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编号:10275441
5′端帽状结构对乙脑病毒RNA稳定性和感染性的作用
http://www.100md.com 《细胞与分子免疫学杂志》 1999年第2期
     作者:黄庆生 姜绍谆 马文煜 张富泉 樊英茹 肖毅 刘利兵

    单位:第四军医大学微生物学教研室,西安,710032

    关键词:

    细胞与分子免疫学杂志990226

    5′端帽状结构对多数病毒RNA的稳定性和感染性具有重要作用,而对另一些病毒的RNA则非必需〔1~3〕。乙脑病毒基因组为单股正链RNA,长约11kb,5′端有帽状结构,3′端无PolyA〔4,5〕。为了验证5′mGpppA对乙脑病毒RNA稳定性和感染性的作用,我们采用本室构建的乙脑病毒感染性克隆(乙脑病毒全长cDNA,克隆于T7启动子下游)体外转录出感染性RNA(即感染性转录体),对在转录反应中掺入与不掺入5′mGpppA所获得的RNA,在转染BHK细胞后的病变效应及免疫荧光强弱是否相同,确定5′mGpppA对乙脑病毒RNA稳定性和感染性的作用。
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    1 材料和方法

    1.1 材料 乙脑病毒全长cDNA克隆为本室构建。T7RNA聚合酶购自日本宝生物公司(Takara),5′mGpppA购自宝灵曼公司;rNTP购自Promega公司;RNasin和脂质体购自GIBCO/BRL公司。

    1.2 方法〔6,7〕 10μg含JEVcDNA的克隆载体,用ScaI在JEVcDNA末端切开,使呈线状。分A、B两组,每组均含下列成分:5μg线状DNA,10mmol/LrNTP各5μl,RNasin 20U,10×buffer 5μl T7 RNA 聚合酶35U,A组加100 mmol/L5′mGpppA2μl,B组不加5′mGpppA。两组各补加无RNA酶的去离子水至50μl,37℃3h。将两组转录产物分别加入150μl无血清的RPMI-1640中(含20μl的脂质体),轻轻混匀,转入35mm培养碟的BHK单层细胞中(细胞已用无血清的RPMI-1640洗两遍),补加300μl无血清RPMI-1640,37℃3h后弃去碟中液体,加入2ml含2%小牛血清的RPMI-1640,37℃培养,观察病变结果。同时设只加脂质体不加转录产物的阴性对照。将上述A、B两组细胞及阴性对照细胞,观察1周后固定,用抗乙脑病毒的mAb做免疫荧光染色,确定病变是否特异及比较荧光强弱。
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    2 结果和讨论

    加5′mGpppA组与不加5′mGpppA组在第5天都开始出现病变,到第7天两组细胞的病变基本相同,大约达到“+++”(约70%~80%细胞产生病变),而阴性对照组细胞则无病变。mAb荧光染色结果表明,细胞病变为特异性的,A、B两组都出现较强的特异性荧光,阴性对照组无特异性荧光。

    对RNA病毒而言,一般认为帽状结构可增加RNA的感染性,这可能与其可提高翻译效率、增加RNA的稳定性和防止宿主细胞对RNA的降解有关。但从本实验结果看,裸露的乙脑病毒RNA带不带有5′mGpppA对其感染性和稳定性看不出有何影响。而天然的乙脑病毒RNA都带有帽状结构,这一结构究竞对该病毒的转录与翻译起何作用?有待于进一步探讨。而阐明这些机理对RNA病毒的分子生物学研究则有重要的意义。

    作者简介:黄庆生,男,35岁,博士生。西安市长乐西路17号,Tel.(029)3374526
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    参考文献

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    [2]PoLo S, Ketner G, Levis R, et al. Infectious RNA transcripts from full length dengue virus type 2 cDNA clones made in yeast. J Virol, 1997; 71(7):5366~5377

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    [4]Sumiyoshi H,Mori C,Fuke I,et al. Complete nucleotide sequence of Japanese encephalitis virus genomic RNA.Virol,1987;161:497~510

    [5]Nitayaphan S, Grant JA, Chang GJ, et al. Nucleotide sequence of the virulent SA- 14 strain of Japanese encephalitis virus and its attenuated vaccine derivative SA-14-142.Virol,1990;177:541~552

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    [7]Sumyoshi H,Hoke CH,Trent DW,et al. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro ligated cDNA templateds.J Virol,1992;66(9):5425~ 5431

    收稿:1999-02-23

    修回:1999-03-15, 百拇医药