品购自公安部第二研究所，其余试剂为分析纯。标准溶液：1mg/ml TP对照品甲醇乙醇溶液，4℃冰箱保存。
2 主要仪器及检测条件
CS-930薄层扫描仪。光谱扫描：Difference扫描方式；色谱扫描：双波长锯齿形扫描，λ1=275nm,λ2=310nm,sx=3,记录峰面积。
3 薄层层析条件
薄层板：HSGF25410cm×10cm×0.25mm;展开剂：正庚烷∶三氯甲烷∶无水乙醇∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸(5∶2∶2∶1.5∶2.5∶0.5)，上行展开5～7cm。
, http://www.100md.com 4 薄层扫描响应曲线和扫描精密度
标准溶液(0.2，0.4，1，2，4，8，12，16，20μl)点板，展开，扫描。建立的TP薄层扫描响应曲线回归方程为Y=831+13684X，式中Y为斑点扫描面积积分值，X为斑点内TP含量(μg/斑点)，r=0.9998,P<0.01，线性响应范围为0.4～12μg/斑点，最小检出量为0.2μg/斑点。TP的板内扫描精密度为2.1%(5μg/斑点)，2.5%(10μg/斑点)和2.0%(15μg/斑点)；板间扫描精密度为3.2%(5μg/斑点)，3.7%(10μg/斑点)和4.1%(15μg/斑点)；日内扫描精密度为3.4%(5μg/斑点)，4.1%(10μg/斑点)和3.9%(15μg/斑点)。
5 提取与检测
血清1ml,加1%盐酸1ml,5ml乙醚-二氯甲烷(v/v,6∶4)或氯仿萃取1次。同时取空白血清2分，分别加入标准溶液10μl和20μl，与检材平行萃取。萃取液40～50℃或70℃水浴氮气流挥干，20μl乙醇定容，10μl点样，按前述方法展开。紫外灯下确定斑点位置，光谱扫描结合Rf值定性，薄层扫描外标两点法或工作曲线法定量。
, http://www.100md.com
6 工作曲线和提取回收率
空白血清10分，分别加入标准溶液0.2，0.4，1，2，4，8，12，18，24，32μl，按前述方法氯仿提取、展开和扫描，建立的血清TP的检测工作曲线方程为：Y=-4.378×10-2+1.823×10-4X(r=0.9992)。式中Y为血清中TP含量(μg/ml)，X为斑点扫描面积积分值。线性检测范围为1～24μg/ml，最小检出浓度为0.4μg/ml。空白血清中添加TP，日内提取回收率为(103.4±3.6)%(5μg/ml)，(100.2±2.8)%(10μg/ml)和(96.45±4.6)% (20μg/ml)；日间提取回收率为(99.6±3.9)%(5μg/ml)，(101.2±4.8)%(10μg/ml)和(96.45±4.8)%(20μg/ml)。
7 病例检测
中毒患者取血5ml立即送检(也可取第1遍洗胃液一同送检)。哮喘患者常规使用AP，4～5d后，清晨用药前和用药后(口服为1.5h;静注为0.5h)各采血3～4ml送检。
, 百拇医药
结 果
1 薄层色谱
TP薄层层析Rf值为0.35，光谱扫描图见图1，色谱扫描显示TP斑点扫描峰形对称，TP与血液提取物中杂质分离完全。碘化铋钾显色，TP斑点呈棕色，灵敏度为0.1μg/斑点。
图1 TP光谱扫描图
表1 哮喘患者血清TP浓度(μg/ml) 病例号
给药
方式
血清TP浓度
病例号
, http://www.100md.com
给药
方式
血清TP浓度
药后24h
药后1.5h
药后24h
药后0.5h
1
po
7.6
16.3
13
iv
, http://www.100md.com
4.6
9.3
2
po
4.6
15.2
14
iv
6.8
13.4
3
po
8.9
, 百拇医药 19.4
15
iv
9.4
23.4
4
po
10.3
20.4
16
iv
8.5
19.4
, 百拇医药 5
po
13.1
19.5
17
iv
13.1
24.2
6
po
5.9
13.2
18
iv
, 百拇医药
10.3
18.4
7
po
9.4
14.7
19
iv
5.7
12.4
8
po
7.6
, http://www.100md.com 15.8
20
iv
12.4
19.8
9
po
11.4
22.9
21
iv
9.4
18.2
, 百拇医药 10
po
4.2
11.2
22
iv
8.8
17.4
11
po
6.8
16.4
23
iv
, 百拇医药
6.4
14.2
12
po
10.4
18.1
24
iv
10.5
24.8
8.4
16.9
, 百拇医药
8.8
17.9
s
2.7
3.3
s
2.6
4.9
讨 论 TP的薄层层析色谱行为、斑点扫描精密度和薄层扫描线性响应范围、血清中TP提取回收率和精密度、检测线性范围、最小检出浓度均达到生物检材内药物检测和体内血药浓度监测的要求[2～8]，可用于TP的中毒快速诊断和血药浓度监测。本实验曾用外标两点法检测斑点内TP绝对含量，考查TP的绝对回收率。氯仿与乙醚-二氯甲烷溶剂均为较好提取溶剂，而后者操作方便，毒性相对较小。
, 百拇医药
中毒和哮喘患者检测结果均与临床表现一致，调整剂量后，哮喘患者哮喘和中毒症状改善。本实验建立的TP的提取和薄层扫描检测方法与文献[4～6]相比，具有操作简便快速、定性定量准确的特点，适合于TP中毒快速诊断和血药浓度监测。碘化铋钾显色后，Rf值结合斑点颜色也可定性，并可进行目测半定量，便于基层医院开展。
作者简介：贠克明(1964-)，男，山西医科大学法医学系副教授，硕士，在读博士，主要从事体内药(毒)物分析和肝脏病理生理学研究。联系电话：(0351)4135142。
参考文献
[1] 王珏，任鼎泰，宋宋，等.新生儿氨茶碱药动学研究[J].中国医院药学杂志，1995，15(12)∶534-536.
[2] Nielsen-kudsk F,Magnussen I,Jakobsen P.Pharmacokinetics of theophylline in ten elder patients[J].Acta Pharmacol Toxicol,1978,42∶226-231.
, http://www.100md.com
[3] Bukowsky JM.Theophylline reassessed[J].Ann Int Med,1984,101∶63-69.
[4] Desage M,Soubeyrand J,Soun A,et al.Automated theophylline assay using gas chromatography and a mass selective dector[J].J Chromatogr Biomed Appl,1984,336∶285-291.
[5] 高申，袁海龙.柱切换高效液相色谱法测定茶碱血药浓度[J].中国医院药学杂志，1993，13(12)∶536-538.
[6] Adnan EY,Sawch KJ.Analysis of theophylline in serum[J].J Pharm Sci,1981,70(4)∶453-459.
[7] Lawren A.Bioanalytic considerations for pharmacokinetic and biopharmaceutic studies[J].J Clin Pharmacol,1986,26∶332-335.
[8] 卓先义，吴侔天.常见药(毒)物临床治疗血液浓度，中毒例血液浓度，中毒死亡例血液浓度以及人体内半衰期(续三)[J].法医学杂志，1997，13(4)∶250-252.
收稿：2000-04-07
修回：2000-07-12, 百拇医药
单位：贠克明(山西医科大学，太原 030001)；王秀汝(首都医科大学宣武医院，北京 100053)；田树华(山西医科大学，太原 030001)；卫满升(山西省运城地区公安处技术科，运城 044300)
关键词：茶碱；薄层色谱扫描；血清
中国新药杂志000910 [摘要]目的：建立血清中茶碱的提取和薄层色谱扫描定性和定量检测方法。方法：血清用1%盐酸酸化，乙醚-二氯甲烷(6∶4)或氯仿萃取，点于GF254薄层板上，正庚烷∶三氯甲烷∶无水乙醇∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸(5∶2∶2∶1.5∶2.5∶0.5)展开；薄层扫描检测。结果：茶碱薄层层析Rf值为0.35；最大吸收波长为275nm；血中茶碱线性检测范围为1～24μg/ml，最小检出浓度为0.4μg/ml。结论：本法快速、简便、定性定量准确，可用于茶碱中毒的快速诊断和体内药物浓度监测。
, http://www.100md.com
[中图分类号]R927.11；R974.3 [文献标识码]B [文章编号]1003-3734(2000)09-0618-03
Determination of serum theophylline by TLC scanning
in cases of theophylline poison
YUN Ke-ming TIAN Shu-hua
(Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)
WANG Xiu-ru
(Xuanwu Hospital，Capital University of Medical Sciences,Beijing 100053，China)
, 百拇医药
WEI Man-sheng
(Technical Section,Local Public Department of Yuncheng City,Yuncheng 044300,China)
[Abstract]Objective:To establish a rapid method for determination of theophylline in serum.Methods:Serum sample is acidified with 1% HCl,then extracted with ether-dicholromethane(v/v=6/4) or chloroform.The extract is applied to a GF254 TLC plate and developed with a solvent mixture of n-heptane∶chloroform∶ethanol∶ethyl acetate∶methanol∶acetic acid(5∶2∶2∶1.5∶2.5∶0.5) and then determined by TLC scanning.Results:The Rf value for theophylline is 0.35 with a maximum absorption at 275 nm.The liner range of theophylline is 1～24μg/ml with a detection limit of 0.4μg/ml.Conclusion:A rapid,convinient,and accurate method for qualitative and quantitative determination of theophylline in serum is established.Theophylline poisoning and serum theophylline level can be determined by this method.
, 百拇医药
[Key words] theophylline;TLC scanning;serum
茶碱(theophylline,TP)是临床常用的抗哮喘药，临床常用其衍生物氨茶碱(aminophylline,AP)。TP在人体内代谢与年龄、肝肾功能和配伍用药等因素有关[1～3]，其治疗窗狭窄，有效血药浓度为10～20μg/ml，用药时间较长，易出现不良反应，必须进行血药浓度监测。偶见口服大量氨茶碱中毒者，需进行血中茶碱快速定性定量检测。TP的血药浓度检测方法有GC法、HPLC法、荧光分光光度法、UV法、EIA法、RIA法和FPIA法[1，2，4～6]，以UV法、HPLC法和FPIA法应用较多，但定性效果较差。血中TP的TLC法检测报道较少，但定性效果较好。本实验从临床茶碱中毒快速诊断需要出发，建立血清中茶碱的提取和薄层扫描定性定量检测方法，并应用于服药过量中毒的诊断和哮喘患者血药浓度监测。
材料和方法
, 百拇医药
1 试剂和药品
TP(纯度97%)对照品购自公安部第二研究所，其余试剂为分析纯。标准溶液：1mg/ml TP对照品甲醇乙醇溶液，4℃冰箱保存。
2 主要仪器及检测条件
CS-930薄层扫描仪。光谱扫描：Difference扫描方式；色谱扫描：双波长锯齿形扫描，λ1=275nm,λ2=310nm,sx=3,记录峰面积。
3 薄层层析条件
薄层板：HSGF25410cm×10cm×0.25mm;展开剂：正庚烷∶三氯甲烷∶无水乙醇∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸(5∶2∶2∶1.5∶2.5∶0.5)，上行展开5～7cm。
, http://www.100md.com 4 薄层扫描响应曲线和扫描精密度
标准溶液(0.2，0.4，1，2，4，8，12，16，20μl)点板，展开，扫描。建立的TP薄层扫描响应曲线回归方程为Y=831+13684X，式中Y为斑点扫描面积积分值，X为斑点内TP含量(μg/斑点)，r=0.9998,P<0.01，线性响应范围为0.4～12μg/斑点，最小检出量为0.2μg/斑点。TP的板内扫描精密度为2.1%(5μg/斑点)，2.5%(10μg/斑点)和2.0%(15μg/斑点)；板间扫描精密度为3.2%(5μg/斑点)，3.7%(10μg/斑点)和4.1%(15μg/斑点)；日内扫描精密度为3.4%(5μg/斑点)，4.1%(10μg/斑点)和3.9%(15μg/斑点)。
5 提取与检测
血清1ml,加1%盐酸1ml,5ml乙醚-二氯甲烷(v/v,6∶4)或氯仿萃取1次。同时取空白血清2分，分别加入标准溶液10μl和20μl，与检材平行萃取。萃取液40～50℃或70℃水浴氮气流挥干，20μl乙醇定容，10μl点样，按前述方法展开。紫外灯下确定斑点位置，光谱扫描结合Rf值定性，薄层扫描外标两点法或工作曲线法定量。
, http://www.100md.com
6 工作曲线和提取回收率
空白血清10分，分别加入标准溶液0.2，0.4，1，2，4，8，12，18，24，32μl，按前述方法氯仿提取、展开和扫描，建立的血清TP的检测工作曲线方程为：Y=-4.378×10-2+1.823×10-4X(r=0.9992)。式中Y为血清中TP含量(μg/ml)，X为斑点扫描面积积分值。线性检测范围为1～24μg/ml，最小检出浓度为0.4μg/ml。空白血清中添加TP，日内提取回收率为(103.4±3.6)%(5μg/ml)，(100.2±2.8)%(10μg/ml)和(96.45±4.6)% (20μg/ml)；日间提取回收率为(99.6±3.9)%(5μg/ml)，(101.2±4.8)%(10μg/ml)和(96.45±4.8)%(20μg/ml)。
7 病例检测
中毒患者取血5ml立即送检(也可取第1遍洗胃液一同送检)。哮喘患者常规使用AP，4～5d后，清晨用药前和用药后(口服为1.5h;静注为0.5h)各采血3～4ml送检。
, 百拇医药
结 果
1 薄层色谱
TP薄层层析Rf值为0.35，光谱扫描图见图1，色谱扫描显示TP斑点扫描峰形对称，TP与血液提取物中杂质分离完全。碘化铋钾显色，TP斑点呈棕色，灵敏度为0.1μg/斑点。
图1 TP光谱扫描图
表1 哮喘患者血清TP浓度(μg/ml) 病例号
给药
方式
血清TP浓度
病例号
, http://www.100md.com
给药
方式
血清TP浓度
药后24h
药后1.5h
药后24h
药后0.5h
1
po
7.6
16.3
13
iv
, http://www.100md.com
4.6
9.3
2
po
4.6
15.2
14
iv
6.8
13.4
3
po
8.9
, 百拇医药 19.4
15
iv
9.4
23.4
4
po
10.3
20.4
16
iv
8.5
19.4
, 百拇医药 5
po
13.1
19.5
17
iv
13.1
24.2
6
po
5.9
13.2
18
iv
, 百拇医药
10.3
18.4
7
po
9.4
14.7
19
iv
5.7
12.4
8
po
7.6
, http://www.100md.com 15.8
20
iv
12.4
19.8
9
po
11.4
22.9
21
iv
9.4
18.2
, 百拇医药 10
po
4.2
11.2
22
iv
8.8
17.4
11
po
6.8
16.4
23
iv
, 百拇医药
6.4
14.2
12
po
10.4
18.1
24
iv
10.5
24.8
8.4
16.9
, 百拇医药
8.8
17.9
s
2.7
3.3
s
2.6
4.9
讨 论 TP的薄层层析色谱行为、斑点扫描精密度和薄层扫描线性响应范围、血清中TP提取回收率和精密度、检测线性范围、最小检出浓度均达到生物检材内药物检测和体内血药浓度监测的要求[2～8]，可用于TP的中毒快速诊断和血药浓度监测。本实验曾用外标两点法检测斑点内TP绝对含量，考查TP的绝对回收率。氯仿与乙醚-二氯甲烷溶剂均为较好提取溶剂，而后者操作方便，毒性相对较小。
, 百拇医药
中毒和哮喘患者检测结果均与临床表现一致，调整剂量后，哮喘患者哮喘和中毒症状改善。本实验建立的TP的提取和薄层扫描检测方法与文献[4～6]相比，具有操作简便快速、定性定量准确的特点，适合于TP中毒快速诊断和血药浓度监测。碘化铋钾显色后，Rf值结合斑点颜色也可定性，并可进行目测半定量，便于基层医院开展。
作者简介：贠克明(1964-)，男，山西医科大学法医学系副教授，硕士，在读博士，主要从事体内药(毒)物分析和肝脏病理生理学研究。联系电话：(0351)4135142。
参考文献
[1] 王珏，任鼎泰，宋宋，等.新生儿氨茶碱药动学研究[J].中国医院药学杂志，1995，15(12)∶534-536.
[2] Nielsen-kudsk F,Magnussen I,Jakobsen P.Pharmacokinetics of theophylline in ten elder patients[J].Acta Pharmacol Toxicol,1978,42∶226-231.
, http://www.100md.com
[3] Bukowsky JM.Theophylline reassessed[J].Ann Int Med,1984,101∶63-69.
[4] Desage M,Soubeyrand J,Soun A,et al.Automated theophylline assay using gas chromatography and a mass selective dector[J].J Chromatogr Biomed Appl,1984,336∶285-291.
[5] 高申，袁海龙.柱切换高效液相色谱法测定茶碱血药浓度[J].中国医院药学杂志，1993，13(12)∶536-538.
[6] Adnan EY,Sawch KJ.Analysis of theophylline in serum[J].J Pharm Sci,1981,70(4)∶453-459.
[7] Lawren A.Bioanalytic considerations for pharmacokinetic and biopharmaceutic studies[J].J Clin Pharmacol,1986,26∶332-335.
[8] 卓先义，吴侔天.常见药(毒)物临床治疗血液浓度，中毒例血液浓度，中毒死亡例血液浓度以及人体内半衰期(续三)[J].法医学杂志，1997，13(4)∶250-252.
收稿：2000-04-07
修回：2000-07-12, 百拇医药