微波、高压、真空负压和电炉四种加热法在抗原修复中的比较
作者：赵玉宁 范智勇
单位：赵玉宁 范智勇(解放军第三医院病理科，陕西宝鸡721004)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990129
常规免疫组织化学染色难以使癌基因、抑癌基因及其产物显示满意的效果。应用高温对组织抗原进行修复，可有效地暴露抗原决定簇而增强免疫组织化学染色的结果〔1〕。据此，我们应用了4种不同的加热法，对胶质瘤组织抗原的修复进行了对比研究。
1 材料和方法
1.1 材料 为我科收集的外科检查确诊为胶质瘤的标本，共80例，均经10%福尔马林液固定，石蜡包埋。每例做连续4μm切片20张，附贴于涂有多聚-L-赖氨酸的玻片上，置60℃烤箱内烘烤
, 百拇医药
4h。P16，Rb,EGFR,CyclinD1及S-P试剂盆，均为美国Maxim Biotech公司产品；多聚-L-赖氨酸购自福州迈新生物技术公司。
1.2 方法 ①高压锅直接煮沸法：切片脱蜡至水→蒸馏水洗(2×1min/次)→置柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，电炉加热至喷气并持续2min→自来水冲压力锅使之冷却至室温后，取出切片→蒸馏水洗(2×1min/次)→PBS液(pH7.2)洗(2×3min/次)→S-P染色。②微波辐射法：切片脱蜡至水→3%H2O2甲醇处理10min→蒸馏水洗(3×2min/次)→置0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，于92℃～95℃下微波辐射10min→冷却至室温后，取出切片→PBS(pH7.2)洗(3×2min/次)→S-P染色。③真空负压干燥箱加热法：切片脱蜡至水→置0.3%H2O2甲醇中，真空负压处理5min〔2〕→自来水洗(1min)→置0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，放入95℃真空恒温干燥箱中，真空负压处理10min→PBS(pH7.2)洗(3×1min/次)→真空负压染色〔3〕。④电炉加热法：切片脱蜡至水→蒸馏水洗(2×1min/次)，→3%H2O2甲醇室温度处理1min→自来水洗(1min),蒸馏水洗(2×1min/次)→置0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)中电炉加热，反复持续10min，离开电源，冷却至室温→PBS(pH7.2)洗(3×2min/次)→SP染色。
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1.3 对照设置 阳性对照片购自迈新公司，以PBS液置换一抗作为阴性对照；以未经抗原修复的切片进行S-P染色作为阳性对照。
1.4 统计学处理 采用x2检验
2 结果
P16阳性颗粒主要位于胞浆中(图1A)；Rb和CyclinD1阳性颗粒主要位于胞核和胞浆(图1Ba和Bb)；EGFR阳性颗粒主要位于胞膜(图1C)。本试验将染色结果按阳性细胞的范围分为：“-”阳性细胞数<10%；“+”阳性细胞数占10%～25%；“++”阳性细胞数占25%～50%；“+++”阳性细胞数>50%。具体染色结果见表1。
, 百拇医药
图1 胶质瘤的免疫组化染色结果(×400)
A：胶质瘤Ⅱ级P16染色呈阳性；Ba：胶质瘤Ⅱ级Rb染色呈阳性；
Bb：胶质瘤Ⅳ级CyclinD1染色呈阳性；C：胶质瘤Ⅱ级EGFR染色呈阳性
表1 4种不同抗原修复法的免疫组化染色(n=80) 抗原修复法
D16
Rb
EGFR
CyclinD1
电-
57
, 百拇医药 46
40
56
炉+
19
16
21
16
加++
4
7
16
7
热++
, 百拇医药
0
1
3
1
高-
50
38
26
48
压+
22
25
27
18
, 百拇医药
加++
7
15
20
12
热+++
1*
2*
7*
2*
真-
46
, http://www.100md.com 22
19
38
空+
12
24
24
19
负++
16
27
19
15
压+++
, 百拇医药
6#
7#
18#
8#
微-
45
23
17
36
波+
9
16
, http://www.100md.com 19
11
辐++
17
27
20
19
射+++
9#*
14#*
24#*
14#*
, http://www.100md.com
对-
69
71
61
73
照+
11
7
15
6
组++
0
2
4
, http://www.100md.com
1
+++
0
0
0
0
注：4种方法与对照组比较,P<0.001；*与电炉加热法比较，P<0.05；＃与高温加热法比较P<0.01；＃*与真空负压法比较，P>0.05
3 讨论
组织标本在用甲醛固定过程中，常因形成醛键、羧甲基，或蛋白与蛋白之间发生交联封闭了抗原决定簇，而使免疫组织化学标记的的敏感性明显降低。有研究表明〔3，4〕，经福尔马林固定后的组织要获得更好的免疫组化染色结果，必须在适当的高温下进行抗原修复。
, 百拇医药
高温组织抗原修复法(AR)是将切片置于柠檬酸缓冲液中，应用各种不同的加热方法使温度达到92℃以上并持续一段时间，以使被封闭的抗原决定簇得以重新暴露和修复，这样抗原、抗体便可更好地结合。本研究中应用了4种不同的加热方法进行AR，并与对照组进行了对比研究。结果显示：4种加热方法中，以真空负压加热法和微波辐射法的染色效果较好；但在操作过程中，各有优点。真空负压法加热的温度均匀恒定，方法简便，不受条件限制，不会使柠檬酸缓冲液沸腾，不易脱片，成功率高，但抽气管易软化。微波辐射法使用方便，但温度不易掌握，缓冲液沸腾可导致脱片，且金属仪器均不能使用。高压加热法的染色效果稍差，电炉直接加热法的染色效果最差。值得一提的是，纪小龙等〔1〕曾对43种抗体进行了微波辐射和高压加热对比观察。结果发现，17种抗体经高压方法处理后，染色效果明显增强。
致谢：本研究受到第四军医大学王泊云高级实验师的指导，特此感谢!
作者简介：赵玉宁，男，47岁，主管技师
, 百拇医药
宝鸡市东风路45号，Tel.(0917)3415511-6547
参考文献
[1]纪小龙，施作霖.诊断免疫组织化学.北京：军事医学出版社，1997：14～16
[2]Jun jie C,Hongming Q.Application of vacuum cabinet in immunohistochemi calstaining.Cell Vision,1995;2(2):142～145
[3]蔡俊杰，邱红明.真空负压、微波辐射种电炉三种不同处理方法对抗原修复的比较研究.细胞与分子免疫学杂志，1997；13(增刊1)：24～26
[4]MasonJT,OlearyTJ.Effectsof formaldehyde fixation on protein secondary structure: a calorimetric and infrared spectroscopic investigation. J Histochem Cytochem, 1991; 39: 225～227
(收稿 1998-03-18 修回 1998-04-06), 百拇医药
单位：赵玉宁 范智勇(解放军第三医院病理科，陕西宝鸡721004)
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990129
常规免疫组织化学染色难以使癌基因、抑癌基因及其产物显示满意的效果。应用高温对组织抗原进行修复，可有效地暴露抗原决定簇而增强免疫组织化学染色的结果〔1〕。据此，我们应用了4种不同的加热法，对胶质瘤组织抗原的修复进行了对比研究。
1 材料和方法
1.1 材料 为我科收集的外科检查确诊为胶质瘤的标本，共80例，均经10%福尔马林液固定，石蜡包埋。每例做连续4μm切片20张，附贴于涂有多聚-L-赖氨酸的玻片上，置60℃烤箱内烘烤
, 百拇医药
4h。P16，Rb,EGFR,CyclinD1及S-P试剂盆，均为美国Maxim Biotech公司产品；多聚-L-赖氨酸购自福州迈新生物技术公司。
1.2 方法 ①高压锅直接煮沸法：切片脱蜡至水→蒸馏水洗(2×1min/次)→置柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，电炉加热至喷气并持续2min→自来水冲压力锅使之冷却至室温后，取出切片→蒸馏水洗(2×1min/次)→PBS液(pH7.2)洗(2×3min/次)→S-P染色。②微波辐射法：切片脱蜡至水→3%H2O2甲醇处理10min→蒸馏水洗(3×2min/次)→置0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，于92℃～95℃下微波辐射10min→冷却至室温后，取出切片→PBS(pH7.2)洗(3×2min/次)→S-P染色。③真空负压干燥箱加热法：切片脱蜡至水→置0.3%H2O2甲醇中，真空负压处理5min〔2〕→自来水洗(1min)→置0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)中，放入95℃真空恒温干燥箱中，真空负压处理10min→PBS(pH7.2)洗(3×1min/次)→真空负压染色〔3〕。④电炉加热法：切片脱蜡至水→蒸馏水洗(2×1min/次)，→3%H2O2甲醇室温度处理1min→自来水洗(1min),蒸馏水洗(2×1min/次)→置0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)中电炉加热，反复持续10min，离开电源，冷却至室温→PBS(pH7.2)洗(3×2min/次)→SP染色。
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1.3 对照设置 阳性对照片购自迈新公司，以PBS液置换一抗作为阴性对照；以未经抗原修复的切片进行S-P染色作为阳性对照。
1.4 统计学处理 采用x2检验
2 结果
P16阳性颗粒主要位于胞浆中(图1A)；Rb和CyclinD1阳性颗粒主要位于胞核和胞浆(图1Ba和Bb)；EGFR阳性颗粒主要位于胞膜(图1C)。本试验将染色结果按阳性细胞的范围分为：“-”阳性细胞数<10%；“+”阳性细胞数占10%～25%；“++”阳性细胞数占25%～50%；“+++”阳性细胞数>50%。具体染色结果见表1。
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图1 胶质瘤的免疫组化染色结果(×400)
A：胶质瘤Ⅱ级P16染色呈阳性；Ba：胶质瘤Ⅱ级Rb染色呈阳性；
Bb：胶质瘤Ⅳ级CyclinD1染色呈阳性；C：胶质瘤Ⅱ级EGFR染色呈阳性
表1 4种不同抗原修复法的免疫组化染色(n=80) 抗原修复法
D16
Rb
EGFR
CyclinD1
电-
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炉+
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16
21
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加++
4
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16
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热++
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0
1
3
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高-
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26
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压+
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对-
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照+
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注：4种方法与对照组比较,P<0.001；*与电炉加热法比较，P<0.05；＃与高温加热法比较P<0.01；＃*与真空负压法比较，P>0.05
3 讨论
组织标本在用甲醛固定过程中，常因形成醛键、羧甲基，或蛋白与蛋白之间发生交联封闭了抗原决定簇，而使免疫组织化学标记的的敏感性明显降低。有研究表明〔3，4〕，经福尔马林固定后的组织要获得更好的免疫组化染色结果，必须在适当的高温下进行抗原修复。
, 百拇医药
高温组织抗原修复法(AR)是将切片置于柠檬酸缓冲液中，应用各种不同的加热方法使温度达到92℃以上并持续一段时间，以使被封闭的抗原决定簇得以重新暴露和修复，这样抗原、抗体便可更好地结合。本研究中应用了4种不同的加热方法进行AR，并与对照组进行了对比研究。结果显示：4种加热方法中，以真空负压加热法和微波辐射法的染色效果较好；但在操作过程中，各有优点。真空负压法加热的温度均匀恒定，方法简便，不受条件限制，不会使柠檬酸缓冲液沸腾，不易脱片，成功率高，但抽气管易软化。微波辐射法使用方便，但温度不易掌握，缓冲液沸腾可导致脱片，且金属仪器均不能使用。高压加热法的染色效果稍差，电炉直接加热法的染色效果最差。值得一提的是，纪小龙等〔1〕曾对43种抗体进行了微波辐射和高压加热对比观察。结果发现，17种抗体经高压方法处理后，染色效果明显增强。
致谢：本研究受到第四军医大学王泊云高级实验师的指导，特此感谢!
作者简介：赵玉宁，男，47岁，主管技师
, 百拇医药
宝鸡市东风路45号，Tel.(0917)3415511-6547
参考文献
[1]纪小龙，施作霖.诊断免疫组织化学.北京：军事医学出版社，1997：14～16
[2]Jun jie C,Hongming Q.Application of vacuum cabinet in immunohistochemi calstaining.Cell Vision,1995;2(2):142～145
[3]蔡俊杰，邱红明.真空负压、微波辐射种电炉三种不同处理方法对抗原修复的比较研究.细胞与分子免疫学杂志，1997；13(增刊1)：24～26
[4]MasonJT,OlearyTJ.Effectsof formaldehyde fixation on protein secondary structure: a calorimetric and infrared spectroscopic investigation. J Histochem Cytochem, 1991; 39: 225～227
(收稿 1998-03-18 修回 1998-04-06), 百拇医药