抗肿瘤相关糖抗原sTn单克隆抗体的制备及鉴定
作者：李睿 杜柏榕 王立顺 李勇 朱迅
单位：李睿(白求恩医科大学免疫学教研室，吉林长春130021)；杜柏榕(白求恩医科大学免疫学教研室，吉林长春130021)；王立顺(白求恩医科大学免疫学教研室，吉林长春130021)；李勇(长春 生物制品研究所)；朱迅(白求恩医科大学免疫学教研室，吉林长春130021)
关键词：肿瘤相关抗原；糖；单克隆抗体；免疫组织化学
细胞与分子免疫学杂志000229
中图号：R730.4 文献标识码：B
文章编号：007-8738(2000)02-0169-02
细胞发生转化时，经常伴随着细胞膜表面糖脂或糖蛋白糖链的改变〔1〕。在肿瘤细胞，特别是腺癌细胞，其表面粘蛋白分子的糖链经常由于合成不全而缩短，形成肿瘤相关的简单粘蛋白糖抗原，sTn即为其中的一种〔2〕。sTn(NeuAcα2→6GalNAcα1→O-Ser/Thr)是一种二糖结构，可表达于各种腺癌组织，而在正常组织中则很少或不表达。血清、细胞或组织中sTn的检测，主要依赖抗sTn的单克隆抗体(mAb)。我们应用富含sTn侧链的绵羊颌下腺粘蛋白(OSM)免疫制备了抗sTn的mAb〔3〕，目的在于为建立检测sTn的方法以其作为靶向抗体进行导向治疗提供试剂。
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1 材料和方法
1.1 材料 Balb/c小鼠由本校实验动物中心提供。NS-1小鼠骨髓瘤细胞，为本室传代的细胞株。14例结肠直肠癌组织由本校病理学教研室提供；10例乳腺癌组织由本校第一临床学院病理科提供。所有标本均经100mL/L福尔马林固定、脱水、常规石蜡包埋，5μm贴APES胶(Sigma)切片后，进行免疫组织化学染色。免疫原OSM由长春生物制品研究所李勇研究员提供。IMDM培养液为Gibco公司产品。HAT及HT(Sigma)按常规比例配制。HRP标记的羊抗鼠IgG，Ig类及亚类的标准试剂，均购自东方公司。抗sTn标准抗体(anti-TAG72)，购自美国Neomarker公司。
1.2 方法 以OSM为免疫原免疫Balb/c小鼠后，取其脾细胞与NS-1小鼠骨髓瘤细胞的融合、克隆化，扩大培养及制备腹水均按常规方法。mAb特性的鉴定：①效价测定：杂交瘤细胞培养上清及其诱生的腹水中mAb的效价测定采用间接ELISA法；②IgG类别鉴定：采用琼脂双向扩散实验；③表位分析：采用硫酸铵沉淀法及DEAE52层析法纯化的腹水mAb标记HRP，做间接ELISA，检测抗sTn标准抗体(anti-TAG72)及所制备的mAb对酶标记抗体的封闭情况；④肿瘤组织中sTn表达的检测：采用免疫组织化学染色法。石蜡切片常规脱蜡至水，PBS振洗，加30mL/LH2O2作用20min，阻断内源性过氧化物酶。继用100mL/L羊血清封闭30min后，加入mAb(培养上清)，以anti-TAG72抗体作为阳性对照、PBS作为阴性对照，4℃孵育过夜，PBS振洗，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(室温40min)，同上振洗后，以DAB显色、苏木精衬染，脱水、透明、封片，光 镜观察。肿瘤细胞染色>5%者判为阳性。
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2 结果
2.1 抗sTnmAb杂交瘤细胞株的建立 经反复筛选、3次克隆化后，获得与OSM反应呈阳性、与神经氨酸酶处理的OSM呈阴性的杂交瘤细胞3株，分别命名为4F10，3E3和4G2。另有1株3F9，其与OSM及神经氨酸酶处理的OSM均可起反应，用于作为封闭实验的对照。所获杂交瘤细胞经体外连续传代4mo，液氮中冻存3mo复苏后 ，仍能稳定分泌mAb且效价不变。
2.2 mAb特性的鉴定 ①效价测定：3株mAb(4F10,3E3和4G2)的腹水效价分别为1∶25600，1∶12800和1∶12800；细胞培养上清的效价分别为1∶128，1∶64和1∶64。②IgG类别鉴定：3株mAb均为IgG1。③表位分析：以HRP标记的mAb4F10(HRP-4F10)做封闭实验表明，mAb4F10，3E3和4G2对HRP-4F10与OSM结合的阻断作用与anti-TAG72抗体相同，表明它们与anti-TAG72抗体均作用于同一表位(图1)。
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图1 3株mAb与anti-TAG72抗体对HRP-4F10与OSM结合的阻断作用
2.3 肿瘤组织的免疫组化染色 以mAb4F10作为一抗，对10例乳腺癌组织及14例结肠直肠癌组织进行了免疫组化染色，阳性者分别为5例和12例。染色部位位于肿瘤细胞的胞浆和胞膜(图2)。部分正常结肠粘膜可见有局限于腺管内的轻度染色(图2)。mAb4F10的染色同anti-TAG72抗体。癌周围正常组织及PBS阴性对照均呈阴性。乳腺癌组织中sTn的表达阳性率为50%(5/10)，结肠直肠癌组织中为86%(12/14)。
图2 sTn在乳腺癌及结肠直肠癌组织中的表达(免疫组化染色 ×200)
A：乳腺癌组织；B结肠直肠癌组织；C正常结肠粘膜.
, 百拇医药 3 讨论
腺癌是恶性肿瘤的常见类型。sTn为近年较受重视的一种肿瘤相关糖抗原，主要表达于各种腺癌〔2〕。其对癌前病变恶性转化的诊断、肿瘤患者预后的判定具有重要的意义〔4-6〕。另外，抗sTnmAb在肿瘤成像、肿瘤的放射免疫导向手术(RIGS)中也得到广泛的应用。在结肠直肠癌中，以sTn为靶点的mAb(如B72.3)为RIGS中最常用的抗体〔7〕。因此，制备可分泌抗sTnmAb 的杂交瘤细胞株具有重要的实际意义。
我们制备的抗sTnmAb4F10具有较强的肿瘤特异性且对肿瘤组织中sTn的检出率较高，有望试用于临床诊断与治疗；也可用其纯化相应的抗原，制备肿瘤疫苗，以及筛选和建立表达sTn的细胞系，研究sTn在肿瘤发生、发展中的生物学意义等。
作者简介：李睿，男，29岁，硕士 长春市新民大街2号，Tel.(0431)5645911-6476
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参考文献：
〔1〕 Hamomori SI. Aberrant glycosylation in cancer cell membranes as focused on glycolipids:overview and perspectives〔 J〕 . Cancer Res, 1985; 45:2405- 2414.
〔2〕朱伟，朱迅.肿瘤相关粘蛋白分子在肿瘤诊断及治疗中的意义〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志，1996;3(1):72-75.
〔3〕 Kjeldsen T. Preparatio and characterization of monoclonal antibodies directed to the tumor- associated O- linked sialosyl- 2→ 6α - N- acetylgalactosaminyl(Sialosyl-Tn)〔J〕 . Cancer Res, 1988;48:2214- 2220.
, 百拇医药
〔4〕 Itzkowitz SH. Sialosyl- Tn antigen:initial report of a new marker of malignant progression in long- standing ulcerative colitis〔 J〕 . Gastroenterology, 1995;109:490- 497.
〔5〕 Terasawa K. Expression of Tn and sialyosl- Tn antigens in the neoplastic transformation of uterine cervical epithelial cells〔 J〕 . Cancer Res, 1996;56:2229- 2236.
〔6〕 Victorzon M. Sialosyl- Tn antigen is an independent predictor of outcome in patients with gastric cancer〔J〕 . Int J Cancer, 1996;65:295- 300.
〔7〕张琴.放射免疫导引手术应用进展〔J〕.国外医学 肿瘤分册，1998；25(3)：132-133.
收稿日期：1999-07-07
修回日期：1999-09-13, 百拇医药
单位：李睿(白求恩医科大学免疫学教研室，吉林长春130021)；杜柏榕(白求恩医科大学免疫学教研室，吉林长春130021)；王立顺(白求恩医科大学免疫学教研室，吉林长春130021)；李勇(长春 生物制品研究所)；朱迅(白求恩医科大学免疫学教研室，吉林长春130021)
关键词：肿瘤相关抗原；糖；单克隆抗体；免疫组织化学
细胞与分子免疫学杂志000229
中图号：R730.4 文献标识码：B
文章编号：007-8738(2000)02-0169-02
细胞发生转化时，经常伴随着细胞膜表面糖脂或糖蛋白糖链的改变〔1〕。在肿瘤细胞，特别是腺癌细胞，其表面粘蛋白分子的糖链经常由于合成不全而缩短，形成肿瘤相关的简单粘蛋白糖抗原，sTn即为其中的一种〔2〕。sTn(NeuAcα2→6GalNAcα1→O-Ser/Thr)是一种二糖结构，可表达于各种腺癌组织，而在正常组织中则很少或不表达。血清、细胞或组织中sTn的检测，主要依赖抗sTn的单克隆抗体(mAb)。我们应用富含sTn侧链的绵羊颌下腺粘蛋白(OSM)免疫制备了抗sTn的mAb〔3〕，目的在于为建立检测sTn的方法以其作为靶向抗体进行导向治疗提供试剂。
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1 材料和方法
1.1 材料 Balb/c小鼠由本校实验动物中心提供。NS-1小鼠骨髓瘤细胞，为本室传代的细胞株。14例结肠直肠癌组织由本校病理学教研室提供；10例乳腺癌组织由本校第一临床学院病理科提供。所有标本均经100mL/L福尔马林固定、脱水、常规石蜡包埋，5μm贴APES胶(Sigma)切片后，进行免疫组织化学染色。免疫原OSM由长春生物制品研究所李勇研究员提供。IMDM培养液为Gibco公司产品。HAT及HT(Sigma)按常规比例配制。HRP标记的羊抗鼠IgG，Ig类及亚类的标准试剂，均购自东方公司。抗sTn标准抗体(anti-TAG72)，购自美国Neomarker公司。
1.2 方法 以OSM为免疫原免疫Balb/c小鼠后，取其脾细胞与NS-1小鼠骨髓瘤细胞的融合、克隆化，扩大培养及制备腹水均按常规方法。mAb特性的鉴定：①效价测定：杂交瘤细胞培养上清及其诱生的腹水中mAb的效价测定采用间接ELISA法；②IgG类别鉴定：采用琼脂双向扩散实验；③表位分析：采用硫酸铵沉淀法及DEAE52层析法纯化的腹水mAb标记HRP，做间接ELISA，检测抗sTn标准抗体(anti-TAG72)及所制备的mAb对酶标记抗体的封闭情况；④肿瘤组织中sTn表达的检测：采用免疫组织化学染色法。石蜡切片常规脱蜡至水，PBS振洗，加30mL/LH2O2作用20min，阻断内源性过氧化物酶。继用100mL/L羊血清封闭30min后，加入mAb(培养上清)，以anti-TAG72抗体作为阳性对照、PBS作为阴性对照，4℃孵育过夜，PBS振洗，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(室温40min)，同上振洗后，以DAB显色、苏木精衬染，脱水、透明、封片，光 镜观察。肿瘤细胞染色>5%者判为阳性。
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2 结果
2.1 抗sTnmAb杂交瘤细胞株的建立 经反复筛选、3次克隆化后，获得与OSM反应呈阳性、与神经氨酸酶处理的OSM呈阴性的杂交瘤细胞3株，分别命名为4F10，3E3和4G2。另有1株3F9，其与OSM及神经氨酸酶处理的OSM均可起反应，用于作为封闭实验的对照。所获杂交瘤细胞经体外连续传代4mo，液氮中冻存3mo复苏后 ，仍能稳定分泌mAb且效价不变。
2.2 mAb特性的鉴定 ①效价测定：3株mAb(4F10,3E3和4G2)的腹水效价分别为1∶25600，1∶12800和1∶12800；细胞培养上清的效价分别为1∶128，1∶64和1∶64。②IgG类别鉴定：3株mAb均为IgG1。③表位分析：以HRP标记的mAb4F10(HRP-4F10)做封闭实验表明，mAb4F10，3E3和4G2对HRP-4F10与OSM结合的阻断作用与anti-TAG72抗体相同，表明它们与anti-TAG72抗体均作用于同一表位(图1)。
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图1 3株mAb与anti-TAG72抗体对HRP-4F10与OSM结合的阻断作用
2.3 肿瘤组织的免疫组化染色 以mAb4F10作为一抗，对10例乳腺癌组织及14例结肠直肠癌组织进行了免疫组化染色，阳性者分别为5例和12例。染色部位位于肿瘤细胞的胞浆和胞膜(图2)。部分正常结肠粘膜可见有局限于腺管内的轻度染色(图2)。mAb4F10的染色同anti-TAG72抗体。癌周围正常组织及PBS阴性对照均呈阴性。乳腺癌组织中sTn的表达阳性率为50%(5/10)，结肠直肠癌组织中为86%(12/14)。
图2 sTn在乳腺癌及结肠直肠癌组织中的表达(免疫组化染色 ×200)
A：乳腺癌组织；B结肠直肠癌组织；C正常结肠粘膜.
, 百拇医药 3 讨论
腺癌是恶性肿瘤的常见类型。sTn为近年较受重视的一种肿瘤相关糖抗原，主要表达于各种腺癌〔2〕。其对癌前病变恶性转化的诊断、肿瘤患者预后的判定具有重要的意义〔4-6〕。另外，抗sTnmAb在肿瘤成像、肿瘤的放射免疫导向手术(RIGS)中也得到广泛的应用。在结肠直肠癌中，以sTn为靶点的mAb(如B72.3)为RIGS中最常用的抗体〔7〕。因此，制备可分泌抗sTnmAb 的杂交瘤细胞株具有重要的实际意义。
我们制备的抗sTnmAb4F10具有较强的肿瘤特异性且对肿瘤组织中sTn的检出率较高，有望试用于临床诊断与治疗；也可用其纯化相应的抗原，制备肿瘤疫苗，以及筛选和建立表达sTn的细胞系，研究sTn在肿瘤发生、发展中的生物学意义等。
作者简介：李睿，男，29岁，硕士 长春市新民大街2号，Tel.(0431)5645911-6476
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参考文献：
〔1〕 Hamomori SI. Aberrant glycosylation in cancer cell membranes as focused on glycolipids:overview and perspectives〔 J〕 . Cancer Res, 1985; 45:2405- 2414.
〔2〕朱伟，朱迅.肿瘤相关粘蛋白分子在肿瘤诊断及治疗中的意义〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志，1996;3(1):72-75.
〔3〕 Kjeldsen T. Preparatio and characterization of monoclonal antibodies directed to the tumor- associated O- linked sialosyl- 2→ 6α - N- acetylgalactosaminyl(Sialosyl-Tn)〔J〕 . Cancer Res, 1988;48:2214- 2220.
, 百拇医药
〔4〕 Itzkowitz SH. Sialosyl- Tn antigen:initial report of a new marker of malignant progression in long- standing ulcerative colitis〔 J〕 . Gastroenterology, 1995;109:490- 497.
〔5〕 Terasawa K. Expression of Tn and sialyosl- Tn antigens in the neoplastic transformation of uterine cervical epithelial cells〔 J〕 . Cancer Res, 1996;56:2229- 2236.
〔6〕 Victorzon M. Sialosyl- Tn antigen is an independent predictor of outcome in patients with gastric cancer〔J〕 . Int J Cancer, 1996;65:295- 300.
〔7〕张琴.放射免疫导引手术应用进展〔J〕.国外医学 肿瘤分册，1998；25(3)：132-133.
收稿日期：1999-07-07
修回日期：1999-09-13, 百拇医药