白细胞介素2作为乙型肝炎病毒基因疫苗佐剂的效应
作者：李文波 姚志强 周永兴 冯志华
单位：李文波 姚志强 周永兴 冯志华(第四军医大学唐都医院感染病科，西安710038)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990118
近年来,随着细胞因子研究的进展,发现许多细胞因子具有明显的免疫佐剂效应(adjuvanticity)，其中IL-2可能是最有效的一种。有实验证明，给小鼠注射灭活狂犬病毒疫苗后，若再连续注射数天IL-2，发现小鼠对狂犬病毒的防御作用明显增强[1]；若注射疟疾子孢子多肽疫苗和IL-2的油乳剂,能完全克服小鼠MHC相关联的遗传无应答性[2]。新兴的基因疫苗，由于诱导的免疫应答全面，且具有易于制备、贮存等优点，现已应用于传染病、恶性肿瘤、变态反应及自身免疫病等的防治。本文以构建的编码HBVS蛋白的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为基因疫苗，以rhIL-2为佐剂，研究了rhIL-2对HBV基因疫苗诱导小鼠免疫应答的影响，以探讨其作为基因疫苗免疫佐剂的可能性。
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1 材料和方法
1.1 重组质粒的构建与鉴定 重组质粒的构建工作由姚志强教授在比利时鲁汶大学完成。主要步骤是：以计算机设计PCR引物，从HBV患者血清(adw型)中获得HBVS基因序列；再以T-A克隆法，插入真核表达载体pCR3.1(Invitrogen公司产品)；酶切、电泳鉴定正向插入的片段，即得重组质粒pCR3.1-S。
1.2 重组质粒的瞬时表达 细胞系Sp2/0(悬浮细胞，小鼠骨髓瘤细胞系)为本室保存。Lipofectamine转染试剂购自美国Gibco公司。具体转染方法参照Lipofectamine产品说明书。转染72h后，离心取上清，以HBsAg检测试剂盒(华美生物工程公司产品)测定分泌型蛋白S。于450nm波长处测定A值，P/N>2.1者为阳性。
1.3 免疫接种 选用雌性Balb/c小鼠，6周～8周龄(本校实验动物中心提供)，随机分组，每组5只。以0.5%盐酸布比卡因、0.1%对羟基苯甲酸甲酯(生理盐水为溶剂)处理小鼠股四头肌。24h后，于上述注射部位，多点注射100μg的重组质粒；间隔2周加强注射,共两次。基因疫苗注射18h～24h后,于上述部位再多点注射rhIL-2(北京邦定生物医学公司产品)，每d两次，连续5d。按注射rhIL-2的剂量分500U，1000U和2000U3个组。同时以未应用rhIL-2的重组质粒免疫小鼠作为对照，8周后取血。
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1.4 抗HBs的检测 采用间接ELISA法。包被抗原为纯化的HBsAg(包被浓度5mg/L)，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，TMB为底物,结果以P/N>2.1为阳性。
1.5 淋巴细胞增殖的测定 采用3H-TdR掺入法。取小鼠脾细胞(浓度调至5×109/L)，按100μl/孔加入96孔培养板中。培养4h～6h后，分别加入20mg/L的纯化HBsAg至总体积达200μl/孔。培养72h后，每孔再加入1.85×104Bq的3H-TdR，继续培养12h～18h，以β液闪计数仪(Beckman公司产品)计数cpm值。增殖水平以刺激指数(SI)来表示，SI=(实验组cpm值-仪器本底)/(对照组cpm值-仪器本底)。
2 结果
2.1 重组质粒的鉴定 以XbaI酶切重组质粒，获得621bp的片段，符合酶切图谱。
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2.2 分泌型S蛋白的检测 将细胞培养上清液倍比稀释，经HBsAgELISA试剂盒测定，转染组的效价约为1∶2～1∶8，而对照组(空载体)呈阴性。
2.3 rhIL-2对HBV基因疫苗免疫效果的影响
2.3.1 抗HBs的应答经应用500U，1000U和2000UrhIL-2/次·只鼠的3组，随注射剂量的增加，抗HBs的ELISA效价(A值)呈上升趋势，但与对照组相比较无显著差异(P>0.05)。
2.3.2 淋巴细胞增殖的测定应用1000U和2000 UrhIL-2/次·只鼠的两组与对照组相比较，差异显著(P<0.05) ；而应用500 UrhIL-2/次·只鼠组与对照组相比较差异不显著(P>0.05)。
3 讨论
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我们以构建的HBV重组真核表达质粒pCR3.1-S作为基因疫苗，经多点肌肉注射免疫Balb/c小鼠后，接着又在上述注射部位，以同样的注射方式分别给予500U，1000U和2000U/只小鼠的rhIL-2(每d2次，连续5d)。结果表明，一定剂量的rhIL-2具有增强免疫小鼠细胞免疫应答的效应，这与IL-2为T细胞生长因子，可促进T细胞分裂、增殖活性有关；加之采用了多点肌肉注射的方式，更有利于其持续地发挥作用。
Chow等[3]用其构建的含IL-2基因的HBV基因疫苗免疫小鼠，不仅获得良好的细胞免疫应答，而且可产生明显的体液免疫应答。而本研究中，免疫小鼠产生的抗HBs的效价与对照组小鼠相比较，则未见有显著差异(P>0.05)。我们认为，可能主要与所用rhIL-2的剂量不足有关。Nunberg等[1]在研究rhIL-2的剂量为300U/g体重时，才出现明显的佐剂效应。本研究中所用Balb/c小鼠的平均体重为20g，按Nunberg等的报道推算，每次注射rhIL-2的剂量应为6000U/只小鼠，为本研究中实际用量的3～6倍；又因IL-2的半衰期很短(仅6.9min)，使之更难发挥其佐剂作用。而Chow等[3]所用基因疫苗中的IL-2基因产物,则可不断释放而发挥作用，故其免疫效果较佳。
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尽管如此，我们认为，本研究的结果基本证实了HBV重组真核表达质粒pCR3.1-S作为基因疫苗是可行的，并表明一定剂量的rhIL-2同时或相继应用可发挥其佐剂效应。
作者简介：李文波，男，24岁，硕士生
西安市灞桥区新寺路1号，Tel.(029)3513140-77595
参考文献
[1]Nunberg JH, Doyle MV, York SM, et al. Interleukin 2 acts as an adjuvant to increase the potency of inactivated rabies virus vaccine.Proc Natl Acad Sci USA,1989；86: 4240～4243
[2]Good MF,Pombo D,Lunde MN, et al. Recombinant human IL-2 overcomes genetic nonresponsiveness to malaria sporozoite peptides:correlation of effect with biologic activity of IL-2. J Immunol,1988；141:972～977
[3]Chow YH,Huang WL,Chi WK, et al. Improvement of hepatitis B virus DNA vaccines by plasmids coexpressing hepatitis B surface antigen and interleukin-2. J Virol,1997；71:169～ 178
(收稿1998-08-17修回1998-09-14), http://www.100md.com
单位：李文波 姚志强 周永兴 冯志华(第四军医大学唐都医院感染病科，西安710038)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990118
近年来,随着细胞因子研究的进展,发现许多细胞因子具有明显的免疫佐剂效应(adjuvanticity)，其中IL-2可能是最有效的一种。有实验证明，给小鼠注射灭活狂犬病毒疫苗后，若再连续注射数天IL-2，发现小鼠对狂犬病毒的防御作用明显增强[1]；若注射疟疾子孢子多肽疫苗和IL-2的油乳剂,能完全克服小鼠MHC相关联的遗传无应答性[2]。新兴的基因疫苗，由于诱导的免疫应答全面，且具有易于制备、贮存等优点，现已应用于传染病、恶性肿瘤、变态反应及自身免疫病等的防治。本文以构建的编码HBVS蛋白的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为基因疫苗，以rhIL-2为佐剂，研究了rhIL-2对HBV基因疫苗诱导小鼠免疫应答的影响，以探讨其作为基因疫苗免疫佐剂的可能性。
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1 材料和方法
1.1 重组质粒的构建与鉴定 重组质粒的构建工作由姚志强教授在比利时鲁汶大学完成。主要步骤是：以计算机设计PCR引物，从HBV患者血清(adw型)中获得HBVS基因序列；再以T-A克隆法，插入真核表达载体pCR3.1(Invitrogen公司产品)；酶切、电泳鉴定正向插入的片段，即得重组质粒pCR3.1-S。
1.2 重组质粒的瞬时表达 细胞系Sp2/0(悬浮细胞，小鼠骨髓瘤细胞系)为本室保存。Lipofectamine转染试剂购自美国Gibco公司。具体转染方法参照Lipofectamine产品说明书。转染72h后，离心取上清，以HBsAg检测试剂盒(华美生物工程公司产品)测定分泌型蛋白S。于450nm波长处测定A值，P/N>2.1者为阳性。
1.3 免疫接种 选用雌性Balb/c小鼠，6周～8周龄(本校实验动物中心提供)，随机分组，每组5只。以0.5%盐酸布比卡因、0.1%对羟基苯甲酸甲酯(生理盐水为溶剂)处理小鼠股四头肌。24h后，于上述注射部位，多点注射100μg的重组质粒；间隔2周加强注射,共两次。基因疫苗注射18h～24h后,于上述部位再多点注射rhIL-2(北京邦定生物医学公司产品)，每d两次，连续5d。按注射rhIL-2的剂量分500U，1000U和2000U3个组。同时以未应用rhIL-2的重组质粒免疫小鼠作为对照，8周后取血。
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1.4 抗HBs的检测 采用间接ELISA法。包被抗原为纯化的HBsAg(包被浓度5mg/L)，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，TMB为底物,结果以P/N>2.1为阳性。
1.5 淋巴细胞增殖的测定 采用3H-TdR掺入法。取小鼠脾细胞(浓度调至5×109/L)，按100μl/孔加入96孔培养板中。培养4h～6h后，分别加入20mg/L的纯化HBsAg至总体积达200μl/孔。培养72h后，每孔再加入1.85×104Bq的3H-TdR，继续培养12h～18h，以β液闪计数仪(Beckman公司产品)计数cpm值。增殖水平以刺激指数(SI)来表示，SI=(实验组cpm值-仪器本底)/(对照组cpm值-仪器本底)。
2 结果
2.1 重组质粒的鉴定 以XbaI酶切重组质粒，获得621bp的片段，符合酶切图谱。
, http://www.100md.com
2.2 分泌型S蛋白的检测 将细胞培养上清液倍比稀释，经HBsAgELISA试剂盒测定，转染组的效价约为1∶2～1∶8，而对照组(空载体)呈阴性。
2.3 rhIL-2对HBV基因疫苗免疫效果的影响
2.3.1 抗HBs的应答经应用500U，1000U和2000UrhIL-2/次·只鼠的3组，随注射剂量的增加，抗HBs的ELISA效价(A值)呈上升趋势，但与对照组相比较无显著差异(P>0.05)。
2.3.2 淋巴细胞增殖的测定应用1000U和2000 UrhIL-2/次·只鼠的两组与对照组相比较，差异显著(P<0.05) ；而应用500 UrhIL-2/次·只鼠组与对照组相比较差异不显著(P>0.05)。
3 讨论
, 百拇医药
我们以构建的HBV重组真核表达质粒pCR3.1-S作为基因疫苗，经多点肌肉注射免疫Balb/c小鼠后，接着又在上述注射部位，以同样的注射方式分别给予500U，1000U和2000U/只小鼠的rhIL-2(每d2次，连续5d)。结果表明，一定剂量的rhIL-2具有增强免疫小鼠细胞免疫应答的效应，这与IL-2为T细胞生长因子，可促进T细胞分裂、增殖活性有关；加之采用了多点肌肉注射的方式，更有利于其持续地发挥作用。
Chow等[3]用其构建的含IL-2基因的HBV基因疫苗免疫小鼠，不仅获得良好的细胞免疫应答，而且可产生明显的体液免疫应答。而本研究中，免疫小鼠产生的抗HBs的效价与对照组小鼠相比较，则未见有显著差异(P>0.05)。我们认为，可能主要与所用rhIL-2的剂量不足有关。Nunberg等[1]在研究rhIL-2的剂量为300U/g体重时，才出现明显的佐剂效应。本研究中所用Balb/c小鼠的平均体重为20g，按Nunberg等的报道推算，每次注射rhIL-2的剂量应为6000U/只小鼠，为本研究中实际用量的3～6倍；又因IL-2的半衰期很短(仅6.9min)，使之更难发挥其佐剂作用。而Chow等[3]所用基因疫苗中的IL-2基因产物,则可不断释放而发挥作用，故其免疫效果较佳。
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尽管如此，我们认为，本研究的结果基本证实了HBV重组真核表达质粒pCR3.1-S作为基因疫苗是可行的，并表明一定剂量的rhIL-2同时或相继应用可发挥其佐剂效应。
作者简介：李文波，男，24岁，硕士生
西安市灞桥区新寺路1号，Tel.(029)3513140-77595
参考文献
[1]Nunberg JH, Doyle MV, York SM, et al. Interleukin 2 acts as an adjuvant to increase the potency of inactivated rabies virus vaccine.Proc Natl Acad Sci USA,1989；86: 4240～4243
[2]Good MF,Pombo D,Lunde MN, et al. Recombinant human IL-2 overcomes genetic nonresponsiveness to malaria sporozoite peptides:correlation of effect with biologic activity of IL-2. J Immunol,1988；141:972～977
[3]Chow YH,Huang WL,Chi WK, et al. Improvement of hepatitis B virus DNA vaccines by plasmids coexpressing hepatitis B surface antigen and interleukin-2. J Virol,1997；71:169～ 178
(收稿1998-08-17修回1998-09-14), http://www.100md.com