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编号:10275417
抗人IL-5片段单克隆抗体的制备及其活性测定*
http://www.100md.com 《细胞与分子免疫学杂志》 1999年第1期
     作者:史皆然 方佳 孙滨 卢芳 陈常庆

    单位:史皆然 孙滨(第四军医大学西京医院呼吸内科,西安710032);方佳 卢芳 陈常庆(中国科学院上海生物工程研究中心)

    关键词:

    细胞与分子免疫学杂志990121

    根据hIL-5的结构、功能特点,设计并合成了hIL-5羧基端19肽,用以免疫小鼠。经融合、筛选出7株抗hIL-5单克隆抗体(mAb)。利用TF-1细胞对hIL-5依赖生长的特性,采用MTT法〔1〕对mAb进行了活性测定。

    1 材料和方法

    1.1 动物与细胞 Balb/c小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供;小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0和人红白血病细胞系(TF-1),由中国科学院上海生物工程研究中心保存。
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    1.2 主要试剂 hIL-5标准品为英国PeproTech公司产品;四甲基偶氮唑盐(MTT)购于华美公司;IL-5C末端19肽,由中国科学院上海生化所合成。

    1.3 mAb的制备 参照文献[2],采用脾内加腹腔免疫,按常规方法融合、筛选及克隆化。

    1.4 TF-1最适细胞密度的选择 收集处于对数生长期的TF-1细胞,洗涤3次后,用含10%FCS的RPMI-1640调整细胞数为1.6×1010/L,经倍比稀释后加于96孔培养板,每孔100μl,每个稀释度设3个复孔;每孔再加入10μg/LhIL-5标准品。37℃CO2孵箱中培养60h后,每孔加入20μlMTT液置CO2孵箱中培养4h~6h;每孔加入100μl裂解液过夜,于酶标仪(BIO-RAD)上测定A570nm的光吸收值,选出最适细胞生长密度。

, 百拇医药     1.5 hIL-5最适浓度的选择 将不同稀释度的hIL-5标准品加于96孔培养板,每个稀释度设3个复孔,再每孔加100μl最适细胞密度(2×109/L)的TF-1细胞悬液,同上进行MTT比色测定,选出hIL-5的最适工作浓度。

    1.6 mAb对TF-1细胞增殖的抑制作用 将最适TF-1细胞悬液及最适hIL-5工作液,加于96孔培养板,每孔再加入不同稀释度的7株抗hIL-5mAb腹水(每孔20μl);同时设hIL-5和培养基对照,同法进行MTT比色测定,并计算mAb对TF-1细胞增殖的抑制率。

    2 结果

    2.1 mAb的制备 以人工合成的19肽为免疫原,进行脾内和腹腔基础免疫,经融合、筛选及克隆化,得到7株抗hIL-5mAb的杂交瘤细胞(1H11,3D6,2H10,3H7,3E12,3G5和3D4)。将7株杂交瘤细胞连续培养2月余,分泌mAb的特性不变,并可在小鼠体内诱生出mAb腹水。
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    2.2 TF-1细胞最适培养密度及hIL-5最佳工作浓度的选择 对不同TF-1细胞密度的MTT比色结果表明,细胞密度增加到一定程度时,受细胞代谢的影响,A570nm反而降低,故选定2.0×109/L为最适细胞密度。不同hIL-5浓度对TF-1细胞的作用结果表明,当hIL-5浓度低于4μg/L时,A570nm开始下降,因此选定8μg/L为hIL-5的最适工作浓度。

    2.3 抗hIL-5mAb对TF-1细胞增殖的抑制作用 7株mAb中有5株(2H10,3G5,3D6,1H11和3H7)的阻断抑制率超过50%,分别为81.3%,77.4%,75.6%,67.8%和57.1%(图1)。

    图1 7株mAb对TF-1细胞增殖的抑制作用

, http://www.100md.com     3 讨论

    IL-5主要由T淋巴细胞产生〔3〕。成熟hIL-5是由两个反向平行的单体以链间二硫键连接而成的同源二聚体。其中1个单体的前3个α螺旋和2个β折叠与另1个单体的第4个α螺旋所组成的Cytokinefold是其与受体相结合的结构基础〔4〕。互换人、鼠IL-5的C末端36个氨基酸后,其生物学活性可发生种属特异性改变,表明IL5与α受体亚基的结合是由其C末端的α螺旋所决定的。针对Met107用CNBr裂解法和氧化法研究发现,hIL-5C末端8个氨基酸是其生物学活性区〔5〕。为此,我们设计、合成了hIL-5C末端19肽,作为抗原替代完整的IL-5分子,制备抗hIL-5的mAb。经细胞融合获得7株对hIL-5具有结合活性的mAb,其中有5株mAb具有抑制TF-1细胞增殖的活性,表明这些mAb具有较好的特异性,为进一步应用打下了良好的基础。

    *国家自然科学基金资助项目,No.39470324
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    作者简介:史皆然,男,30岁,主治医师,硕士

    西安市长乐西路15号,Tel.(029)3375237

    参考文献

    [1]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application of class-specific antibody in mouse serum. J Immunol Meth, 1983; 65(1-2):55~64

    [2]徐志凯主编.《实用单克隆抗体技术》.西安:陕西科技出版社,1991:51~107

    [3]Robinson DS, Durham SR, Kay AB. Cytokines in asthma.Thorax,1993; 48(7): 845~853
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    [4]Michael VM, Anne MH,Millard Hl,et al. Anvel dimmer configuration revealed by the crystal structure at 2,4 a resolution of human interleukin-5. Nature, 1993; 363(13):172~ 176

    [5]Metcalf D. The molecular biology and functions of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood,1996;67(2):257~267

    [6]Kodama S,Tsuruoka N ,Tsujimoto M. Role of the C-terminus in the biological activity of human interleukin-5.Biochem Biophys Res Commun,1991; 178(2):514~519

    (收稿 1998-06-01 修回 1998-07-02), 百拇医药