人CD28分子突变体的构建和表达
作者：舒翠玲 郭燕翔 胡美茹 栾尧 沈倍奋
单位：军事医学科学院基础医学研究所，北京，100850
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990225
在肿瘤免疫中，发挥主要作用的是T细胞免疫。T细胞要完全活化，需要两种信号途径同时活化：第一种信号是经典的MHC/多肽-TCR/CD3途径，第二种信号是CD28共刺激途径。CD28共刺激途径的阻断，将导致T细胞克隆的耐受和凋亡。因此，CD28分子的研究成为免疫学、肿瘤学等领域关注的热点之一。大量研究结果表明，CD28分子的活化可促进T细胞增殖、多种淋巴因子，特别是IL-2的分泌量增高20～50倍，并能介导有效的CTL杀伤效应〔1〕。目前，国外研究主要集中于CD28分子在T细胞活化、信号转导机制，以及其结构和功能的关系等方面。本文以PCR方法构建了CD28突变体pUC18/281和pUC18/282，测序结果与设计相符。将两种突变体分别插入痘苗病毒载体pJSA1175的单一SmaI位点，获得表达载体pJSA1175/281和pJSA1175/282，重组痘苗病毒感染的TK-143细胞表达pUC18/281。CD28突变体的克隆和表达，为进一步研究CD28分子结构与功能的关系奠定了基础。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 限制性内切酶、PCR试剂、IPTG及BUdR等，均购自Gibco/BRL和Promega公司。pUC18/28质粒由本室构建〔2〕。痘苗病毒载体pJSA-1175质粒、天坛痘苗病毒株及TK-143细胞系，均由中国预防医学科学院病毒研究所阮力教授惠赠。
1.2 引物设计及合成 根据报道的人CD28分子基因序列〔3〕，我们设计并合成了一对引物。以pUC18/28质粒为模板，进行PCR扩增(反应体积为100μl)。变性、复性和延伸的温度分别为94℃ 1min，55℃ 1min和72℃ 1min，最后72℃延伸7min。两引物间扩出大小约200bp的DNA片段，即CD28分子的膜内区。
1.3 突变体基因的克隆 将PCR扩增产物用HpaI和Xba I双酶切，与载体pUC18/28Hpa I和Xba I酶切位点粘端连接，构建成pUC18/281。BsiWI和Hpa I双酶切pUC18/281，用Klenow酶补平，T4酶连接，构建成pUC18/282。
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1.4 酶切图谱的鉴定 用BsiW I+EcoR I,Sma I,pVU II酶切重组质粒pUC18/281；用Hpa I+Hind II I,Sma I,pVU II酶切重组质粒pUC18/282，经2%琼脂糖电泳后观察结果。
1.5 序列分析 用ABIPRISMTM310型核酸自动测序仪，进行突变体的序列分析。
1.6 表达质粒的构建 应用pVU II分别酶切pUC18/281和pUC18/282，透析袋法分别回收500 bp和400 bp的片段，将两片段分别插入pJSA1175质粒的单一Sma I酶切位点。经EcoR I酶切，挑选出正向连接的克隆，构建成重组表达质粒pJSA1175/281和pJSA1175/282。
1.7 痘苗病毒的重组及纯化 按照文献〔4〕进行。
1.8 重组病毒鉴定 采用免疫荧光法，按文献〔5〕进行。
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2 结果
2.1 PCR扩增人CD28分子的膜内段 经35个循环后，取10μlPCR产物电泳观察。结果显示，扩增出1条200bp的cDNA片段，与预计的结果相符。回收该片段用于连接。
2.2 CD28突变体的克隆及序列分析 将CD28突变体基因与pUC18质粒重组并转化后，钓取12个菌落用HindIII+XbaI酶切鉴定。pUC18/281切出约500bp的片段，pUC18/282切出约450bp的片段(图1)，与理论计算值大小一致。突变体测序结果与设计相符合，基因读框和连接位点没有变化。
图1 CD28分子突变体的筛选
1：pUC18 plasmid;2：pUC18/Hind III+Xba I;3：pUC18/281/Hind III+Xba I;
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4：pUC18/282/Hind III+Xba I;5：pBR322/HinfI marker;
2.3 重组质粒的酶切图谱鉴定 用多种内切酶酶切重组质粒pUC18/281和pUC18/282，所获结果与预计的相同(图2，3)。得到的CD28突变体与最初设计相符。
图2 pUC18/281的酶切鉴定
1:pUC18/281 PCR产物；2:pUC18/281/BsiW I+EcoR I;3:pUC18/281Sma I;
4:pUC18/281/pVU II;5:pBR322/Hinf I marker;
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图3 pUC18/282的酶切鉴定
1:pUC18/282的PCR产物；2:pUC18/282/SmaI;3:pUC18/282Hpa I+Hind III;
4:pUC18/282/pVU II;5:pBR322/Hinf I marker;
2.4 重组病毒的鉴定及表达产物的检测 用已纯化的CD28突变体1重组痘苗病毒感染TK-143细胞，48h后收集细胞做免疫荧光。结果表明，TK-143细胞膜上有人CD28突变体1分子表达，但呈弱阳性(图4)。
图4 间接免疫荧光法检测CD28突变体1重组痘苗病毒感染的TK-143细胞
3 讨论
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CD28分子广泛存在于CD3+T细胞上。目前，研究结果表明，CD28分子是一种共刺激信号分子，在免疫细胞活化和细胞信号转导等方面起着非常重要的作用。人CD28分子是由两条相对分子量(Mr)为44000的多肽链借二硫键组成的同源二聚体结构，为I型跨膜蛋白，Mr为99000。ORF编码220个氨基酸，胞膜外区由134个氨基酸组成，含5个N糖基化位点。穿膜区含有27个氨基酸，膜内区含有44个氨基酸。抗CD28 mAb与CD28分子结合可激活共刺激信号途径，导致T细胞完全活化。针对CD28分子及肿瘤抗原的双特异抗体，可明显介导免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。
为了研究CD28受体分子在信号转导中的结构和功能的关系，我们设计并构建了两种CD28突变体。突变体1将近膜端的两个半胱氨酸切除，突变体2将远膜端的3个半胱氨酸切除。将两种突变体分别在痘苗病毒系统中表达，结果只获得突变体1的重组痘苗病毒，突变体2转染两次均未成功，目前正在进行第3次转染实验。以突变体1重组痘苗病毒感染的TK-143细胞做活细胞免疫荧光，结果显示，CD28突变体1分子能够与抗CD28标准mAb结合，提示近膜端的两个半胱氨酸对CD28分子空间结构的影响不大，切除后并没有影响CD28分子与抗CD28 mAb的特异性结合，抗体识别表位仍保留。
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CD28分子是淋巴细胞充分活化必不可少的一种组分，它在肿瘤免疫和肿瘤治疗中发挥着重要的作用。CD28分子突变体的构建和表达，为进一步研究其结构和功能的关系，以及筛选有功能活性、识别不同功能表位的mAb奠定了基础。
作者简介：舒翠玲，女，33岁，助理研究员研，博士。北京市太平路27号，Tel.(010)66931327
参考文献
[1]Linsley PS, Ledbetter JA. The role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen. Annv Rev Immunol, 1993; 11:199～212
[2]马宏进，王建安，汲言山，等.人白细胞分化抗原CD28基因克隆及序列分析.中国免疫学杂志，1995；11(6)；324～327
, 百拇医药
[3] Aruffo A, Seed B. Molecular cloning of CD28 cDNA by a high efficient COS cell expression system. Pro Nalt Acad Sci USA, 1987; 84: 8573～ 8577
[4]高峰，刘柏松，伊瑶，等.用重组痘苗病毒作载体表达甲型肝炎病毒抗原.病毒学报，1989；5(4)：303～310
[5]Bai Y, Beverley PCL, Knowles RW, et al. Tow monoclonal anyibodies identifying a subset of human peripheral mononuclear cells with nature killer cell activity. Eur J Immunol, 1983; 13(7):521～ 527
收稿：1998-06-29
修回：1998-08-10, http://www.100md.com
单位：军事医学科学院基础医学研究所，北京，100850
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990225
在肿瘤免疫中，发挥主要作用的是T细胞免疫。T细胞要完全活化，需要两种信号途径同时活化：第一种信号是经典的MHC/多肽-TCR/CD3途径，第二种信号是CD28共刺激途径。CD28共刺激途径的阻断，将导致T细胞克隆的耐受和凋亡。因此，CD28分子的研究成为免疫学、肿瘤学等领域关注的热点之一。大量研究结果表明，CD28分子的活化可促进T细胞增殖、多种淋巴因子，特别是IL-2的分泌量增高20～50倍，并能介导有效的CTL杀伤效应〔1〕。目前，国外研究主要集中于CD28分子在T细胞活化、信号转导机制，以及其结构和功能的关系等方面。本文以PCR方法构建了CD28突变体pUC18/281和pUC18/282，测序结果与设计相符。将两种突变体分别插入痘苗病毒载体pJSA1175的单一SmaI位点，获得表达载体pJSA1175/281和pJSA1175/282，重组痘苗病毒感染的TK-143细胞表达pUC18/281。CD28突变体的克隆和表达，为进一步研究CD28分子结构与功能的关系奠定了基础。
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1 材料和方法
1.1 材料 限制性内切酶、PCR试剂、IPTG及BUdR等，均购自Gibco/BRL和Promega公司。pUC18/28质粒由本室构建〔2〕。痘苗病毒载体pJSA-1175质粒、天坛痘苗病毒株及TK-143细胞系，均由中国预防医学科学院病毒研究所阮力教授惠赠。
1.2 引物设计及合成 根据报道的人CD28分子基因序列〔3〕，我们设计并合成了一对引物。以pUC18/28质粒为模板，进行PCR扩增(反应体积为100μl)。变性、复性和延伸的温度分别为94℃ 1min，55℃ 1min和72℃ 1min，最后72℃延伸7min。两引物间扩出大小约200bp的DNA片段，即CD28分子的膜内区。
1.3 突变体基因的克隆 将PCR扩增产物用HpaI和Xba I双酶切，与载体pUC18/28Hpa I和Xba I酶切位点粘端连接，构建成pUC18/281。BsiWI和Hpa I双酶切pUC18/281，用Klenow酶补平，T4酶连接，构建成pUC18/282。
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1.4 酶切图谱的鉴定 用BsiW I+EcoR I,Sma I,pVU II酶切重组质粒pUC18/281；用Hpa I+Hind II I,Sma I,pVU II酶切重组质粒pUC18/282，经2%琼脂糖电泳后观察结果。
1.5 序列分析 用ABIPRISMTM310型核酸自动测序仪，进行突变体的序列分析。
1.6 表达质粒的构建 应用pVU II分别酶切pUC18/281和pUC18/282，透析袋法分别回收500 bp和400 bp的片段，将两片段分别插入pJSA1175质粒的单一Sma I酶切位点。经EcoR I酶切，挑选出正向连接的克隆，构建成重组表达质粒pJSA1175/281和pJSA1175/282。
1.7 痘苗病毒的重组及纯化 按照文献〔4〕进行。
1.8 重组病毒鉴定 采用免疫荧光法，按文献〔5〕进行。
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2 结果
2.1 PCR扩增人CD28分子的膜内段 经35个循环后，取10μlPCR产物电泳观察。结果显示，扩增出1条200bp的cDNA片段，与预计的结果相符。回收该片段用于连接。
2.2 CD28突变体的克隆及序列分析 将CD28突变体基因与pUC18质粒重组并转化后，钓取12个菌落用HindIII+XbaI酶切鉴定。pUC18/281切出约500bp的片段，pUC18/282切出约450bp的片段(图1)，与理论计算值大小一致。突变体测序结果与设计相符合，基因读框和连接位点没有变化。
图1 CD28分子突变体的筛选
1：pUC18 plasmid;2：pUC18/Hind III+Xba I;3：pUC18/281/Hind III+Xba I;
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4：pUC18/282/Hind III+Xba I;5：pBR322/HinfI marker;
2.3 重组质粒的酶切图谱鉴定 用多种内切酶酶切重组质粒pUC18/281和pUC18/282，所获结果与预计的相同(图2，3)。得到的CD28突变体与最初设计相符。
图2 pUC18/281的酶切鉴定
1:pUC18/281 PCR产物；2:pUC18/281/BsiW I+EcoR I;3:pUC18/281Sma I;
4:pUC18/281/pVU II;5:pBR322/Hinf I marker;
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图3 pUC18/282的酶切鉴定
1:pUC18/282的PCR产物；2:pUC18/282/SmaI;3:pUC18/282Hpa I+Hind III;
4:pUC18/282/pVU II;5:pBR322/Hinf I marker;
2.4 重组病毒的鉴定及表达产物的检测 用已纯化的CD28突变体1重组痘苗病毒感染TK-143细胞，48h后收集细胞做免疫荧光。结果表明，TK-143细胞膜上有人CD28突变体1分子表达，但呈弱阳性(图4)。
图4 间接免疫荧光法检测CD28突变体1重组痘苗病毒感染的TK-143细胞
3 讨论
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CD28分子广泛存在于CD3+T细胞上。目前，研究结果表明，CD28分子是一种共刺激信号分子，在免疫细胞活化和细胞信号转导等方面起着非常重要的作用。人CD28分子是由两条相对分子量(Mr)为44000的多肽链借二硫键组成的同源二聚体结构，为I型跨膜蛋白，Mr为99000。ORF编码220个氨基酸，胞膜外区由134个氨基酸组成，含5个N糖基化位点。穿膜区含有27个氨基酸，膜内区含有44个氨基酸。抗CD28 mAb与CD28分子结合可激活共刺激信号途径，导致T细胞完全活化。针对CD28分子及肿瘤抗原的双特异抗体，可明显介导免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。
为了研究CD28受体分子在信号转导中的结构和功能的关系，我们设计并构建了两种CD28突变体。突变体1将近膜端的两个半胱氨酸切除，突变体2将远膜端的3个半胱氨酸切除。将两种突变体分别在痘苗病毒系统中表达，结果只获得突变体1的重组痘苗病毒，突变体2转染两次均未成功，目前正在进行第3次转染实验。以突变体1重组痘苗病毒感染的TK-143细胞做活细胞免疫荧光，结果显示，CD28突变体1分子能够与抗CD28标准mAb结合，提示近膜端的两个半胱氨酸对CD28分子空间结构的影响不大，切除后并没有影响CD28分子与抗CD28 mAb的特异性结合，抗体识别表位仍保留。
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CD28分子是淋巴细胞充分活化必不可少的一种组分，它在肿瘤免疫和肿瘤治疗中发挥着重要的作用。CD28分子突变体的构建和表达，为进一步研究其结构和功能的关系，以及筛选有功能活性、识别不同功能表位的mAb奠定了基础。
作者简介：舒翠玲，女，33岁，助理研究员研，博士。北京市太平路27号，Tel.(010)66931327
参考文献
[1]Linsley PS, Ledbetter JA. The role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen. Annv Rev Immunol, 1993; 11:199～212
[2]马宏进，王建安，汲言山，等.人白细胞分化抗原CD28基因克隆及序列分析.中国免疫学杂志，1995；11(6)；324～327
, 百拇医药
[3] Aruffo A, Seed B. Molecular cloning of CD28 cDNA by a high efficient COS cell expression system. Pro Nalt Acad Sci USA, 1987; 84: 8573～ 8577
[4]高峰，刘柏松，伊瑶，等.用重组痘苗病毒作载体表达甲型肝炎病毒抗原.病毒学报，1989；5(4)：303～310
[5]Bai Y, Beverley PCL, Knowles RW, et al. Tow monoclonal anyibodies identifying a subset of human peripheral mononuclear cells with nature killer cell activity. Eur J Immunol, 1983; 13(7):521～ 527
收稿：1998-06-29
修回：1998-08-10, http://www.100md.com