血液替代品制备新途径的研究
作者：王鹤尧 郑文婕
单位：王鹤尧(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院药剂科，北京 100020)；郑文婕(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院基础研究中心，北京 100020)
关键词：血液替代品；聚合；2-羟基丙醛；乙醇醛
中国新药杂志001008 [摘要] 目的：研究新的牛血红蛋白(Hb)的聚合剂，制备能 满足 血液替代品需要的聚合牛Hb(polyHb)。方法：用聚合反应动力学和 热力学原理寻找新的聚合剂，用电泳和HPLC等技术比较新聚合剂2-羟基丙醛与乙醇醛和戊 二醛的聚合反应和反应产物的特性， 用计算机技术比较和模拟2-羟基丙醛和乙醇醛聚合的 牛Hb的结构。结果：2-羟基丙醛聚合牛Hb的反应温和，反应产物的 分子结构稳定，以低聚态为主并有适合于向组织供氧的氧亲和力，其相对分子质量分布明显 优于乙醇醛的聚合产物，从而有可能从根本上克服产物相对分子质量过高及残留的未反应Hb 所致的血栓形成和血尿等不良反应。结论：2-羟基丙醛是适合于制 备血液替代品的新型Hb聚合剂。
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[中图分类号]R977.8 [文献标识码] B
[文章编号]1003-3734(2000)10-0687-05
Researches on new route of preparing blood substitute
WANG He-yao ZHENG Wen-jie
(Pharmaceutical Department,Beijing Red-Cross Chaoyang Hospital Affiliate d to
Capital University of Medical Science,Beijing 100020,China)
[Abstract] Objective:Search new polymerizing agent of bovine hemogl obin for the use of prepare suitable blood substitute.Methods:Find new polymerizing agent with the theories of kinetics and thermodynamics of polymeri zation reaction,compare the characteristics among polymerizing reactions and pro ducts of 2-hydroxyl propionaldehyde,glycolaldehyde and glutaraldehyde with elec trophoresis and HPLC.Use computer technology to compare and simulate the struct ures between 2-hydroxyl propionaldehyde and glycolaldehyde polymerized products .Results:The reaction of 2-hydroxyl propionaldehyde polymerizing bovi ne Hb was mild,its products were stable and mostly made of lowly polymerized pol yHbs,their oxygen affinity was suitable to supply oxygen to tissues.The distribu tion of the products’ molecular weight was much more better than glycolaldehyde polymerized products，and this supplied the possibility that the adverse effect s induced by ultra-polymerized and unreacted Hbs in the blood substitute made f rom glycolaldehyde polymerized bovine Hb could disappear when blood substitutes manufactured with 2-hydroxyl propionaldehyde were used.Conclusion:2- hydroxyl propionaldehyde is a new agent that is very suitable for the manufactur e of blood substitutes.
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[Key words] blood substitute;polymerization ;2-hydroxyl propionald ehyde;glycolaldehyde
多年以来，如何才能恰当地、更好地对血红蛋白(Hb)进行修饰一直是困扰血液替代品 研究者的一个问题，若聚合反应进行得不充分，就意味着原材料的浪费和成本过高；若聚合 程度过高，则 不仅引起Hb结构和功能改变，还可由于这些改变在体内引起复杂的病理生理过程[1] 。要将聚合控制在一定程度是非常困难的，因为聚合必然要用双功能或多功能交联剂，这 些交联剂的活性基团随机地与Hb表面的氨基发生亲核加成反应，使聚合持续进行。在目前已 知的交联剂中，最成功的是Baxter公司的双阿司匹林，它可以实现Hb分子内的定位交联。但 这种只有分子内交联的Hb分子虽然不再从肾滤出，但其血浆半衰期只为4h左右，不足以持续 地向机体供氧。增加Hb的相对分子质量可有效延长其循环半衰期，但聚合反应的难以控制使 人们在这一方向的研究进展缓慢。我们探索了一条全新的Hb聚合途径，基本实现了Hb聚合反 应的可控制，目前作者尚未见国外有同类报道。
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材料和方法
1 材料
试剂：戊二醛(Sigma)，乙醇醛(Sigma)，NaBH4(Acros)，Sephacryl S-300(Pham acia)，丙烯酰胺(Sigma)，N,N'-甲叉双丙烯酰胺(SERVA)，凝胶过滤高分子量校准试 剂盒(Phamacia)，蛋白质低分子量标准(Sigma)，2-羟基丙醛(Archros)，其余皆为 分析纯。
原料：用板框过滤法提取的牛Hb。
仪器： Insight II 蛋白质工作站(97.0版)(Silicon Graphics)，2XZ型旋片真空 泵(浙江临海精工真空设备厂)，235/200高压液相色谱议(PERKIN ELMER)，TSK-GEL G 4,000SW凝胶过滤柱(TOYO SODA)，2197电泳电源(LKB)，垂直板电泳仪(北京六一仪 器厂)，ABL520血气分析仪 (Radiometer)。
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2 方法
2.1 戊二醛聚合 脱氧12%Hb溶液100ml，用1mol/L Na2CO3调pH至8. 0，加入2%的戊二醛水溶液4ml，使戊二醛与Hb的分子数比为4:1，于30℃适当搅拌[2] 。
2.2 乙醇醛聚合 将1L 15%的牛Hb(溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口 圆底 烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入 N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2 4次后，用ABL520血气分析仪监测H b溶液中O2Hb的浓度降到2%以下。加入脱气的 30ml 1mol/L NaCO3将Hb溶液的pH值调至8 .5，再加入30ml脱气的10%乙醇醛贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加 入85.7ml的1.56%NaBH4(溶于10mmol/L NaOH)以终止聚合反应[3]。反应终止后 保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并调pH至7.4。用5 A血液透析器将聚合产物中大于1000×103的成分除去，用100×103膜堆去除聚合产 物中小于100×103的成分，同时用生理盐水进行平衡。
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2.3 2-羟基丙醛聚合 方法同乙醇醛的聚合，但需加入适 量的对甲苯磺酸作为催化剂。采用7∶1，25∶1和40∶1 3个剂量。
2.4 牛Hb聚合程度的检测
2.4.1 不连续密度梯度SDS-PAGE 取 7.5ml 0.38mol/L Tris-C l, p H8.8, 0.1%SDS溶液和7ml 30%丙烯酰胺-0.8%甲叉双丙烯酰胺(溶于前述溶液)用梯度发生 器于垂直板电泳槽中制备3%～30%的聚丙烯酰胺凝胶(分离胶)后，用3%丙烯酰胺-0.08%甲 叉双丙烯酰胺(溶于0.125mol/L Tris-Cl, pH6.8, 0.1%SDS溶液)制备浓缩胶。PolyH b样品用SDS上样缓冲液处理后，于100V电泳8h。电泳结束后用考马斯亮蓝染色。
2.4.2 HPLC检测 取少量聚合产物，用洗脱液稀释成 1mg/ml，于P ERKIN EL MER 235/200 HPLC仪(色谱柱为TSK-GEL G4,000SW)上检测聚合产物分子量分布 。用凝胶过滤高分子量校准试剂盒进行标定并绘制校准曲线。色谱条件：色谱柱 TSK- GEL G4,000SW；柱温 20℃；洗脱液 1/15mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液，含0. 1mol/L NaCl；流速 0.5ml/min；紫外检测波长 280nm；进样体积：10μl。
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2.5 计算机分析模拟Hb聚合产物 在蛋白质工作站上，采用 vuff.fvc力场，用分子力学方 法叠代1 000步，共计算20h，模拟了乙醇醛和2-羟基丙醛 于分子内交联和分子间聚合 产物体系的能量。
结果
1 聚合反应结果
戊二醛聚合反应速度极快，反应达5h整个体系形成凝胶，所有Hb聚合成一个大分子。乙醇醛 聚合反应的速度较慢，但反应超过10h则形成凝胶。2-羟基丙醛聚合反应在3个剂量水平上 都能有效聚合，反应达到100h都未见凝胶形成，经检测，其中的高聚物也不多。
2 Hb聚合程度的检测
2.1 蛋白质相对分子质量标准 HPLC所使用的TSK-GEL G4,000SW柱 的分离范围为10×103～1 000×103，蛋白质相对分子质量标准的HPLC洗脱曲线见图1， 由此绘制蛋白质相对分子质量校准曲线见图2。
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图1 TSK-GEL G4 000SW柱蛋白质相对分子质量标准洗脱时间
图2 蛋白质相对分子质量标准曲线
2.2 乙醇醛原始聚合产物及其超滤产物的洗脱曲线 乙醇醛 聚合产物中有超过1 000×103的大分子存在，它们被完全排阻，呈 9.12min处的洗脱 峰；此后小于1 000×103的组分连续被洗脱出来并且数量不断增多， 在18.5min处形成一 个“肩”，此处的相对分子质量约为192×103，即为α2β2的三聚体；随后在19.9mi n处形成最大的峰，此处的相对分子质量约为119×103，即为α2β2的二聚体；在2 2.7min处出现第3个峰，此处的相对分子质量约为61×103，应该是一个发生了分 子内交联的α 2β2；最后在25.2min处是一个“肩”，此处的相对分子质量约为32×103，应该是未 反应的αβ二聚体。总的来说，牛Hb被有效聚合，聚合产物中(αβ)4和(αβ)6最多，相对 分子质量连续递增，出现了一些超过1 000×103的聚合物，此外还有少量未反应的αβ 二聚体(图3a)。经积分处理，超过500×103的高聚物占总体的24%，解离的32×103的α β二聚体占4.4%，64×103～500×103的组分占71.63%。在经过1 000×103 的血液透 析器和100×103的膜堆超滤后，1 000×103以上的高聚Hb大部分被去除，有一些300×1 03～1 000×103的成分也被去除。但对100×103的膜堆对未聚合的αβ二聚体的去除 效果并不理想。超滤后，超过500×103的组分还占4.6%，32×103的占7.3%，64×1 03～500×103的组分占88%(图3b)。
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图3 乙醇醛聚合的polyHb的洗脱曲线
从图3a可看出，乙醇醛聚合的原产物可见较多的超过1 000×103的高聚Hb和未反应的αβ 二聚体；乙醇醛聚合产物经过1 000×103和100×103超滤后,仍有部分高聚Hb和αβ二 聚体存在。
2.3 2-羟基丙醛聚合产物 其HPLC及密度梯度电泳检测结 果见图4，5。HPLC显示聚合产物主要集中在119.9×103附近，提示主要产生了Hb的二 聚体。电泳结果显示，反应10h后，牛Hb被2-羟基丙醛有效聚合，聚合产物经SDS变性后的 相对分子质量以n×16×103(n≥1)的形式依次递增，从照片上可看见n最多为7，也就是 说，最多可见有7个亚基被交联成一个大分子，再加上通过疏水相互作用而结合的其他亚基 ，聚合产物的相对分子质量最多可达448×103，并未超过可引起不良反应的500×103的 极限。而乙醇醛聚合5h的产物中，高相对分子质量的显著增多，其相对分子质量持续向上延伸。
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图4 2-羟基丙醛聚合的polyHb的HPLC洗脱图谱
图5 电泳检测2-羟基丙醛聚合产物的聚合程度
3 聚合产物的氧亲和力比较
2-羟基丙醛聚合产物的P50为29mmHg，比乙醇醛聚合产物的P50(30.31mmHg)和天然牛Hb 的P50(30.60mmHg)稍低，与人RBC的P50(26～28mmHg)接近，有良好的携氧供氧能力。
4 计算机分析演算的结果
4.1 在比较乙醇醛和2-羟基丙醛分子内交联的Hb结构稳定性时 ，我们将整个交联后的Hb分子作为一个体系进行计算，在此体系中有如下基本结构：分子内 交联后的1个Hb分子含1个交联剂、572个氨基酸残基、25种共8 786个原子、8 891个化学键 、16 006个键角、23 477个二面角和1 745个out-of-planes。计算机随机在Hb分子内 产生一个交联，交联部位是β104(Lys)-β104(Lys)，最终计算结果见表1。
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表1 乙醇醛和2-羟基丙醛交联结构的稳定性比较(kJ) 成 分
分子内能量
分子间能量
乙醇醛
2-羟基丙醛
乙醇醛
2-羟基丙醛
总势能
18.94
18.87
38.42
38. 31
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内 能
22.87
19.12
45.75
45.76
键 合
6.80
6.80
13.64
13.63
键 角
13.47
13.47
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27.01
26.99
扭 矩
2.49
2.49
4.88
4.91
平面外结构
0.11
0.11
0.22
0.22
非键合
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-3.93
-4.01
-7.33
-7.45
范德华力
3.60
3.61
4.54
7.49
范德华斥力
85.44
85.49
170.09
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170.14
范德华色散力
-81.83
-81.88
-162.54
-162.65
静电能
-7.54
-7.62
-14.88
-14.93
4.2 在比较乙醇醛和2-羟基丙醛分子间交联的Hb结构 稳定性时，我们将交联后的2个Hb分子和一个交联剂分子作为一个体系进行计算，在此体系 中有如下基本结构：1个交联剂、1 144个氨基酸残基、25种共17 568个原子、17 777个化学 键、32 000个键角、46 933个二面角和3 489个平面外结构。计算机随机在两个Hb分子间产 生一个连接，部位是Hb1β19(Lys)-Hb2β65(Lys)。见表1。
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从计算结果可看出，无论是在分子内还是分子间，2-羟基丙醛交联结构的能量都比 乙醇醛交联的稍低，因此其结构要稍稳定一些。见图6，7。
图6 2-羟基丙醛分子内交联示意图(箭头所指为交联部位)
图7 2-羟基丙醛分子间交联示意图(箭头所指为交联部位)
讨 论
如何使聚合反应被控制在一定程度是polyHb类血液替代品研究的关键技术问题。多年来， 人们一直在努力寻找一种特异交联剂，使其既能有效产生Hb分子内交联(稳定α2β2四 聚体)又能产生分子间聚合(延长血浆半衰期)[3,4]，同时聚合程度又不能过大 (出现不良反应)，还能将Hb与氧的亲和力控制在较低水平。
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文献中报道多种交联剂，如戊二醛等，虽然它们均能使Hb分子内交联，但亦能产生大量分子 间交联产物，使分子间最后形成凝胶。而新近报道的乙醇醛，当控制其浓度和反应时间时， 可以得到部分所需相对分子质量的产物[6～7]。与戊二醛相比，交联反应要理想得 多。这提示较短的键可能有利于分子内交联。但由于乙醇醛生成亚胺后，经过重排，α-羟 基又变为醛羰基，使其不仅可在分子内发生交联，而且也发生分子间交联。反应时间较短、 浓度较低时，该反应为速度控制产物(动力学控制产物)。但随反应时间延长，则主要生成 热力学控制产物，因而出现凝胶现象。
2-羟基丙醛的醛羰基与蛋白交联后生成亚胺，经过重排，β-羟基转变为酮羰基，其亲电 性弱于醛基，又由于羰基旁的烷基的空间位阻的存在，使其反应活性比醛羰基低得多。对2 -羟基丙醛衍生的酮基而言，由于有疏水的烷基存在，烷基向Hb分子的疏水内部靠拢，将酮 基向内牵拉，使酮基的暴露程度减小。因为Hb是一个大分子，在与酮羰基发生亲核加成反应 时位阻的影响是非常显著的。因此2-羟基丙醛的交联反应性不会太强烈。
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由于交联剂的反应产物主要是聚合程度较低的polyHb分子，因此我们推测酮羰基与分子内氨 基反应的能垒可能比分子间氨基要低，因而最终主要生成分子内产物而分子间产物少，即使 反应很长时间也不发生凝胶现象。
在动物实验中，用乙醇醛聚合的polyHb引起了血栓和Hb尿，这是由于大于500×103的高聚 态polyHb堵塞了小动脉并促进TXA2的释放，引起血栓；另一方面，未聚合的天然Hb从肾脏 滤出，引起Hb尿和Hb管型出现[8,9]。而2-羟基丙醛的反应产物主要是小于500× 1 03的低聚态的polyHb分子，并且反应可充分进行，因此在动物实验时所观察到的副作用可 望从根本上被克服。2-羟基丙醛的发现，为血液替代品的研究开辟了一个新天地。
计算机模拟的交联产物结构的稳定性，仅代表了终产物的结构稳定性，与交联反应的过程无 关。
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从对上述几种交联剂反应结果的研究，我们基本可以得出以下结论：一个好的Hb交联剂总是 有较短的键，最好是相邻两个羰基(或能衍生出两个羰基)，同时具有一定活性和一定空间 阻碍作用，使分子间反应难以发生，但空间阻碍不宜过大，否则分子内反应亦难发生。
[作者简介] 王鹤尧(1968-)，男，医学博士。主要研究方向：药 物分析、药理、生物制剂。联系电话：65007755-2040，13701299757(手机)。
[参考文献]
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[2] MacDonald SL，Pepper DS.Hemoglobin polymerization[J].Method Enzymol，1994，231∶287-308.
, 百拇医药
[3] Gould SA, Sehgal AL，Rosen HL,et al.The efficacy of polymeriz ed pyrid oxylated hemoglobin solution as an O2 carrier[J].Ann Surg，1990，211(4 )∶394-398.
[4] DeVenuto F，Zegna A. Preparation and evaluation of pyridoxalated -polymerized human hemoglobin[J].J Surg Res，1983，34(3)∶205-212.
[5] Marini MA, Moore GL，Christensen SM, et al. Reexamination of the poly merization of pyridoxylated hemoglobin with glutaraldehyde[J].Biopolymers ，1990，29∶871-82.
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[6] Acharya AS，Manning JM. Reaction of glycolaldehyde with proteins : latent crosslinking potential of alpha-hydroxyaldehydes[J].Proc Natl Acad Sci U SA，1983，80∶3590-3594.
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[8] 王鹤尧,卜凤荣,朱晓霞.血液替代品聚合牛血红蛋白的复苏功效的初步研究 [J].解放军医学杂志，2000，25(1)∶59-62.
[9] 王鹤尧,卜凤荣,朱晓霞，等. 血液替代品抗失血性休克的初步研究. 中 华创伤外科杂志(正在印刷中).
收稿：2000-05-10
修回：2000-07-27, http://www.100md.com
单位：王鹤尧(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院药剂科，北京 100020)；郑文婕(首都医科大学附属北京红十字朝阳医院基础研究中心，北京 100020)
关键词：血液替代品；聚合；2-羟基丙醛；乙醇醛
中国新药杂志001008 [摘要] 目的：研究新的牛血红蛋白(Hb)的聚合剂，制备能 满足 血液替代品需要的聚合牛Hb(polyHb)。方法：用聚合反应动力学和 热力学原理寻找新的聚合剂，用电泳和HPLC等技术比较新聚合剂2-羟基丙醛与乙醇醛和戊 二醛的聚合反应和反应产物的特性， 用计算机技术比较和模拟2-羟基丙醛和乙醇醛聚合的 牛Hb的结构。结果：2-羟基丙醛聚合牛Hb的反应温和，反应产物的 分子结构稳定，以低聚态为主并有适合于向组织供氧的氧亲和力，其相对分子质量分布明显 优于乙醇醛的聚合产物，从而有可能从根本上克服产物相对分子质量过高及残留的未反应Hb 所致的血栓形成和血尿等不良反应。结论：2-羟基丙醛是适合于制 备血液替代品的新型Hb聚合剂。
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[中图分类号]R977.8 [文献标识码] B
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Researches on new route of preparing blood substitute
WANG He-yao ZHENG Wen-jie
(Pharmaceutical Department,Beijing Red-Cross Chaoyang Hospital Affiliate d to
Capital University of Medical Science,Beijing 100020,China)
[Abstract] Objective:Search new polymerizing agent of bovine hemogl obin for the use of prepare suitable blood substitute.Methods:Find new polymerizing agent with the theories of kinetics and thermodynamics of polymeri zation reaction,compare the characteristics among polymerizing reactions and pro ducts of 2-hydroxyl propionaldehyde,glycolaldehyde and glutaraldehyde with elec trophoresis and HPLC.Use computer technology to compare and simulate the struct ures between 2-hydroxyl propionaldehyde and glycolaldehyde polymerized products .Results:The reaction of 2-hydroxyl propionaldehyde polymerizing bovi ne Hb was mild,its products were stable and mostly made of lowly polymerized pol yHbs,their oxygen affinity was suitable to supply oxygen to tissues.The distribu tion of the products’ molecular weight was much more better than glycolaldehyde polymerized products，and this supplied the possibility that the adverse effect s induced by ultra-polymerized and unreacted Hbs in the blood substitute made f rom glycolaldehyde polymerized bovine Hb could disappear when blood substitutes manufactured with 2-hydroxyl propionaldehyde were used.Conclusion:2- hydroxyl propionaldehyde is a new agent that is very suitable for the manufactur e of blood substitutes.
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[Key words] blood substitute;polymerization ;2-hydroxyl propionald ehyde;glycolaldehyde
多年以来，如何才能恰当地、更好地对血红蛋白(Hb)进行修饰一直是困扰血液替代品 研究者的一个问题，若聚合反应进行得不充分，就意味着原材料的浪费和成本过高；若聚合 程度过高，则 不仅引起Hb结构和功能改变，还可由于这些改变在体内引起复杂的病理生理过程[1] 。要将聚合控制在一定程度是非常困难的，因为聚合必然要用双功能或多功能交联剂，这 些交联剂的活性基团随机地与Hb表面的氨基发生亲核加成反应，使聚合持续进行。在目前已 知的交联剂中，最成功的是Baxter公司的双阿司匹林，它可以实现Hb分子内的定位交联。但 这种只有分子内交联的Hb分子虽然不再从肾滤出，但其血浆半衰期只为4h左右，不足以持续 地向机体供氧。增加Hb的相对分子质量可有效延长其循环半衰期，但聚合反应的难以控制使 人们在这一方向的研究进展缓慢。我们探索了一条全新的Hb聚合途径，基本实现了Hb聚合反 应的可控制，目前作者尚未见国外有同类报道。
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材料和方法
1 材料
试剂：戊二醛(Sigma)，乙醇醛(Sigma)，NaBH4(Acros)，Sephacryl S-300(Pham acia)，丙烯酰胺(Sigma)，N,N'-甲叉双丙烯酰胺(SERVA)，凝胶过滤高分子量校准试 剂盒(Phamacia)，蛋白质低分子量标准(Sigma)，2-羟基丙醛(Archros)，其余皆为 分析纯。
原料：用板框过滤法提取的牛Hb。
仪器： Insight II 蛋白质工作站(97.0版)(Silicon Graphics)，2XZ型旋片真空 泵(浙江临海精工真空设备厂)，235/200高压液相色谱议(PERKIN ELMER)，TSK-GEL G 4,000SW凝胶过滤柱(TOYO SODA)，2197电泳电源(LKB)，垂直板电泳仪(北京六一仪 器厂)，ABL520血气分析仪 (Radiometer)。
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2 方法
2.1 戊二醛聚合 脱氧12%Hb溶液100ml，用1mol/L Na2CO3调pH至8. 0，加入2%的戊二醛水溶液4ml，使戊二醛与Hb的分子数比为4:1，于30℃适当搅拌[2] 。
2.2 乙醇醛聚合 将1L 15%的牛Hb(溶于生理盐水，pH6.4)放入3L二口 圆底 烧瓶中，烧瓶的二口分别与真空泵和N2钢瓶相联，将烧瓶内抽真空至-0.075MPa后，通入 N2至与大气等压，轻摇烧瓶10min。重复抽气和通N2 4次后，用ABL520血气分析仪监测H b溶液中O2Hb的浓度降到2%以下。加入脱气的 30ml 1mol/L NaCO3将Hb溶液的pH值调至8 .5，再加入30ml脱气的10%乙醇醛贮存液，升温至30℃并用磁力搅拌器搅拌90min后，缓慢加 入85.7ml的1.56%NaBH4(溶于10mmol/L NaOH)以终止聚合反应[3]。反应终止后 保持脱氧状态于60℃水浴10h，然后于4℃将反应混合物对生理盐水透析，并调pH至7.4。用5 A血液透析器将聚合产物中大于1000×103的成分除去，用100×103膜堆去除聚合产 物中小于100×103的成分，同时用生理盐水进行平衡。
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2.3 2-羟基丙醛聚合 方法同乙醇醛的聚合，但需加入适 量的对甲苯磺酸作为催化剂。采用7∶1，25∶1和40∶1 3个剂量。
2.4 牛Hb聚合程度的检测
2.4.1 不连续密度梯度SDS-PAGE 取 7.5ml 0.38mol/L Tris-C l, p H8.8, 0.1%SDS溶液和7ml 30%丙烯酰胺-0.8%甲叉双丙烯酰胺(溶于前述溶液)用梯度发生 器于垂直板电泳槽中制备3%～30%的聚丙烯酰胺凝胶(分离胶)后，用3%丙烯酰胺-0.08%甲 叉双丙烯酰胺(溶于0.125mol/L Tris-Cl, pH6.8, 0.1%SDS溶液)制备浓缩胶。PolyH b样品用SDS上样缓冲液处理后，于100V电泳8h。电泳结束后用考马斯亮蓝染色。
2.4.2 HPLC检测 取少量聚合产物，用洗脱液稀释成 1mg/ml，于P ERKIN EL MER 235/200 HPLC仪(色谱柱为TSK-GEL G4,000SW)上检测聚合产物分子量分布 。用凝胶过滤高分子量校准试剂盒进行标定并绘制校准曲线。色谱条件：色谱柱 TSK- GEL G4,000SW；柱温 20℃；洗脱液 1/15mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液，含0. 1mol/L NaCl；流速 0.5ml/min；紫外检测波长 280nm；进样体积：10μl。
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2.5 计算机分析模拟Hb聚合产物 在蛋白质工作站上，采用 vuff.fvc力场，用分子力学方 法叠代1 000步，共计算20h，模拟了乙醇醛和2-羟基丙醛 于分子内交联和分子间聚合 产物体系的能量。
结果
1 聚合反应结果
戊二醛聚合反应速度极快，反应达5h整个体系形成凝胶，所有Hb聚合成一个大分子。乙醇醛 聚合反应的速度较慢，但反应超过10h则形成凝胶。2-羟基丙醛聚合反应在3个剂量水平上 都能有效聚合，反应达到100h都未见凝胶形成，经检测，其中的高聚物也不多。
2 Hb聚合程度的检测
2.1 蛋白质相对分子质量标准 HPLC所使用的TSK-GEL G4,000SW柱 的分离范围为10×103～1 000×103，蛋白质相对分子质量标准的HPLC洗脱曲线见图1， 由此绘制蛋白质相对分子质量校准曲线见图2。
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图1 TSK-GEL G4 000SW柱蛋白质相对分子质量标准洗脱时间
图2 蛋白质相对分子质量标准曲线
2.2 乙醇醛原始聚合产物及其超滤产物的洗脱曲线 乙醇醛 聚合产物中有超过1 000×103的大分子存在，它们被完全排阻，呈 9.12min处的洗脱 峰；此后小于1 000×103的组分连续被洗脱出来并且数量不断增多， 在18.5min处形成一 个“肩”，此处的相对分子质量约为192×103，即为α2β2的三聚体；随后在19.9mi n处形成最大的峰，此处的相对分子质量约为119×103，即为α2β2的二聚体；在2 2.7min处出现第3个峰，此处的相对分子质量约为61×103，应该是一个发生了分 子内交联的α 2β2；最后在25.2min处是一个“肩”，此处的相对分子质量约为32×103，应该是未 反应的αβ二聚体。总的来说，牛Hb被有效聚合，聚合产物中(αβ)4和(αβ)6最多，相对 分子质量连续递增，出现了一些超过1 000×103的聚合物，此外还有少量未反应的αβ 二聚体(图3a)。经积分处理，超过500×103的高聚物占总体的24%，解离的32×103的α β二聚体占4.4%，64×103～500×103的组分占71.63%。在经过1 000×103 的血液透 析器和100×103的膜堆超滤后，1 000×103以上的高聚Hb大部分被去除，有一些300×1 03～1 000×103的成分也被去除。但对100×103的膜堆对未聚合的αβ二聚体的去除 效果并不理想。超滤后，超过500×103的组分还占4.6%，32×103的占7.3%，64×1 03～500×103的组分占88%(图3b)。
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图3 乙醇醛聚合的polyHb的洗脱曲线
从图3a可看出，乙醇醛聚合的原产物可见较多的超过1 000×103的高聚Hb和未反应的αβ 二聚体；乙醇醛聚合产物经过1 000×103和100×103超滤后,仍有部分高聚Hb和αβ二 聚体存在。
2.3 2-羟基丙醛聚合产物 其HPLC及密度梯度电泳检测结 果见图4，5。HPLC显示聚合产物主要集中在119.9×103附近，提示主要产生了Hb的二 聚体。电泳结果显示，反应10h后，牛Hb被2-羟基丙醛有效聚合，聚合产物经SDS变性后的 相对分子质量以n×16×103(n≥1)的形式依次递增，从照片上可看见n最多为7，也就是 说，最多可见有7个亚基被交联成一个大分子，再加上通过疏水相互作用而结合的其他亚基 ，聚合产物的相对分子质量最多可达448×103，并未超过可引起不良反应的500×103的 极限。而乙醇醛聚合5h的产物中，高相对分子质量的显著增多，其相对分子质量持续向上延伸。
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图4 2-羟基丙醛聚合的polyHb的HPLC洗脱图谱
图5 电泳检测2-羟基丙醛聚合产物的聚合程度
3 聚合产物的氧亲和力比较
2-羟基丙醛聚合产物的P50为29mmHg，比乙醇醛聚合产物的P50(30.31mmHg)和天然牛Hb 的P50(30.60mmHg)稍低，与人RBC的P50(26～28mmHg)接近，有良好的携氧供氧能力。
4 计算机分析演算的结果
4.1 在比较乙醇醛和2-羟基丙醛分子内交联的Hb结构稳定性时 ，我们将整个交联后的Hb分子作为一个体系进行计算，在此体系中有如下基本结构：分子内 交联后的1个Hb分子含1个交联剂、572个氨基酸残基、25种共8 786个原子、8 891个化学键 、16 006个键角、23 477个二面角和1 745个out-of-planes。计算机随机在Hb分子内 产生一个交联，交联部位是β104(Lys)-β104(Lys)，最终计算结果见表1。
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表1 乙醇醛和2-羟基丙醛交联结构的稳定性比较(kJ) 成 分
分子内能量
分子间能量
乙醇醛
2-羟基丙醛
乙醇醛
2-羟基丙醛
总势能
18.94
18.87
38.42
38. 31
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内 能
22.87
19.12
45.75
45.76
键 合
6.80
6.80
13.64
13.63
键 角
13.47
13.47
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27.01
26.99
扭 矩
2.49
2.49
4.88
4.91
平面外结构
0.11
0.11
0.22
0.22
非键合
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-3.93
-4.01
-7.33
-7.45
范德华力
3.60
3.61
4.54
7.49
范德华斥力
85.44
85.49
170.09
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170.14
范德华色散力
-81.83
-81.88
-162.54
-162.65
静电能
-7.54
-7.62
-14.88
-14.93
4.2 在比较乙醇醛和2-羟基丙醛分子间交联的Hb结构 稳定性时，我们将交联后的2个Hb分子和一个交联剂分子作为一个体系进行计算，在此体系 中有如下基本结构：1个交联剂、1 144个氨基酸残基、25种共17 568个原子、17 777个化学 键、32 000个键角、46 933个二面角和3 489个平面外结构。计算机随机在两个Hb分子间产 生一个连接，部位是Hb1β19(Lys)-Hb2β65(Lys)。见表1。
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从计算结果可看出，无论是在分子内还是分子间，2-羟基丙醛交联结构的能量都比 乙醇醛交联的稍低，因此其结构要稍稳定一些。见图6，7。
图6 2-羟基丙醛分子内交联示意图(箭头所指为交联部位)
图7 2-羟基丙醛分子间交联示意图(箭头所指为交联部位)
讨 论
如何使聚合反应被控制在一定程度是polyHb类血液替代品研究的关键技术问题。多年来， 人们一直在努力寻找一种特异交联剂，使其既能有效产生Hb分子内交联(稳定α2β2四 聚体)又能产生分子间聚合(延长血浆半衰期)[3,4]，同时聚合程度又不能过大 (出现不良反应)，还能将Hb与氧的亲和力控制在较低水平。
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文献中报道多种交联剂，如戊二醛等，虽然它们均能使Hb分子内交联，但亦能产生大量分子 间交联产物，使分子间最后形成凝胶。而新近报道的乙醇醛，当控制其浓度和反应时间时， 可以得到部分所需相对分子质量的产物[6～7]。与戊二醛相比，交联反应要理想得 多。这提示较短的键可能有利于分子内交联。但由于乙醇醛生成亚胺后，经过重排，α-羟 基又变为醛羰基，使其不仅可在分子内发生交联，而且也发生分子间交联。反应时间较短、 浓度较低时，该反应为速度控制产物(动力学控制产物)。但随反应时间延长，则主要生成 热力学控制产物，因而出现凝胶现象。
2-羟基丙醛的醛羰基与蛋白交联后生成亚胺，经过重排，β-羟基转变为酮羰基，其亲电 性弱于醛基，又由于羰基旁的烷基的空间位阻的存在，使其反应活性比醛羰基低得多。对2 -羟基丙醛衍生的酮基而言，由于有疏水的烷基存在，烷基向Hb分子的疏水内部靠拢，将酮 基向内牵拉，使酮基的暴露程度减小。因为Hb是一个大分子，在与酮羰基发生亲核加成反应 时位阻的影响是非常显著的。因此2-羟基丙醛的交联反应性不会太强烈。
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由于交联剂的反应产物主要是聚合程度较低的polyHb分子，因此我们推测酮羰基与分子内氨 基反应的能垒可能比分子间氨基要低，因而最终主要生成分子内产物而分子间产物少，即使 反应很长时间也不发生凝胶现象。
在动物实验中，用乙醇醛聚合的polyHb引起了血栓和Hb尿，这是由于大于500×103的高聚 态polyHb堵塞了小动脉并促进TXA2的释放，引起血栓；另一方面，未聚合的天然Hb从肾脏 滤出，引起Hb尿和Hb管型出现[8,9]。而2-羟基丙醛的反应产物主要是小于500× 1 03的低聚态的polyHb分子，并且反应可充分进行，因此在动物实验时所观察到的副作用可 望从根本上被克服。2-羟基丙醛的发现，为血液替代品的研究开辟了一个新天地。
计算机模拟的交联产物结构的稳定性，仅代表了终产物的结构稳定性，与交联反应的过程无 关。
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从对上述几种交联剂反应结果的研究，我们基本可以得出以下结论：一个好的Hb交联剂总是 有较短的键，最好是相邻两个羰基(或能衍生出两个羰基)，同时具有一定活性和一定空间 阻碍作用，使分子间反应难以发生，但空间阻碍不宜过大，否则分子内反应亦难发生。
[作者简介] 王鹤尧(1968-)，男，医学博士。主要研究方向：药 物分析、药理、生物制剂。联系电话：65007755-2040，13701299757(手机)。
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[3] Gould SA, Sehgal AL，Rosen HL,et al.The efficacy of polymeriz ed pyrid oxylated hemoglobin solution as an O2 carrier[J].Ann Surg，1990，211(4 )∶394-398.
[4] DeVenuto F，Zegna A. Preparation and evaluation of pyridoxalated -polymerized human hemoglobin[J].J Surg Res，1983，34(3)∶205-212.
[5] Marini MA, Moore GL，Christensen SM, et al. Reexamination of the poly merization of pyridoxylated hemoglobin with glutaraldehyde[J].Biopolymers ，1990，29∶871-82.
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[8] 王鹤尧,卜凤荣,朱晓霞.血液替代品聚合牛血红蛋白的复苏功效的初步研究 [J].解放军医学杂志，2000，25(1)∶59-62.
[9] 王鹤尧,卜凤荣,朱晓霞，等. 血液替代品抗失血性休克的初步研究. 中 华创伤外科杂志(正在印刷中).
收稿：2000-05-10
修回：2000-07-27, http://www.100md.com