重组HIV-1Gag/Env融合抗原在大肠杆菌中的表达及免疫学分析*
作者：韩保光 孟莉 宋晓国 陈坤 张贺秋 马贤凯
单位：军事医学科学院基础医学研究所，北京，100850
关键词：HIV-1gag；gp41；gp120；表达
细胞与分子免疫学杂志990202摘 要：在大肠杆菌中，利用pDOG载体来源的表达载体pDGagEnv，高效表达了相对分子质量(Mr)为46500(p46)的重组HIV-1Gag/Env融合抗原(Gag209～437+Env474～518+Env548～675)。表达产物同时还包括：Mr～28500，Mr～22000与Mr～190003种(p28,p22和p19)蛋白。此4种表达产物均存在于包涵体中，不能被8mol/L尿素溶解。Western印迹分析表明，4种重组蛋白均能与HIV-1阳性血清发生特异反应；其中p46与p28蛋白能与抗HIV-1p24反应，而p22与p19蛋白则不与其起反应。其中p19蛋白对应于Env482～518+Env545～675,p22蛋白可能是从Gag/Env表达质粒的gag基因内部的甲硫氨酸(ATG423)起始的翻译产物。将包涵体充分洗涤后，利用制备电泳方法纯化了p46，p22/p19及p19蛋白。将后两种纯化蛋白质以2mg/L的浓度包被ELISA板，检测了国家卫生部药品生物制品检定所提供的HIV-1/HIV-2质检血清。结果可检出其中包含的所有18份HIV-1阳性血清，而与20份阴性血清无交叉反应，表明重组p22/p19及p19蛋白均为抗HIV-1抗体筛选的良好抗原。
, 百拇医药
中国图书资料分类号：Q78
Expression of HIV-1 Gag/Env chimera protein in E.Coli and
its immunological analysis*
Han Baoguang, Meng Li, Song Xiaoguo, Chen Kun, Zhang Heqiu, Ma Xiankai, Ling Shigan
(Institute of Basic Medical Sciences, Beijing 100850)
Keywords：HIV-1 gag gp41 gp120 expression
Abstract：A recombinant HIV-1 Gag/Env chimera protein of Mr～46 500 (p46)(Gag209～434+Env474～518+Env545～675) wax over-expressed in E.coli using a expression vector pDGagEnv derived from pDOG vector.In addition,proteins of M-28 500(P28), Mr 22,000(p22)and Mr ～19 000(p19)were produced in the same induced cells. The recombinant products existed in inclusion bodies and could not be dissolved by 8 mol/L urea.Western blot analysis showed that all of the four proteins reacted with an anti-HIV-1positive serum, but only p46 and p28 reacted with an anti-HIV-1p24 monoclonal antibody. Recombinant p19 protein corresponds to Env482～518+Env548～675 while p22 probably arises from internal initiation at a methionine codon (ATG423)within the gag sequence of the expression plasmid pDGagEnv.After sufficient washing og the inclusion bodies,recombinant p46,p19 and p22/p19 could be purified to near homogeneity.The purified products of p19 and p22/p19 were coated to ELISA plates at a concentration of 2 mg/L. The nesults showed that both of the purified products reacted with all the eighteen HIV-1 positive sera but none of the twenty normal sera.This suggests that the recombinant p22 and p19 protein might be useful for detecting HIV-1 antibodies in blood samples.
, 百拇医药
对HIV-1与HIV-2感染的血清学研究表明，多数被感染者的血清中存在着针对HIV编码蛋白质的抗体，其中主要是针对gag,pol与env基因编码蛋白的抗体〔1～4〕。gag基因编码Mr～55000的前体蛋白，在病毒成熟过程中被pol编码的蛋白酶加工，分别产生基质蛋白p17、核壳蛋白p24及核酸结合蛋白p15。在HIV感染个体的血清中，抗p24抗体是最早出现的抗体之一，检测抗p24抗体有利于HIV感染的早期诊断。在临床上，对HIV感染患者的抗p24抗体水平检测，还可以作为病程发展的重要指标之一〔5〕。env基因表达一个前体多蛋白，在被糖基化后，故对该前体蛋白被酶解，产生外膜蛋白(EGP)gp120与跨膜蛋白(TMP)gp41。抗膜蛋白的抗体几乎出现在所有感染者的血清中，并与感染病人的临床症状无关，该抗体的检测是判断HIV感染的关键指标。
利用基因重组的方法，在大肠杆菌中高效表达HIV抗原，可以较低的成本大量提供高纯度的抗原用于抗HIV抗体的检测。我们以前分别报道了HIV-1Gag与HIV-1膜蛋白在大肠杆菌中的表达〔6～8〕。本文在此基础之上，构建了HIV-1Gag/Env融合蛋白在大肠杆菌中的表达质粒，获得了融合蛋白的高效表达。并以此为抗原，应用ELISA方法对HIV-1阳性血清进行了检测。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 菌株与质粒 大肠杆菌DH5α，RRI(pGIts857)为本室保存。质粒pDOG-c,pUCGP01按文献〔6〕制备。质粒pBH10R3含有HIV-1BH1。标全长编码序列〔9〕，由美国S.Rasheed博士赠送。
1.2 酶和试剂 限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA片段回收柱和琼脂糖，均购于Promega公司。HIV-1阳性血清为本室保存。标准血清Panel9802由国家卫生部药品生物制品检定所提供，包括：20份阴性血清、18份HIV-1阳性血清与两份HIV-2阳性血清。
1.3 DNA操作 参照文献〔10〕的方法进行。
1.4 Gag/Env融合蛋白的表达与制备电泳纯化 以表达质粒pDGagEnv转化RRI(pCIts857)。挑取单个菌落，接种于50mlLB培养基(含有100mg/L氨苄青霉素与20mg/L卡那霉素)中，30℃过夜生长。次日以1∶10接种于500ml同样的培养基中，30℃继续生长到A600=0.6～0.8，将温度调到42℃，继续培养5h后收菌。菌体重悬于40ml溶液A(10 mmol/L Tris-HCI,pH8.0)中，加入溶菌酶50mg裂解菌体，10min后，超声破碎，12000×g离心20min，弃上清。沉淀先后用溶液A、溶液B(10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0，1mol/LNaCl)和溶液C(10mmol/LTrisHCl,pH8.0，8mol/L尿素)充分洗涤后，将沉淀蛋白悬于12ml蒸馏水中，加入3ml5×SDS凝胶加样缓冲液(60 mmol/L Tris-HCl,pH6.8，25%甘油，2%SDS，14.4mmol/L巯基乙醇，0.1%溴酚蓝)，煮沸5min后，样品分两次进行制备电泳纯化。制备电泳装置为Bio-Rad公司的Medel-491PrepCell。两次分别使用10%与15%的SDS聚丙烯酰氨凝胶。样品在25mA下电泳，分管收集洗脱样品，用SDS-PAGE鉴定重组蛋白所在的峰。蛋白浓度由A260与A280处的光吸收值来确定。
, 百拇医药
1.5 纯化的重组蛋白与HIV-1/HIV-2血清的反应性 以纯化抗原(1 mg/L)包被96孔ELISA板，4℃过夜。以含1%BSA的PBST(含0.05%Tween的PBS)于4℃封闭4h～6h。标准血清以样品稀释液(100 mmol/L Na3PO3,pH7.5,10%山羊血清，0.05% Tween 20)作1∶10稀释，每孔加入100μl，37℃反应30min。以PBST充分洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的小鼠抗人IgG(1/25000)。37℃温育15min，充分洗涤，加OPD，37℃显色10min，测定波长为492nm的光吸收值。
1.6 Western印迹 诱导菌体裂解液与纯化蛋白质经15%SDSPAGE分离后，用干转法转印到硝酸纤维素滤膜上，加封闭液(5%脱脂奶粉，150mmol/LNaCl,50mmol/LTris-HCl,pH7.5,0.05%Tween)室温孵育2h。分别使用抗HIV-1阳性血清以及抗p24mAb与转印蛋白起反应。HIV-1用样品稀释液(150 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5,0.05%Tween20)作1∶100稀释。将滤膜与稀释血清室温孵育2h。抗HIV-1抗体用HRP标记的抗人IgG小鼠mAb与显色底物(50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5,0.6 mg/ml联苯二胺，1 ml/L 30%H2O2)检测。抗HIV-1 p24mAb 2G10〔12〕用样品稀释液作1∶500稀释，使用HRP标记的羊抗小鼠IgG多抗作为第二抗体，用同样方法显色。
, 百拇医药
2 结果
2.1 Gag/Env融合蛋白表达质粒的构建 使用的4条PCR引物的序列分别为：
P1：5′CGG AAT TCA TAA ACA GAT AGA TAG CA3′
P2：5′GGG GTA CCT GAT CCT GAT CCT CTT TTT TCT CTC TGC AC3′
P3：5′GGG GTA CCC AGG CCA GAC AAT TAT TG3′
P4：5′CGG GAT CCT ACT TGC CCA TTT ATC T3′
以含有全长HIV-1编码基因的质粒pBH10R3〔9〕为模板，利用P1与P2引物做PCR扩增编码Env351～518的DNA序列。P1与P2引物分别带有EcoRI与KpnI的酶切位点，所获PCR产物用上述两酶酶切。利用P3与P4引物扩增编码Env548～675的DNA序列。P3与P4引物分别带有Kpn I与BamH I，所获PCR产物用这两种限制性内切酶切割。将以上两种PCR产物连接，再将连接产物克隆到pUC18质粒的EcoRI与BamH I位点之间，构建质粒pUCEnv。该质粒用Bg1 II与BamHI酶切，回收约510bp的片段。pUCGP01质粒〔6〕以同样的方法酶切，回收大片段，与上述510bp的片段连接构建质粒pUCGPEnv。该质粒用PstI酶切，回收约1.2kb的片段，克隆到表达载体pDOG-c的相应位点上，构建pDGagEnv表达质粒(图1、2，见第Ⅲ页)，表达HIV-1Gag209～437与Env473～518+Env545～675的融合蛋白，融合蛋白的N端还带有16个氨基酸残基的载体序列，预期表达Mr～46500的重组蛋白(p46),其序列见图3。
, 百拇医药
图1 表达质粒pDGagEnv的构建过程
Fig1 Construction of expression plasmid pDGagEnv
图2 融合基因接点(Bg1 II位点)附近的Gag/Env基因及其码蛋白的序列
Fig2 Sequences of the Gag/Env fusion gene and its expres sed protein near the Bg1 II site
图3 重组抗原Gag/Env(p46),p22及p19的氨基酸组成
, 百拇医药
Fig3 The amino acidc omposition of the recombinant Gag/Env(p46),p22 and p19
Coding of p22 starts from the ATG423 of gag gene and p19 from ATG482 of the env gene
2.2 Gag/Env融合蛋白的表达与制备电泳纯化 表达质粒pDGagEnv是表达载体pDOG来源的表达载体。该载体曾用于HIV-1gag的高效表达〔6，7〕。载体用PL启动子控制外源基因的表达，PL启动子受控于pDOG载体编码的温度敏感的阻抑物CIts857，可以利用诸如大肠杆菌HB101和DH5α等作为宿主菌表达外源蛋白。如果将表达质粒pDGagEnv转化大肠杆菌RRI(pClts857)，由于该宿主菌本身还带有Clts857表达质粒pClts857，因而可使Clts857的表达量进一步提高，有利于降低在低温下PL启动子的转录，增加系统的稳定性。
, http://www.100md.com
将表达质粒pDGagEnv转化大肠杆菌RRI(pClts857)，挑取阳性克隆，接种于LB培养基中于30℃培养到对数中期，将温度调整到42℃，继续诱导5h。收获细菌，提取包涵体。将诱导前、后的全菌体及包涵体一起进行SDSPAGE(图4A，见第Ⅲ页)。结果表明，与诱导前相比较，在Mr约为46 500，28 500，22 000和19 000的位置上，有特异表达带(列2)(以下称为重组蛋白p46,p28,p22,p19)，表达产物存在于包涵体中(列3)。包涵体蛋白不溶解于8mol/L尿素中，故用8mol/L尿素充分洗涤包涵体，可去除大部分杂质蛋白。用10%SDSPAGE制备电泳纯化可得到p46蛋白(列4)；用15%SDSPAGE制备电泳可得到单独的p19蛋白(列6)及p22/p19混合的纯化蛋白(列5)。
图4 Gag/Env融合抗原的表达、纯化及Western印迹分析
, 百拇医药
Fig4 Expression and purification of Gag/Env chimera protein analyzed by SDS-PAGE(A) and Western blot with an anti-HIV-1 anti body(B)
2.3 表达产物的Western印迹分析 利用Western印迹检测了表达蛋白的抗原性。将诱导菌体裂解液、包涵体蛋白及纯化蛋白用SDS-PAGE分离后，转印到硝酸纤维素滤膜上，与1份HIV-1阳性血清起反应。所获结果与对照菌相比，诱导全菌体与包涵体在Mr约为46500，28500，22000和19000的位置上，存在特异反应带(图4B，见第Ⅲ页，列2、3)，表明这4条带均为良好的HIV-1抗原。纯化的p46蛋白、p19蛋白及p22/p19蛋白，均可与该份血清起反应(图4B，见第Ⅲ页，列4～6)。
同时使用1株抗HIV-1p24mAb2G10〔12〕对重组蛋白进行了免疫印迹反应。mAb2G10是利用重组HIV-1Gga前体蛋白片段PG1(Gag121～437)免疫小鼠而获得的，可特异识别Gag209-363。结果表明，该mAb与p46及p28均可起反应，而与p22及p19不起反应(结果未显示)，p46及p29反应带在诱导前的菌体蛋白中不存在。在诱导菌体及包涵体蛋白中，还存在Mr介于46500与28000间能与mAb2G10发生反应的带,但表达量低,且不能用抗HIV-1血清检出。
, http://www.100md.com
结合以上结果，由于p46蛋白带与预期的Gag/Env融合蛋白的Mr一致，且同时与抗p24及抗HIV-1的抗体起反应，表明p46蛋白为完整的Gag/Env融合蛋白，其它3条蛋白带可能是Gag/Env融合蛋白的降解产物，也可能是Gag/Env基因内部翻译产物或翻译提前终止产物。由于p22及p19蛋白不能与抗Gag209～363的mAb起反应，表明两个重组蛋白主要包括了Env区域。大肠杆菌在翻译HIV-1Gag及Env蛋白时，会发生翻译过程的提前终止，使得gag与env基因内部存在的大肠杆菌翻译起始序列得以暴露，产生Mr小的表达产物。仔细研究表达质粒pDGagEnv包含的Gag/Env基因序列(图2，见第Ⅲ页)，发现在融合基因BglII位点下游10bp位置附近，存在大肠杆菌SD一致序列及一个翻译起始密码子ATG(AGGAGGAGATATG)。该ATG编码HIV-1482位的甲硫氨酸(图2，见第Ⅲ页)，已证明该起始序列是大肠杆菌识别的高效翻译起始序列，已被用于重组HIV-1/HIV2嵌合膜蛋白的高效表达〔11〕。在本文构建的表达质粒中，该序列预期指导翻译对应于HIV-1Env482～518+548～675Mr为19000的HIV-1膜蛋白(即p19蛋白)。在Bg1II位点上游40bp位置附近，存在另一个大肠杆菌翻译起始序列(AAGAAGGACACCAAATG),p22蛋白则可能是这一序列指导翻译的产物,因而对应于序列Gag423～437+Env474～518+Env548～675。对p28蛋白尚未进一步进行鉴定。
, 百拇医药
2.4 纯化蛋白与HIV-1/HIV-2血清的反应 我们应用ELISA法，初步研究了重组p19及p22蛋白与国家第2代HIV-1/HIV-2标准血清的反应性。重组p19及p22蛋白包括了HIV-1gp120及gp41的主要抗原表位〔8〕，且不融合任何载体来源序列，应具有良好的抗原性与特异性。标准血清9802包括20份阴性血清与18份HIV-1阳性血清。实验结果(表1)表明,p22/p19，p19纯化蛋白与18份HIV-1阳性血清的反应均值分别为1.038及0.807；与20份阴性血清的反应均值分别为0.066与0.051,P/N均值比分别为15.7与15.8。如以阴性血清A490均值的3倍作为临界值，则两种抗原的临界值分别为0.198及0.153，测定的灵敏度与特异性均达到了100%，表明以上两种抗原均可较好地用来检测抗HIV-1抗体。
表1 重组抗原与国家HIV-1/HIV2质检血清(No.9802)的反应结果
Tab 1 Reactivities of recombinant proteins with National HIV-1/HIV-2 panel sera(No.9802) NS No .
, http://www.100md.com
A492
PS No .
A492
P19
P19/P22
P19
P19/P22
N01
0.037
0.035
P01
1.250
1.132
, 百拇医药
N02
0.063
0.043
P02
1.160
1.032
N03
0.091
0.092
P03
1.095
0.750
N04
, 百拇医药
0.082
0.090
P04
1.264
0.961
N05
0.088
0.080
P05
1.169
1.002
N06
0.070
, 百拇医药
0.058
P06
0.743
0.588
N07
0.042
0.032
P07
0.397
0.326
N08
0.058
0.044
, 百拇医药
P08
1.133
0.892
N09
0.040
0.029
P09
0.312
0.217
N10
0.022
0.013
P10
, 百拇医药
0.714
0.495
N11
0.073
0.015
P11
0.924
0.725
N12
0.051
0.034
P12
1.135
, http://www.100md.com
0.923
N13
0.152
0.103
P13
0.333
0.388
N14
0.063
0.046
P14
1.950
1.698
, 百拇医药
N15
0.017
0.013
P15
1.610
1.301
N16
0.078
0.065
P16
0.613
0.493
N17
, 百拇医药
0.087
0.062
P17
1.338
1.141
N18
0.035
0.018
P18
0.588
0.471
N19
0.104
, 百拇医药
0.112
N20
0.069
0.044
Average
0.066
0.051
1.038
0.807
Notes: NS:Negative sera; PS:Positive sera; P/N=15.7 for p19 ; 15.8 for p22
3 讨论
, http://www.100md.com
近十年来，我们实验室一直从事HIV抗原在大肠杆菌中的表达与纯化研究。与合成多肽抗原相比，重组抗原的优点在于成本相对低且抗原表位的覆盖面大。我们曾经报道了HIV-1 Gag前体蛋白片段PG1(Gag 121～437)与PG2(Gag 209～437)在大肠杆菌中的表达〔7〕。其中PG2蛋白的表达量可占全菌体蛋白的20%，且不降解；纯化的PG2重组蛋白能与HIV-1阳性血清发生特异反应。我们还报道了HIV-1多表位膜抗原(Env482-518+548～675)在大肠杆菌中的表达，表达蛋白MEre除包括HIV-1膜蛋白序列外，还在N端融合了载体编码的284个氨基酸残基〔8〕。而载体序列可能会掩盖HIV-1Env的表位，并带来非特异性反应。为此，我们构建了HIV-1Gag/Env融合蛋白表达载体，以期获得HIV-1GagEnv融合蛋白(Gag209～434+Env474～518+Env545～675)的表达。实验结果表明，带有表达质粒pDGagEnv的大肠杆菌RRI(pClts857)，可表达p46，p28，p22及p194种Mr不同的重组蛋白。免疫印迹分析表明，p46蛋白可与抗HIV-1p24mAb及HIV-1阳性血清起反应，表明对应于完整的HIV-1Gag/Env融合蛋白。该蛋白除了包括HIV-1Gag与Env序列外，在N端只融合了载体来源序列的16个氨基酸残基，对重组抗原的抗原性影响较小，并减少了融合大片段序列可能带来的非特异性反应。由于gag基因编码蛋白在HIV-1不同株之间高度保守，而且与HIV-2的gag基因也具有较高的同源性，故使用HIV-1Gag重组抗原，可检测出不同株HIV-1与HIV-2感染个体血清中的抗体。我们重组的融合蛋白同时包括了HIV-1Gag，gp120及gp41中高度保守的重要抗原表位，预期可提高检测抗不同株HIV-1抗体的能力。我们将进一步研究该融合蛋白与HIV-1血清的反应性。
, 百拇医药
与预期结果不同的是，除p46蛋白外，p28，p22及p19的表达带也具有较高的表达量，尤其以p19蛋白的表达量最高。根据Han等〔11〕报道，该表达蛋白对应于Env482～518+548～675。该蛋白的翻译是由对应于Env482位的甲硫氨酸起始的，因而不包含任何载体来源的序列，在抗原性及反应的特异性方面，均优于文献报道的MEre蛋白。免疫印迹结果表明，p22蛋白主要包括膜蛋白序列，可能是由表达质粒gag基因内部的翻译起始序列指导翻译的。
由于表达蛋白存在于包涵体中，且不能用8mol/L尿素溶解，故表达蛋白不能用常规的方法纯化。我们利用制备电泳的方法，分别纯化了p46，p19及p19/p22重组蛋白。用后两种纯化蛋白检测由国家卫生部药品生物制品检定所提供的HIV-1/HIV-2ELISA试剂盒质检血清，特异性与灵敏度均达到100%，是检测抗HIV-1抗体的良好抗原。总之，我们的研究提供了大量生产3种重组HIV-1抗原的方法，为高质量的抗HIV1抗体ELISA检测试剂盒的研制打下了良好的基础。
, http://www.100md.com
*“九五”国家医学科技攻关资助项目，No.96-906-03-16
作者简介：韩保光，男，31岁，助理研究员，博士，凌世淦：通讯作者。北京市太平路27号，Tel.(010)66932308
参考文献
[1]Steimer KS,Higgins KW,Powers MA,et al.Recombinant polypeptide from endonuclease region of the acquired immunodeficiency syndrome retrovirus polymerase(pol)gene detects serum antibodies in most infected individuals.J Virol,1985;58:9～6
[2]Barin F, McLane MF, Allan JS, et al. Virus envelope protein of HTLV III represents major target antigen for antibodies in AIDS patients. Science, 1985; 228:1094～1096
, http://www.100md.com
[3]Bjoerling E, Boucher CAB, Samuelsson A, et al. Two highly antigenic sites in the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. J Clin Microbiol, 1993; 31: 588～592
[4]Kanner SB, Cheng-Mayer C, Geffin RB, et al. Human retroviral env and gag polypeptide: serological assay to measure infection. J Immunol, 1986; 137:674～678
[5]Moore JP，Ho DD. Antibodies to discontinuous or conformationally-sensitive epitopes on the gp120 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 are highly prevalent in sera of infected humans. J Virol, 1993; 67:863～875
, 百拇医药
[6]Forster S M, Osborne L M, Cheingsong Popov R, et al. Decline of anti-p24 antibody proceeds antigenemia as correlate of prognosis in HIV-1 infection, AIDS. 1988; 1:235～240
[7]韩保光，孟莉，马贤凯,等.人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)核心蛋白(p24)在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定.病毒学报，1997；13：110～117
[8]韩保光，孟莉，马贤凯,等.HIV-1gag前体蛋白片段在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定.军事医学科学院院刊，1997；21：84～89
[9]韩保光，孟莉，马贤凯,等.HIV-1多表位膜蛋白在E.coli中的表达、纯化及在血清检测中的应用.军事医学科学院院刊，1998；22：8～12
, http://www.100md.com
[10] Ratner L, Haseltine W, Patarca R，et al. Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III. Nature, 1985; 313:277～284
[11]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory mannual 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 1.33～48
[12]Han B G, Meng L, Ma XK, et al. The use of a chimera HIV-1/HIV-2 envelope protein for immunodiagnosis of HIV infection: its expression and purification in E. coli by use of a translation site within HIV-1 env gene. Biochem Mol Biol Int, 1998; 46(3):607～617
[13]刘荷中，凌世淦，董邦权，等.分泌抗HIVp24单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与初步鉴定.军事医学科学院院刊，1997；21：17～20
收稿：1998-08-12
修回：1999-01-08, 百拇医药
单位：军事医学科学院基础医学研究所，北京，100850
关键词：HIV-1gag；gp41；gp120；表达
细胞与分子免疫学杂志990202摘 要：在大肠杆菌中，利用pDOG载体来源的表达载体pDGagEnv，高效表达了相对分子质量(Mr)为46500(p46)的重组HIV-1Gag/Env融合抗原(Gag209～437+Env474～518+Env548～675)。表达产物同时还包括：Mr～28500，Mr～22000与Mr～190003种(p28,p22和p19)蛋白。此4种表达产物均存在于包涵体中，不能被8mol/L尿素溶解。Western印迹分析表明，4种重组蛋白均能与HIV-1阳性血清发生特异反应；其中p46与p28蛋白能与抗HIV-1p24反应，而p22与p19蛋白则不与其起反应。其中p19蛋白对应于Env482～518+Env545～675,p22蛋白可能是从Gag/Env表达质粒的gag基因内部的甲硫氨酸(ATG423)起始的翻译产物。将包涵体充分洗涤后，利用制备电泳方法纯化了p46，p22/p19及p19蛋白。将后两种纯化蛋白质以2mg/L的浓度包被ELISA板，检测了国家卫生部药品生物制品检定所提供的HIV-1/HIV-2质检血清。结果可检出其中包含的所有18份HIV-1阳性血清，而与20份阴性血清无交叉反应，表明重组p22/p19及p19蛋白均为抗HIV-1抗体筛选的良好抗原。
, 百拇医药
中国图书资料分类号：Q78
Expression of HIV-1 Gag/Env chimera protein in E.Coli and
its immunological analysis*
Han Baoguang, Meng Li, Song Xiaoguo, Chen Kun, Zhang Heqiu, Ma Xiankai, Ling Shigan
(Institute of Basic Medical Sciences, Beijing 100850)
Keywords：HIV-1 gag gp41 gp120 expression
Abstract：A recombinant HIV-1 Gag/Env chimera protein of Mr～46 500 (p46)(Gag209～434+Env474～518+Env545～675) wax over-expressed in E.coli using a expression vector pDGagEnv derived from pDOG vector.In addition,proteins of M-28 500(P28), Mr 22,000(p22)and Mr ～19 000(p19)were produced in the same induced cells. The recombinant products existed in inclusion bodies and could not be dissolved by 8 mol/L urea.Western blot analysis showed that all of the four proteins reacted with an anti-HIV-1positive serum, but only p46 and p28 reacted with an anti-HIV-1p24 monoclonal antibody. Recombinant p19 protein corresponds to Env482～518+Env548～675 while p22 probably arises from internal initiation at a methionine codon (ATG423)within the gag sequence of the expression plasmid pDGagEnv.After sufficient washing og the inclusion bodies,recombinant p46,p19 and p22/p19 could be purified to near homogeneity.The purified products of p19 and p22/p19 were coated to ELISA plates at a concentration of 2 mg/L. The nesults showed that both of the purified products reacted with all the eighteen HIV-1 positive sera but none of the twenty normal sera.This suggests that the recombinant p22 and p19 protein might be useful for detecting HIV-1 antibodies in blood samples.
, 百拇医药
对HIV-1与HIV-2感染的血清学研究表明，多数被感染者的血清中存在着针对HIV编码蛋白质的抗体，其中主要是针对gag,pol与env基因编码蛋白的抗体〔1～4〕。gag基因编码Mr～55000的前体蛋白，在病毒成熟过程中被pol编码的蛋白酶加工，分别产生基质蛋白p17、核壳蛋白p24及核酸结合蛋白p15。在HIV感染个体的血清中，抗p24抗体是最早出现的抗体之一，检测抗p24抗体有利于HIV感染的早期诊断。在临床上，对HIV感染患者的抗p24抗体水平检测，还可以作为病程发展的重要指标之一〔5〕。env基因表达一个前体多蛋白，在被糖基化后，故对该前体蛋白被酶解，产生外膜蛋白(EGP)gp120与跨膜蛋白(TMP)gp41。抗膜蛋白的抗体几乎出现在所有感染者的血清中，并与感染病人的临床症状无关，该抗体的检测是判断HIV感染的关键指标。
利用基因重组的方法，在大肠杆菌中高效表达HIV抗原，可以较低的成本大量提供高纯度的抗原用于抗HIV抗体的检测。我们以前分别报道了HIV-1Gag与HIV-1膜蛋白在大肠杆菌中的表达〔6～8〕。本文在此基础之上，构建了HIV-1Gag/Env融合蛋白在大肠杆菌中的表达质粒，获得了融合蛋白的高效表达。并以此为抗原，应用ELISA方法对HIV-1阳性血清进行了检测。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 菌株与质粒 大肠杆菌DH5α，RRI(pGIts857)为本室保存。质粒pDOG-c,pUCGP01按文献〔6〕制备。质粒pBH10R3含有HIV-1BH1。标全长编码序列〔9〕，由美国S.Rasheed博士赠送。
1.2 酶和试剂 限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA片段回收柱和琼脂糖，均购于Promega公司。HIV-1阳性血清为本室保存。标准血清Panel9802由国家卫生部药品生物制品检定所提供，包括：20份阴性血清、18份HIV-1阳性血清与两份HIV-2阳性血清。
1.3 DNA操作 参照文献〔10〕的方法进行。
1.4 Gag/Env融合蛋白的表达与制备电泳纯化 以表达质粒pDGagEnv转化RRI(pCIts857)。挑取单个菌落，接种于50mlLB培养基(含有100mg/L氨苄青霉素与20mg/L卡那霉素)中，30℃过夜生长。次日以1∶10接种于500ml同样的培养基中，30℃继续生长到A600=0.6～0.8，将温度调到42℃，继续培养5h后收菌。菌体重悬于40ml溶液A(10 mmol/L Tris-HCI,pH8.0)中，加入溶菌酶50mg裂解菌体，10min后，超声破碎，12000×g离心20min，弃上清。沉淀先后用溶液A、溶液B(10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0，1mol/LNaCl)和溶液C(10mmol/LTrisHCl,pH8.0，8mol/L尿素)充分洗涤后，将沉淀蛋白悬于12ml蒸馏水中，加入3ml5×SDS凝胶加样缓冲液(60 mmol/L Tris-HCl,pH6.8，25%甘油，2%SDS，14.4mmol/L巯基乙醇，0.1%溴酚蓝)，煮沸5min后，样品分两次进行制备电泳纯化。制备电泳装置为Bio-Rad公司的Medel-491PrepCell。两次分别使用10%与15%的SDS聚丙烯酰氨凝胶。样品在25mA下电泳，分管收集洗脱样品，用SDS-PAGE鉴定重组蛋白所在的峰。蛋白浓度由A260与A280处的光吸收值来确定。
, 百拇医药
1.5 纯化的重组蛋白与HIV-1/HIV-2血清的反应性 以纯化抗原(1 mg/L)包被96孔ELISA板，4℃过夜。以含1%BSA的PBST(含0.05%Tween的PBS)于4℃封闭4h～6h。标准血清以样品稀释液(100 mmol/L Na3PO3,pH7.5,10%山羊血清，0.05% Tween 20)作1∶10稀释，每孔加入100μl，37℃反应30min。以PBST充分洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的小鼠抗人IgG(1/25000)。37℃温育15min，充分洗涤，加OPD，37℃显色10min，测定波长为492nm的光吸收值。
1.6 Western印迹 诱导菌体裂解液与纯化蛋白质经15%SDSPAGE分离后，用干转法转印到硝酸纤维素滤膜上，加封闭液(5%脱脂奶粉，150mmol/LNaCl,50mmol/LTris-HCl,pH7.5,0.05%Tween)室温孵育2h。分别使用抗HIV-1阳性血清以及抗p24mAb与转印蛋白起反应。HIV-1用样品稀释液(150 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5,0.05%Tween20)作1∶100稀释。将滤膜与稀释血清室温孵育2h。抗HIV-1抗体用HRP标记的抗人IgG小鼠mAb与显色底物(50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5,0.6 mg/ml联苯二胺，1 ml/L 30%H2O2)检测。抗HIV-1 p24mAb 2G10〔12〕用样品稀释液作1∶500稀释，使用HRP标记的羊抗小鼠IgG多抗作为第二抗体，用同样方法显色。
, 百拇医药
2 结果
2.1 Gag/Env融合蛋白表达质粒的构建 使用的4条PCR引物的序列分别为：
P1：5′CGG AAT TCA TAA ACA GAT AGA TAG CA3′
P2：5′GGG GTA CCT GAT CCT GAT CCT CTT TTT TCT CTC TGC AC3′
P3：5′GGG GTA CCC AGG CCA GAC AAT TAT TG3′
P4：5′CGG GAT CCT ACT TGC CCA TTT ATC T3′
以含有全长HIV-1编码基因的质粒pBH10R3〔9〕为模板，利用P1与P2引物做PCR扩增编码Env351～518的DNA序列。P1与P2引物分别带有EcoRI与KpnI的酶切位点，所获PCR产物用上述两酶酶切。利用P3与P4引物扩增编码Env548～675的DNA序列。P3与P4引物分别带有Kpn I与BamH I，所获PCR产物用这两种限制性内切酶切割。将以上两种PCR产物连接，再将连接产物克隆到pUC18质粒的EcoRI与BamH I位点之间，构建质粒pUCEnv。该质粒用Bg1 II与BamHI酶切，回收约510bp的片段。pUCGP01质粒〔6〕以同样的方法酶切，回收大片段，与上述510bp的片段连接构建质粒pUCGPEnv。该质粒用PstI酶切，回收约1.2kb的片段，克隆到表达载体pDOG-c的相应位点上，构建pDGagEnv表达质粒(图1、2，见第Ⅲ页)，表达HIV-1Gag209～437与Env473～518+Env545～675的融合蛋白，融合蛋白的N端还带有16个氨基酸残基的载体序列，预期表达Mr～46500的重组蛋白(p46),其序列见图3。
, 百拇医药
图1 表达质粒pDGagEnv的构建过程
Fig1 Construction of expression plasmid pDGagEnv
图2 融合基因接点(Bg1 II位点)附近的Gag/Env基因及其码蛋白的序列
Fig2 Sequences of the Gag/Env fusion gene and its expres sed protein near the Bg1 II site
图3 重组抗原Gag/Env(p46),p22及p19的氨基酸组成
, 百拇医药
Fig3 The amino acidc omposition of the recombinant Gag/Env(p46),p22 and p19
Coding of p22 starts from the ATG423 of gag gene and p19 from ATG482 of the env gene
2.2 Gag/Env融合蛋白的表达与制备电泳纯化 表达质粒pDGagEnv是表达载体pDOG来源的表达载体。该载体曾用于HIV-1gag的高效表达〔6，7〕。载体用PL启动子控制外源基因的表达，PL启动子受控于pDOG载体编码的温度敏感的阻抑物CIts857，可以利用诸如大肠杆菌HB101和DH5α等作为宿主菌表达外源蛋白。如果将表达质粒pDGagEnv转化大肠杆菌RRI(pClts857)，由于该宿主菌本身还带有Clts857表达质粒pClts857，因而可使Clts857的表达量进一步提高，有利于降低在低温下PL启动子的转录，增加系统的稳定性。
, http://www.100md.com
将表达质粒pDGagEnv转化大肠杆菌RRI(pClts857)，挑取阳性克隆，接种于LB培养基中于30℃培养到对数中期，将温度调整到42℃，继续诱导5h。收获细菌，提取包涵体。将诱导前、后的全菌体及包涵体一起进行SDSPAGE(图4A，见第Ⅲ页)。结果表明，与诱导前相比较，在Mr约为46 500，28 500，22 000和19 000的位置上，有特异表达带(列2)(以下称为重组蛋白p46,p28,p22,p19)，表达产物存在于包涵体中(列3)。包涵体蛋白不溶解于8mol/L尿素中，故用8mol/L尿素充分洗涤包涵体，可去除大部分杂质蛋白。用10%SDSPAGE制备电泳纯化可得到p46蛋白(列4)；用15%SDSPAGE制备电泳可得到单独的p19蛋白(列6)及p22/p19混合的纯化蛋白(列5)。
图4 Gag/Env融合抗原的表达、纯化及Western印迹分析
, 百拇医药
Fig4 Expression and purification of Gag/Env chimera protein analyzed by SDS-PAGE(A) and Western blot with an anti-HIV-1 anti body(B)
2.3 表达产物的Western印迹分析 利用Western印迹检测了表达蛋白的抗原性。将诱导菌体裂解液、包涵体蛋白及纯化蛋白用SDS-PAGE分离后，转印到硝酸纤维素滤膜上，与1份HIV-1阳性血清起反应。所获结果与对照菌相比，诱导全菌体与包涵体在Mr约为46500，28500，22000和19000的位置上，存在特异反应带(图4B，见第Ⅲ页，列2、3)，表明这4条带均为良好的HIV-1抗原。纯化的p46蛋白、p19蛋白及p22/p19蛋白，均可与该份血清起反应(图4B，见第Ⅲ页，列4～6)。
同时使用1株抗HIV-1p24mAb2G10〔12〕对重组蛋白进行了免疫印迹反应。mAb2G10是利用重组HIV-1Gga前体蛋白片段PG1(Gag121～437)免疫小鼠而获得的，可特异识别Gag209-363。结果表明，该mAb与p46及p28均可起反应，而与p22及p19不起反应(结果未显示)，p46及p29反应带在诱导前的菌体蛋白中不存在。在诱导菌体及包涵体蛋白中，还存在Mr介于46500与28000间能与mAb2G10发生反应的带,但表达量低,且不能用抗HIV-1血清检出。
, http://www.100md.com
结合以上结果，由于p46蛋白带与预期的Gag/Env融合蛋白的Mr一致，且同时与抗p24及抗HIV-1的抗体起反应，表明p46蛋白为完整的Gag/Env融合蛋白，其它3条蛋白带可能是Gag/Env融合蛋白的降解产物，也可能是Gag/Env基因内部翻译产物或翻译提前终止产物。由于p22及p19蛋白不能与抗Gag209～363的mAb起反应，表明两个重组蛋白主要包括了Env区域。大肠杆菌在翻译HIV-1Gag及Env蛋白时，会发生翻译过程的提前终止，使得gag与env基因内部存在的大肠杆菌翻译起始序列得以暴露，产生Mr小的表达产物。仔细研究表达质粒pDGagEnv包含的Gag/Env基因序列(图2，见第Ⅲ页)，发现在融合基因BglII位点下游10bp位置附近，存在大肠杆菌SD一致序列及一个翻译起始密码子ATG(AGGAGGAGATATG)。该ATG编码HIV-1482位的甲硫氨酸(图2，见第Ⅲ页)，已证明该起始序列是大肠杆菌识别的高效翻译起始序列，已被用于重组HIV-1/HIV2嵌合膜蛋白的高效表达〔11〕。在本文构建的表达质粒中，该序列预期指导翻译对应于HIV-1Env482～518+548～675Mr为19000的HIV-1膜蛋白(即p19蛋白)。在Bg1II位点上游40bp位置附近，存在另一个大肠杆菌翻译起始序列(AAGAAGGACACCAAATG),p22蛋白则可能是这一序列指导翻译的产物,因而对应于序列Gag423～437+Env474～518+Env548～675。对p28蛋白尚未进一步进行鉴定。
, 百拇医药
2.4 纯化蛋白与HIV-1/HIV-2血清的反应 我们应用ELISA法，初步研究了重组p19及p22蛋白与国家第2代HIV-1/HIV-2标准血清的反应性。重组p19及p22蛋白包括了HIV-1gp120及gp41的主要抗原表位〔8〕，且不融合任何载体来源序列，应具有良好的抗原性与特异性。标准血清9802包括20份阴性血清与18份HIV-1阳性血清。实验结果(表1)表明,p22/p19，p19纯化蛋白与18份HIV-1阳性血清的反应均值分别为1.038及0.807；与20份阴性血清的反应均值分别为0.066与0.051,P/N均值比分别为15.7与15.8。如以阴性血清A490均值的3倍作为临界值，则两种抗原的临界值分别为0.198及0.153，测定的灵敏度与特异性均达到了100%，表明以上两种抗原均可较好地用来检测抗HIV-1抗体。
表1 重组抗原与国家HIV-1/HIV2质检血清(No.9802)的反应结果
Tab 1 Reactivities of recombinant proteins with National HIV-1/HIV-2 panel sera(No.9802) NS No .
, http://www.100md.com
A492
PS No .
A492
P19
P19/P22
P19
P19/P22
N01
0.037
0.035
P01
1.250
1.132
, 百拇医药
N02
0.063
0.043
P02
1.160
1.032
N03
0.091
0.092
P03
1.095
0.750
N04
, 百拇医药
0.082
0.090
P04
1.264
0.961
N05
0.088
0.080
P05
1.169
1.002
N06
0.070
, 百拇医药
0.058
P06
0.743
0.588
N07
0.042
0.032
P07
0.397
0.326
N08
0.058
0.044
, 百拇医药
P08
1.133
0.892
N09
0.040
0.029
P09
0.312
0.217
N10
0.022
0.013
P10
, 百拇医药
0.714
0.495
N11
0.073
0.015
P11
0.924
0.725
N12
0.051
0.034
P12
1.135
, http://www.100md.com
0.923
N13
0.152
0.103
P13
0.333
0.388
N14
0.063
0.046
P14
1.950
1.698
, 百拇医药
N15
0.017
0.013
P15
1.610
1.301
N16
0.078
0.065
P16
0.613
0.493
N17
, 百拇医药
0.087
0.062
P17
1.338
1.141
N18
0.035
0.018
P18
0.588
0.471
N19
0.104
, 百拇医药
0.112
N20
0.069
0.044
Average
0.066
0.051
1.038
0.807
Notes: NS:Negative sera; PS:Positive sera; P/N=15.7 for p19 ; 15.8 for p22
3 讨论
, http://www.100md.com
近十年来，我们实验室一直从事HIV抗原在大肠杆菌中的表达与纯化研究。与合成多肽抗原相比，重组抗原的优点在于成本相对低且抗原表位的覆盖面大。我们曾经报道了HIV-1 Gag前体蛋白片段PG1(Gag 121～437)与PG2(Gag 209～437)在大肠杆菌中的表达〔7〕。其中PG2蛋白的表达量可占全菌体蛋白的20%，且不降解；纯化的PG2重组蛋白能与HIV-1阳性血清发生特异反应。我们还报道了HIV-1多表位膜抗原(Env482-518+548～675)在大肠杆菌中的表达，表达蛋白MEre除包括HIV-1膜蛋白序列外，还在N端融合了载体编码的284个氨基酸残基〔8〕。而载体序列可能会掩盖HIV-1Env的表位，并带来非特异性反应。为此，我们构建了HIV-1Gag/Env融合蛋白表达载体，以期获得HIV-1GagEnv融合蛋白(Gag209～434+Env474～518+Env545～675)的表达。实验结果表明，带有表达质粒pDGagEnv的大肠杆菌RRI(pClts857)，可表达p46，p28，p22及p194种Mr不同的重组蛋白。免疫印迹分析表明，p46蛋白可与抗HIV-1p24mAb及HIV-1阳性血清起反应，表明对应于完整的HIV-1Gag/Env融合蛋白。该蛋白除了包括HIV-1Gag与Env序列外，在N端只融合了载体来源序列的16个氨基酸残基，对重组抗原的抗原性影响较小，并减少了融合大片段序列可能带来的非特异性反应。由于gag基因编码蛋白在HIV-1不同株之间高度保守，而且与HIV-2的gag基因也具有较高的同源性，故使用HIV-1Gag重组抗原，可检测出不同株HIV-1与HIV-2感染个体血清中的抗体。我们重组的融合蛋白同时包括了HIV-1Gag，gp120及gp41中高度保守的重要抗原表位，预期可提高检测抗不同株HIV-1抗体的能力。我们将进一步研究该融合蛋白与HIV-1血清的反应性。
, 百拇医药
与预期结果不同的是，除p46蛋白外，p28，p22及p19的表达带也具有较高的表达量，尤其以p19蛋白的表达量最高。根据Han等〔11〕报道，该表达蛋白对应于Env482～518+548～675。该蛋白的翻译是由对应于Env482位的甲硫氨酸起始的，因而不包含任何载体来源的序列，在抗原性及反应的特异性方面，均优于文献报道的MEre蛋白。免疫印迹结果表明，p22蛋白主要包括膜蛋白序列，可能是由表达质粒gag基因内部的翻译起始序列指导翻译的。
由于表达蛋白存在于包涵体中，且不能用8mol/L尿素溶解，故表达蛋白不能用常规的方法纯化。我们利用制备电泳的方法，分别纯化了p46，p19及p19/p22重组蛋白。用后两种纯化蛋白检测由国家卫生部药品生物制品检定所提供的HIV-1/HIV-2ELISA试剂盒质检血清，特异性与灵敏度均达到100%，是检测抗HIV-1抗体的良好抗原。总之，我们的研究提供了大量生产3种重组HIV-1抗原的方法，为高质量的抗HIV1抗体ELISA检测试剂盒的研制打下了良好的基础。
, http://www.100md.com
*“九五”国家医学科技攻关资助项目，No.96-906-03-16
作者简介：韩保光，男，31岁，助理研究员，博士，凌世淦：通讯作者。北京市太平路27号，Tel.(010)66932308
参考文献
[1]Steimer KS,Higgins KW,Powers MA,et al.Recombinant polypeptide from endonuclease region of the acquired immunodeficiency syndrome retrovirus polymerase(pol)gene detects serum antibodies in most infected individuals.J Virol,1985;58:9～6
[2]Barin F, McLane MF, Allan JS, et al. Virus envelope protein of HTLV III represents major target antigen for antibodies in AIDS patients. Science, 1985; 228:1094～1096
, http://www.100md.com
[3]Bjoerling E, Boucher CAB, Samuelsson A, et al. Two highly antigenic sites in the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. J Clin Microbiol, 1993; 31: 588～592
[4]Kanner SB, Cheng-Mayer C, Geffin RB, et al. Human retroviral env and gag polypeptide: serological assay to measure infection. J Immunol, 1986; 137:674～678
[5]Moore JP，Ho DD. Antibodies to discontinuous or conformationally-sensitive epitopes on the gp120 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 are highly prevalent in sera of infected humans. J Virol, 1993; 67:863～875
, 百拇医药
[6]Forster S M, Osborne L M, Cheingsong Popov R, et al. Decline of anti-p24 antibody proceeds antigenemia as correlate of prognosis in HIV-1 infection, AIDS. 1988; 1:235～240
[7]韩保光，孟莉，马贤凯,等.人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)核心蛋白(p24)在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定.病毒学报，1997；13：110～117
[8]韩保光，孟莉，马贤凯,等.HIV-1gag前体蛋白片段在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定.军事医学科学院院刊，1997；21：84～89
[9]韩保光，孟莉，马贤凯,等.HIV-1多表位膜蛋白在E.coli中的表达、纯化及在血清检测中的应用.军事医学科学院院刊，1998；22：8～12
, http://www.100md.com
[10] Ratner L, Haseltine W, Patarca R，et al. Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTLV-III. Nature, 1985; 313:277～284
[11]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory mannual 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 1.33～48
[12]Han B G, Meng L, Ma XK, et al. The use of a chimera HIV-1/HIV-2 envelope protein for immunodiagnosis of HIV infection: its expression and purification in E. coli by use of a translation site within HIV-1 env gene. Biochem Mol Biol Int, 1998; 46(3):607～617
[13]刘荷中，凌世淦，董邦权，等.分泌抗HIVp24单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与初步鉴定.军事医学科学院院刊，1997；21：17～20
收稿：1998-08-12
修回：1999-01-08, 百拇医药