抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及鉴定
作者：许崇波 朱平 马从林 石瑾琪 冯书章
单位：许崇波 朱平 马从林 冯书章(解放军农牧大学军事兽医研究所，长春130062)；石瑾琪(山西省大同市第二卫生防疫站)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990122
α毒素是A型产气荚膜梭菌所致严重创伤性气性坏疽的主要致死因素，至今尚无有效的防治方法，使用抗生素和多价抗毒素效果不明显〔1〕。为此，我们采用细胞融合技术，制备了抗α毒素的单克隆抗体(mAb)，为治疗气性坏疽患者的α毒素中毒提供可能性。
1 材料和方法
1.1 抗原和细胞 α毒素抗原系重组菌株BL21(DE3)(pXETA1)的表达产物，按照表达系统pET-28b(+)的操作手册进行提取。Sp2/0骨髓瘤细胞，由本室保存。
, 百拇医药
1.2 实验动物 6周～8周龄Balb/c小鼠，由卫生部长春生物制品研究所提供。
1.3 抗α毒素mAb的制备 动物免疫、细胞融合筛选、克隆化及腹水制备，均为常规方法〔2〕。
1.4 mAb的特性鉴定
1.4.1 抗体效价测定采用间接ELISA测定。
1.4.2 mAb的Ig亚类鉴定用Gibco BRL公司的Mouse Monoclonal Antibody IsotypingKit(Dipstick Format)进行鉴定。
1.4.3 mAb的中和活性测定将腹水与等量的α毒素混合，于37℃作用1h后，分别接种于卵黄琼脂平板和血液琼脂平板上，观察有无分解卵磷脂和溶血环的现象。
, 百拇医药
1.4.4 mAb的保护试验取8周龄Balb/c小鼠，随机分为4组，每组5只，分别腹腔注入1个LD100的α毒素。然后在0h，4h和8h经腹腔注入抗α毒素的mAb1A8，1C3或1F1，同时设生理盐水对照组，连续1周观察各组小鼠的死亡情况。
2 结果
2.1 抗α毒素mAb的制备 免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞的融合率为63.19%,抗体阳性率为30.63%。经克隆化后，共获得3株阳性克隆细胞株，分别命名为1A8，1C3和1F1。
2.2 mAb的鉴定
2.2.1 mAb的效价测定3株杂交瘤细胞的培养上清和腹水，用间接ELISA检测，效价分别为1：512～1024及1×106～1×108。
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2.2.2 mAb的Ig亚类鉴定1A8和1C3为IgG3，1F1为IgM，3株的轻链均为κ型。
2.2.3 mAb中和活性的测定结果见表1。
表1 mAb的中和活性测定 细胞株
中和磷脂酶C活性
中和溶血活性
1A8
+
+
1C3
+
-
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1F1
-
-
2.2.4 mAb的保护效果结果见表2。表2 mAb1A8对致死性α毒素腹腔攻击小鼠的保护效果 组别
mAb腹水注入时间
0h
4h
8h
实验组
5/5*
5/5
4/5
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对照组
0/5
/
/
*分母实验动物数，分子为存活数
3 讨论
α毒素是A型产气荚膜梭菌最主要的毒力因子，能引起人类创伤的气性坏疽。为探索有效的治疗方法，我们在克隆成功α毒素保护性抗原基因的基础上〔3〕，研制出抗α毒素的mAb。用从重组菌株中提取的α毒素包涵体免疫Balb/c小鼠，经融合、筛选、克隆化和ELISA检测，建立了3株能稳定分泌抗α毒素mAb的杂交瘤细胞。3株杂交瘤细胞的培养上清及腹水mAb效价分别高达1∶1024和1×108。更为重要的是，mAb1A8同时具有中和α毒素磷脂酶C活性和溶血活性，且有抵抗致死性α毒素腹腔攻击小鼠的保护作用。本研究不仅为下一步研制α毒素的单链抗体奠定了基础，而且可为临床上试用于治疗α毒素中毒提供新的途径。
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作者简介：许崇波，男，30岁，助理研究员，博士
长春市西安大路175号，Tel.(0431)797101666685
参考文献
[1]Rood HI, Cole ST. Molecular genetics and pathogenesis of Clostridium perfringens. Microbiol Rev, 1991; 55(4):621～ 648
[2]朱平，冯书章.抗体实验技术.长春：长春出版社，1994：67～151
[3]许崇波，朱平，姚湘燕，等.产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的克隆与核苷酸序列分析.中国兽医学报，1998；18(2)：140～143
(收稿 1998-04-03 修回 1998-05-19), 百拇医药
单位：许崇波 朱平 马从林 冯书章(解放军农牧大学军事兽医研究所，长春130062)；石瑾琪(山西省大同市第二卫生防疫站)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990122
α毒素是A型产气荚膜梭菌所致严重创伤性气性坏疽的主要致死因素，至今尚无有效的防治方法，使用抗生素和多价抗毒素效果不明显〔1〕。为此，我们采用细胞融合技术，制备了抗α毒素的单克隆抗体(mAb)，为治疗气性坏疽患者的α毒素中毒提供可能性。
1 材料和方法
1.1 抗原和细胞 α毒素抗原系重组菌株BL21(DE3)(pXETA1)的表达产物，按照表达系统pET-28b(+)的操作手册进行提取。Sp2/0骨髓瘤细胞，由本室保存。
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1.2 实验动物 6周～8周龄Balb/c小鼠，由卫生部长春生物制品研究所提供。
1.3 抗α毒素mAb的制备 动物免疫、细胞融合筛选、克隆化及腹水制备，均为常规方法〔2〕。
1.4 mAb的特性鉴定
1.4.1 抗体效价测定采用间接ELISA测定。
1.4.2 mAb的Ig亚类鉴定用Gibco BRL公司的Mouse Monoclonal Antibody IsotypingKit(Dipstick Format)进行鉴定。
1.4.3 mAb的中和活性测定将腹水与等量的α毒素混合，于37℃作用1h后，分别接种于卵黄琼脂平板和血液琼脂平板上，观察有无分解卵磷脂和溶血环的现象。
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1.4.4 mAb的保护试验取8周龄Balb/c小鼠，随机分为4组，每组5只，分别腹腔注入1个LD100的α毒素。然后在0h，4h和8h经腹腔注入抗α毒素的mAb1A8，1C3或1F1，同时设生理盐水对照组，连续1周观察各组小鼠的死亡情况。
2 结果
2.1 抗α毒素mAb的制备 免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞的融合率为63.19%,抗体阳性率为30.63%。经克隆化后，共获得3株阳性克隆细胞株，分别命名为1A8，1C3和1F1。
2.2 mAb的鉴定
2.2.1 mAb的效价测定3株杂交瘤细胞的培养上清和腹水，用间接ELISA检测，效价分别为1：512～1024及1×106～1×108。
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2.2.2 mAb的Ig亚类鉴定1A8和1C3为IgG3，1F1为IgM，3株的轻链均为κ型。
2.2.3 mAb中和活性的测定结果见表1。
表1 mAb的中和活性测定 细胞株
中和磷脂酶C活性
中和溶血活性
1A8
+
+
1C3
+
-
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1F1
-
-
2.2.4 mAb的保护效果结果见表2。表2 mAb1A8对致死性α毒素腹腔攻击小鼠的保护效果 组别
mAb腹水注入时间
0h
4h
8h
实验组
5/5*
5/5
4/5
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对照组
0/5
/
/
*分母实验动物数，分子为存活数
3 讨论
α毒素是A型产气荚膜梭菌最主要的毒力因子，能引起人类创伤的气性坏疽。为探索有效的治疗方法，我们在克隆成功α毒素保护性抗原基因的基础上〔3〕，研制出抗α毒素的mAb。用从重组菌株中提取的α毒素包涵体免疫Balb/c小鼠，经融合、筛选、克隆化和ELISA检测，建立了3株能稳定分泌抗α毒素mAb的杂交瘤细胞。3株杂交瘤细胞的培养上清及腹水mAb效价分别高达1∶1024和1×108。更为重要的是，mAb1A8同时具有中和α毒素磷脂酶C活性和溶血活性，且有抵抗致死性α毒素腹腔攻击小鼠的保护作用。本研究不仅为下一步研制α毒素的单链抗体奠定了基础，而且可为临床上试用于治疗α毒素中毒提供新的途径。
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作者简介：许崇波，男，30岁，助理研究员，博士
长春市西安大路175号，Tel.(0431)797101666685
参考文献
[1]Rood HI, Cole ST. Molecular genetics and pathogenesis of Clostridium perfringens. Microbiol Rev, 1991; 55(4):621～ 648
[2]朱平，冯书章.抗体实验技术.长春：长春出版社，1994：67～151
[3]许崇波，朱平，姚湘燕，等.产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的克隆与核苷酸序列分析.中国兽医学报，1998；18(2)：140～143
(收稿 1998-04-03 修回 1998-05-19), 百拇医药