抗谷胱甘肽还原酶单克隆抗体的研制及鉴定
作者：宫璀璀 韩玉春 胡延基 王大明 王文丽 杨书豪 李明 胡哲
单位：宫璀璀，韩玉春，胡延基，王大明，王文丽：解放军第153中心医院检验科，郑州，4500421；杨书豪，李明，胡哲：郑州博赛生物技术研究所
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990220谷胱甘肽还原酶(EC1.6.4.2,GR)为一种黄素酶，可催化氧化型谷胱甘肽转变成还原型谷胱甘肽(GSH)，从而提高细胞液中GSH的含量。GSH具有抵抗自由基氧化对机体损伤的作用。GSH的储量与创伤、肿瘤等的预后，以及人体衰老有关〔1〕。本研究采用淋巴细胞杂交瘤技术，研制了抗酵母菌GR的单克隆抗体(mAb)，并对其生物学特性进行了分析，从而为GR的纯化及其用免疫化学法测定提供了重要的试剂。
1 材料和方法
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1.1 材料 酵母菌谷胱甘肽还原酶，为美国Sigma公司产品。Balb/c小鼠，8周～12周龄，雌性，体重20g左右；Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系，均由郑州博赛生物技术研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 杂交瘤细胞系的建立 动物免疫、细胞融合及克隆化，以及mAb腹水的制备，均按实验室常规进行。
1.2.2 mAb的特性鉴定 ①效价测定：采用间接ELISA法。②Ig类及亚类的鉴定：采用免疫双扩散法。③表位分析：采用Friquet〔2〕报道的相加试验。④特异性分析：
交叉反应试验：分别以GR，IgG,IgA,BSA和GSHPx作为包被抗原，加入抗GR的mAb做间接ELISA法。
阻断试验：将10-2稀释的mAb与0.58g/L的酵母菌或等量的正常人血清混合后，置于37℃孵育30min再4℃过夜，离心(3000r/min，30min),取上清，加入到以GR抗原包被的酶联板中做ELISA，于波长450nm测定A值。
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1.2.3 人红细胞中GR的测定 采用免疫金银染色法〔3〕。取胶体金标记的抗GRmAbA11，A7，分别用TBS做2倍系列稀释(1∶10,1∶20……1∶100)制备新鲜的血涂片标本，并经甲醇固定5min。将上述胶体金标记的mAb滴加在玻片上，37℃孵育30min，洗涤5次，用银染色液复染10min，凉干，置光学显微镜下观察结果。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞的建立 经1次细胞融合后，获得2株能稳定分泌抗GRmAb的杂交瘤细胞，命名为A11和A7。
2.2 mAb的特性鉴定 ①效价：以2株杂交瘤细胞(A11和A7)制备的小鼠腹水中，mAb的效价分别为0.64×10-5和1.28×10-5。②Ig亚类：免疫双扩散试验的结果显示，2株mAb均为IgG1。③表位分析：相加试验的结果表明，mAbA11和B7可识别同一抗原表位。④特异性：交叉反应试验中，2株mAb均可同GR起反应，而同IgG，IgA,BSA和GSH-Px均无反应性。抗原阻断试验中，2株mAb经用GR和正常人血清吸收后，A值明显下降，表明所获2株mAb都是针对GR的特异性抗体。
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2.3 人红细胞中GR的表达 免疫金银染色法检测表明，在滴加2×10-1～10-2胶体金标记的mAb的标本中，镜下可见红细胞内具有黑褐色的金属银颗粒，而在对照标本中则呈阴性(图1，2)。
图1 免疫金银染色法检测人红细胞中GR的表达(加抗GRmAb)(×1000)
图2 免疫金银染色法检测人红细胞中GR的表达(未加抗GRmAb)(×1000)
3 讨论
GR的相对分子质量(Mr)为100000，是由两条Mr相同的肽链组成的二聚体。GR可从人红细胞中提取〔4〕，但方法繁锁，产量过低，不易纯化。本文中我们采用酵母菌GR为免疫原制备抗GR的mAb，通过1次融合，即获得2株能够稳定分泌抗GRmAb的杂交瘤细胞，经体外连续培养及反复冻存、复苏，其分泌特异性mAb的能力不变。除酵母菌GR对mAb有明显的阻断作用外，正常人血清对mAb也有阻断效应，说明酵母菌GR与人的GR具有同源性。特别是应用胶体金标记的mAb证实，其与人红细胞内的GR可起反应，表明应用酵母菌GR为免疫原研制的抗GRmAb可用于人GR的检测，也可进行细胞中GR表达的定位研究。
, 百拇医药
作者简介：宫璀璀，女，41岁，主管技师。郑州市郑上路，Tel.(0371)7811800-2096
参考文献
[1]Stein HJ, Hinder RA, Oosthvizen MMJ. Gastric mucosal injury caused by hemorrhagic shock and reperfusion: protective role of the antioxidant glutathione. Surgery, 1990; 108:467～474
[2]Friguet B, Ojavadi-ohaniance L, Pages J, et al. A convenient enzyme-linked immunosorbent assay for testing whether monoclonal antibodies recognize the same antigenic site. Application to hybridomas specific for the β2-subunit of E.coli tryptophan synthase. J Immunol Meth, 1983; 60(3):351～358
[3]李影林主编.中华医学检验全书.北京：第1版.人民卫生出版社，1996：2128～2129
[4]Daricl J, Michael A. Glutathion reductase from human erythrocytes. Eur J Biochem, 1976; 67:231～238
收稿：1998-09-24
修回：1998-10-30, http://www.100md.com
单位：宫璀璀，韩玉春，胡延基，王大明，王文丽：解放军第153中心医院检验科，郑州，4500421；杨书豪，李明，胡哲：郑州博赛生物技术研究所
关键词：
细胞与分子免疫学杂志990220谷胱甘肽还原酶(EC1.6.4.2,GR)为一种黄素酶，可催化氧化型谷胱甘肽转变成还原型谷胱甘肽(GSH)，从而提高细胞液中GSH的含量。GSH具有抵抗自由基氧化对机体损伤的作用。GSH的储量与创伤、肿瘤等的预后，以及人体衰老有关〔1〕。本研究采用淋巴细胞杂交瘤技术，研制了抗酵母菌GR的单克隆抗体(mAb)，并对其生物学特性进行了分析，从而为GR的纯化及其用免疫化学法测定提供了重要的试剂。
1 材料和方法
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1.1 材料 酵母菌谷胱甘肽还原酶，为美国Sigma公司产品。Balb/c小鼠，8周～12周龄，雌性，体重20g左右；Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系，均由郑州博赛生物技术研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 杂交瘤细胞系的建立 动物免疫、细胞融合及克隆化，以及mAb腹水的制备，均按实验室常规进行。
1.2.2 mAb的特性鉴定 ①效价测定：采用间接ELISA法。②Ig类及亚类的鉴定：采用免疫双扩散法。③表位分析：采用Friquet〔2〕报道的相加试验。④特异性分析：
交叉反应试验：分别以GR，IgG,IgA,BSA和GSHPx作为包被抗原，加入抗GR的mAb做间接ELISA法。阻断试验：将10-2稀释的mAb与0.58g/L的酵母菌或等量的正常人血清混合后，置于37℃孵育30min再4℃过夜，离心(3000r/min，30min),取上清，加入到以GR抗原包被的酶联板中做ELISA，于波长450nm测定A值。, http://www.100md.com
1.2.3 人红细胞中GR的测定 采用免疫金银染色法〔3〕。取胶体金标记的抗GRmAbA11，A7，分别用TBS做2倍系列稀释(1∶10,1∶20……1∶100)制备新鲜的血涂片标本，并经甲醇固定5min。将上述胶体金标记的mAb滴加在玻片上，37℃孵育30min，洗涤5次，用银染色液复染10min，凉干，置光学显微镜下观察结果。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞的建立 经1次细胞融合后，获得2株能稳定分泌抗GRmAb的杂交瘤细胞，命名为A11和A7。
2.2 mAb的特性鉴定 ①效价：以2株杂交瘤细胞(A11和A7)制备的小鼠腹水中，mAb的效价分别为0.64×10-5和1.28×10-5。②Ig亚类：免疫双扩散试验的结果显示，2株mAb均为IgG1。③表位分析：相加试验的结果表明，mAbA11和B7可识别同一抗原表位。④特异性：
交叉反应试验中，2株mAb均可同GR起反应，而同IgG，IgA,BSA和GSH-Px均无反应性。抗原阻断试验中，2株mAb经用GR和正常人血清吸收后，A值明显下降，表明所获2株mAb都是针对GR的特异性抗体。, http://www.100md.com
2.3 人红细胞中GR的表达 免疫金银染色法检测表明，在滴加2×10-1～10-2胶体金标记的mAb的标本中，镜下可见红细胞内具有黑褐色的金属银颗粒，而在对照标本中则呈阴性(图1，2)。
图1 免疫金银染色法检测人红细胞中GR的表达(加抗GRmAb)(×1000)
图2 免疫金银染色法检测人红细胞中GR的表达(未加抗GRmAb)(×1000)
3 讨论
GR的相对分子质量(Mr)为100000，是由两条Mr相同的肽链组成的二聚体。GR可从人红细胞中提取〔4〕，但方法繁锁，产量过低，不易纯化。本文中我们采用酵母菌GR为免疫原制备抗GR的mAb，通过1次融合，即获得2株能够稳定分泌抗GRmAb的杂交瘤细胞，经体外连续培养及反复冻存、复苏，其分泌特异性mAb的能力不变。除酵母菌GR对mAb有明显的阻断作用外，正常人血清对mAb也有阻断效应，说明酵母菌GR与人的GR具有同源性。特别是应用胶体金标记的mAb证实，其与人红细胞内的GR可起反应，表明应用酵母菌GR为免疫原研制的抗GRmAb可用于人GR的检测，也可进行细胞中GR表达的定位研究。
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作者简介：宫璀璀，女，41岁，主管技师。郑州市郑上路，Tel.(0371)7811800-2096
参考文献
[1]Stein HJ, Hinder RA, Oosthvizen MMJ. Gastric mucosal injury caused by hemorrhagic shock and reperfusion: protective role of the antioxidant glutathione. Surgery, 1990; 108:467～474
[2]Friguet B, Ojavadi-ohaniance L, Pages J, et al. A convenient enzyme-linked immunosorbent assay for testing whether monoclonal antibodies recognize the same antigenic site. Application to hybridomas specific for the β2-subunit of E.coli tryptophan synthase. J Immunol Meth, 1983; 60(3):351～358
[3]李影林主编.中华医学检验全书.北京：第1版.人民卫生出版社，1996：2128～2129
[4]Daricl J, Michael A. Glutathion reductase from human erythrocytes. Eur J Biochem, 1976; 67:231～238
收稿：1998-09-24
修回：1998-10-30, http://www.100md.com