FITC标记的抗Brdu单克隆抗体的研制
作者：徐志伟 邓鸿业 韩淑红 邓玉兰 黄大无 丁桂凤
单位：徐志伟(北京 医科大学免疫学系，北京100083)；邓鸿业(北京 医科大学免疫学系，北京100083)；韩淑红(北京 医科大学免疫学系，北京100083)；邓玉兰(北京 医科大学免疫学系，北京100083)；黄大无(北京 医科大学免疫学系，北京100083)；丁桂凤(北京 医科大学免疫学系，北京100083)
关键词：Brdu；单克隆抗体；IgG1；亲和纯化；；FITC标记；增殖细胞
细胞与分子免疫学杂志000226
中图号：R392.11 文献标识码：B
文章编号：1007-8738(2000)02-0164-02
, http://www.100md.com 利用溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)作为胸苷类似物可掺入到新合成的DNA中的特点，通过检测Brdu标记的细胞便能定性、定量地反映细胞的增殖状态〔1〕。我们已筛选出分泌特异性抗Brdu单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株〔2〕。为制备荧光素标记的抗BrdumAb用于流式细胞术定量检测增殖细胞，参考有关文献，用亲和层析纯化小鼠IgG亚类的方法，从腹水中纯化了抗BrdumAb，并用FITC荧光素进行标记。经初步用于体外检测Brdu标记细胞的数 量，取得较好的结果。
1 材料和方法
1.1 材料 BXSB小鼠由本校第三临床医学院陈学荣教授自美国Jackson实验室引进，本室饲养繁殖；Balb/c小鼠由本校动物部提供。含抗BrdumAb的小鼠腹水，按常规方法制备。Protein A-Sepharose CL4B购自Pharmacia公司；FITC为Merck公司产品；Sephadex G-50为Pharmacia公司产品，进口分装。8823A型紫外监测仪，为北京新技 术应用研究所产品。
, 百拇医药
1.2 方法 小鼠IgG亚类的纯化采用protein A-Sepharose亲和层析法〔3〕，全部过程均在4℃条件下进行。以Brdu-BSA为抗原，用ELISA法，测定洗脱下的各IgG亚类组分中抗体的结合活性。mAb的FITC标记采用透析法，具体步骤详见文献〔4〕。体外Brdu标记细胞的检测〔5〕：将RPMI1640和DMEM(Gibco)培养液等比例混合，并加入100mL/L的FCS(Hyclone)和10-5mol/L的Brdu(Sig-ma)。细胞在此培养液中，于37℃，50mL/LCO2条件下培养。收集1×106的细胞，用冷PBS洗涤后，以700mL/L乙醇固定20min，再以PBS洗涤。加入3mol/LHCl-5mL/LTween20，室温下作用20min使DNA变性。离心，取细胞沉淀悬浮于0.1mol/L硼酸钠液中中和3min。然后加PBS-5mL/L Tween20，离心后弃上清，以同上方法洗涤两次；加FITC标记的抗BrdumAb，室温下结合20min，再用PBS洗涤两次。以流式细胞仪FACScan(Becton Dickinson)检测Brdu标记的细胞，Lysis2软件分析。
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2 结果
2.1 抗Brdu mAb的纯化 分别用pH6.0，4.5和3.5的0.1mol/L柠檬酸钠液解吸附，依次洗脱下3个蛋白质峰，依次为小鼠IgG1,IgG2a/IgG3和IgG2b，其中小鼠IgG1的含量最高。经用ELISA法检测发现，只有IgG1亚类具有结合Brdu的活性，表明该抗BrdumAb属于小鼠IgG1亚 类。
2.2 标记的抗BrdumAb的最佳质量浓度 所制备的FITC标记的抗BrdumAb的P/F(摩尔比)为1.0；IgG1的质量浓度为0.6g/L。将荧光素标记抗体稀释成不同浓度，分别直接染色于体外Brdu标记(24h)的Sp2/0骨髓瘤细胞。结果发现，最适应用的质量浓度是，采用1μgFITC标记的抗BrdumAb可区分1×106个Brdu标记和未标记的细胞。
2.3 体外增殖B细胞的定量检测 从3mo龄雌雄BXSB小鼠和Balb/c小鼠脾脏提取的B细胞(Ig+细胞>90%)，加入0.02g/L的LPS体外培养72h。收集细胞，用最适质量浓度的FITC标记的抗BrdumAb直接染色后，用FACS检测分析Brdu标记的增殖B细胞数量。结果显示，3mo龄雄性BXSB小鼠增殖B细胞的数量高于同龄雌性BXSB小鼠， 而后者又高于同龄正常Balb/c小鼠(图1)。
, 百拇医药
图1 Brdu标记的增殖性B细胞的FACS分析
3 讨论
根据小鼠各IgG亚类对proteinA的亲和力不同，采用proteinA-Sepharose亲和层析，以不同pH值的0.1mol/L柠檬酸钠液分别洗脱后，可将IgG1IgG2a/IgG2b和IgG3依次洗脱下来。我们用该法从小鼠腹水中完全纯化出了抗BrdumAb，并证明其属于IgG1亚类。提纯的抗BrdumAb纯度较高(不含其它IgG亚类)，结合抗原的活性未受影响，这是因为提纯过程中应用高pH(8.9)和高离子强度(3mol)的甘氨酸缓冲液，可促进小鼠IgG1与proteinA的结合，防止丢失〔3〕。另外，应用了较温和的(pH6.0)解吸附缓冲液洗脱小鼠IgG1 ，因而对mAb的活性影响不大。
FITC标记的抗BrdumAb的最适应用浓度，是用1μg标记的mAb直接染色1×106个细胞，可将Brdu标记和未标记的细胞区分开来。若所用荧光抗体的量大于此浓度，则不能完全区分开Brdu标记的细胞和未标记的细胞，表明该荧光抗体的特异性和灵敏度均很高。此外，本实验曾将透析法和常用的搅拌法，用于FITC标记的抗BrdumAb进行了比较。发现后者虽标记率高(F/P>4)，但非特异性染色极强，甚至用2mol/LNaCl-PBS也不能将其从DEAE-纤维素柱上洗脱下来。应用制备的FITC标记的抗BrdumAb定量检测了来自3mo龄BXSB小鼠和正常Balb/c小鼠B细胞的体外增殖反应。结果表明，作为系统性红斑狠疮(SLE)小鼠模型之一的BXSB小鼠，其B细胞的体外增殖反应明显高于Balb/c小鼠，特别是雄性BXSB小鼠因带有yaa(Y chromosome linked autoimmune acceleration)基因，其B细胞的体外增殖反应最强。由于此与SLE小鼠B细胞的高活性(hype-ractivity)特征相一致〔6〕，表明体外增殖反应性B细胞的数量 可反映SLE的发病程度。
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虽然目前有多种检测增殖细胞的方法〔1〕，但Brdu标记法有其独特的优点。它不仅可替代放射性同位素用于体内外细胞的标记，对增殖细胞进行定性、定量检测，而且用免疫荧光抗体双标记法可分析不同类型细胞的增殖数量。此外，其在细胞动力学、肿瘤学、遗传学和分子生物学的研究中，已得到广泛地应用。因此，FITC标记的抗BrdumAb的制备，为国内开展 这些方面的研究和应用奠定了基础。
基金项目：高校博士点专项科研基金资助，No.教技发中心 〔1999〕26号
作者简介：徐志伟，男，35岁，博士生 北京市学院路38号，Tel.(010)62091435
2000byJCellMolImmunolPress www.immunology.net/jcmi;Email：immuedit@fmmu.edu.cn
, 百拇医药 参考文献：
〔1〕 Bouiton RA,Hodgson JF.Assessing cell proliferation: a methological review〔J〕.Clin Sci,1995;88:119-130.
〔2〕韩淑红，邓鸿业，徐志伟，等.抗Brdu单克隆抗体的制备及鉴定〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志，1999；19：235.
〔3〕 Johnstone A,Thorpe R.Fractionation of IgG into subclass:isolation of mouse IgG monoclonal antibody.In：Johnstone A,Thorpe R,eds.Immunochemistry in practice〔M〕.3rd ed.London:Blackwell Sci，1996:256-258.
, http://www.100md.com
〔4〕沈关心，周汝麟，主编.现代免疫学实验技术〔M〕.武汉：湖北科学技术出版社，1998：96-97.
〔5〕 Ghia P,Grawunder U,Winkler T,et al.FACS analysis of B lymphopoiesis in mouse and human bone marrow.In:Ivan Lefkovits ed.Immunology method manual:The comprehensive sourcebook of techniques〔M〕.1st ed.SanDiego:Acad Press,1997:925.
〔6〕 Theofilopoulos AN,Dixon FJ.Murine models of systemic lupus erythematosus〔J〕.Adv Immunol,1985;37:269-390.
收稿日期：1999-07-19
修回日期：1999-09-06, http://www.100md.com
单位：徐志伟(北京 医科大学免疫学系，北京100083)；邓鸿业(北京 医科大学免疫学系，北京100083)；韩淑红(北京 医科大学免疫学系，北京100083)；邓玉兰(北京 医科大学免疫学系，北京100083)；黄大无(北京 医科大学免疫学系，北京100083)；丁桂凤(北京 医科大学免疫学系，北京100083)
关键词：Brdu；单克隆抗体；IgG1；亲和纯化；；FITC标记；增殖细胞
细胞与分子免疫学杂志000226
中图号：R392.11 文献标识码：B
文章编号：1007-8738(2000)02-0164-02
, http://www.100md.com 利用溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)作为胸苷类似物可掺入到新合成的DNA中的特点，通过检测Brdu标记的细胞便能定性、定量地反映细胞的增殖状态〔1〕。我们已筛选出分泌特异性抗Brdu单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株〔2〕。为制备荧光素标记的抗BrdumAb用于流式细胞术定量检测增殖细胞，参考有关文献，用亲和层析纯化小鼠IgG亚类的方法，从腹水中纯化了抗BrdumAb，并用FITC荧光素进行标记。经初步用于体外检测Brdu标记细胞的数 量，取得较好的结果。
1 材料和方法
1.1 材料 BXSB小鼠由本校第三临床医学院陈学荣教授自美国Jackson实验室引进，本室饲养繁殖；Balb/c小鼠由本校动物部提供。含抗BrdumAb的小鼠腹水，按常规方法制备。Protein A-Sepharose CL4B购自Pharmacia公司；FITC为Merck公司产品；Sephadex G-50为Pharmacia公司产品，进口分装。8823A型紫外监测仪，为北京新技 术应用研究所产品。
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1.2 方法 小鼠IgG亚类的纯化采用protein A-Sepharose亲和层析法〔3〕，全部过程均在4℃条件下进行。以Brdu-BSA为抗原，用ELISA法，测定洗脱下的各IgG亚类组分中抗体的结合活性。mAb的FITC标记采用透析法，具体步骤详见文献〔4〕。体外Brdu标记细胞的检测〔5〕：将RPMI1640和DMEM(Gibco)培养液等比例混合，并加入100mL/L的FCS(Hyclone)和10-5mol/L的Brdu(Sig-ma)。细胞在此培养液中，于37℃，50mL/LCO2条件下培养。收集1×106的细胞，用冷PBS洗涤后，以700mL/L乙醇固定20min，再以PBS洗涤。加入3mol/LHCl-5mL/LTween20，室温下作用20min使DNA变性。离心，取细胞沉淀悬浮于0.1mol/L硼酸钠液中中和3min。然后加PBS-5mL/L Tween20，离心后弃上清，以同上方法洗涤两次；加FITC标记的抗BrdumAb，室温下结合20min，再用PBS洗涤两次。以流式细胞仪FACScan(Becton Dickinson)检测Brdu标记的细胞，Lysis2软件分析。
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2 结果
2.1 抗Brdu mAb的纯化 分别用pH6.0，4.5和3.5的0.1mol/L柠檬酸钠液解吸附，依次洗脱下3个蛋白质峰，依次为小鼠IgG1,IgG2a/IgG3和IgG2b，其中小鼠IgG1的含量最高。经用ELISA法检测发现，只有IgG1亚类具有结合Brdu的活性，表明该抗BrdumAb属于小鼠IgG1亚 类。
2.2 标记的抗BrdumAb的最佳质量浓度 所制备的FITC标记的抗BrdumAb的P/F(摩尔比)为1.0；IgG1的质量浓度为0.6g/L。将荧光素标记抗体稀释成不同浓度，分别直接染色于体外Brdu标记(24h)的Sp2/0骨髓瘤细胞。结果发现，最适应用的质量浓度是，采用1μgFITC标记的抗BrdumAb可区分1×106个Brdu标记和未标记的细胞。
2.3 体外增殖B细胞的定量检测 从3mo龄雌雄BXSB小鼠和Balb/c小鼠脾脏提取的B细胞(Ig+细胞>90%)，加入0.02g/L的LPS体外培养72h。收集细胞，用最适质量浓度的FITC标记的抗BrdumAb直接染色后，用FACS检测分析Brdu标记的增殖B细胞数量。结果显示，3mo龄雄性BXSB小鼠增殖B细胞的数量高于同龄雌性BXSB小鼠， 而后者又高于同龄正常Balb/c小鼠(图1)。
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图1 Brdu标记的增殖性B细胞的FACS分析
3 讨论
根据小鼠各IgG亚类对proteinA的亲和力不同，采用proteinA-Sepharose亲和层析，以不同pH值的0.1mol/L柠檬酸钠液分别洗脱后，可将IgG1IgG2a/IgG2b和IgG3依次洗脱下来。我们用该法从小鼠腹水中完全纯化出了抗BrdumAb，并证明其属于IgG1亚类。提纯的抗BrdumAb纯度较高(不含其它IgG亚类)，结合抗原的活性未受影响，这是因为提纯过程中应用高pH(8.9)和高离子强度(3mol)的甘氨酸缓冲液，可促进小鼠IgG1与proteinA的结合，防止丢失〔3〕。另外，应用了较温和的(pH6.0)解吸附缓冲液洗脱小鼠IgG1 ，因而对mAb的活性影响不大。
FITC标记的抗BrdumAb的最适应用浓度，是用1μg标记的mAb直接染色1×106个细胞，可将Brdu标记和未标记的细胞区分开来。若所用荧光抗体的量大于此浓度，则不能完全区分开Brdu标记的细胞和未标记的细胞，表明该荧光抗体的特异性和灵敏度均很高。此外，本实验曾将透析法和常用的搅拌法，用于FITC标记的抗BrdumAb进行了比较。发现后者虽标记率高(F/P>4)，但非特异性染色极强，甚至用2mol/LNaCl-PBS也不能将其从DEAE-纤维素柱上洗脱下来。应用制备的FITC标记的抗BrdumAb定量检测了来自3mo龄BXSB小鼠和正常Balb/c小鼠B细胞的体外增殖反应。结果表明，作为系统性红斑狠疮(SLE)小鼠模型之一的BXSB小鼠，其B细胞的体外增殖反应明显高于Balb/c小鼠，特别是雄性BXSB小鼠因带有yaa(Y chromosome linked autoimmune acceleration)基因，其B细胞的体外增殖反应最强。由于此与SLE小鼠B细胞的高活性(hype-ractivity)特征相一致〔6〕，表明体外增殖反应性B细胞的数量 可反映SLE的发病程度。
, http://www.100md.com
虽然目前有多种检测增殖细胞的方法〔1〕，但Brdu标记法有其独特的优点。它不仅可替代放射性同位素用于体内外细胞的标记，对增殖细胞进行定性、定量检测，而且用免疫荧光抗体双标记法可分析不同类型细胞的增殖数量。此外，其在细胞动力学、肿瘤学、遗传学和分子生物学的研究中，已得到广泛地应用。因此，FITC标记的抗BrdumAb的制备，为国内开展 这些方面的研究和应用奠定了基础。
基金项目：高校博士点专项科研基金资助，No.教技发中心 〔1999〕26号
作者简介：徐志伟，男，35岁，博士生 北京市学院路38号，Tel.(010)62091435
2000byJCellMolImmunolPress www.immunology.net/jcmi;Email：immuedit@fmmu.edu.cn
, 百拇医药 参考文献：
〔1〕 Bouiton RA,Hodgson JF.Assessing cell proliferation: a methological review〔J〕.Clin Sci,1995;88:119-130.
〔2〕韩淑红，邓鸿业，徐志伟，等.抗Brdu单克隆抗体的制备及鉴定〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志，1999；19：235.
〔3〕 Johnstone A,Thorpe R.Fractionation of IgG into subclass:isolation of mouse IgG monoclonal antibody.In：Johnstone A,Thorpe R,eds.Immunochemistry in practice〔M〕.3rd ed.London:Blackwell Sci，1996:256-258.
, http://www.100md.com
〔4〕沈关心，周汝麟，主编.现代免疫学实验技术〔M〕.武汉：湖北科学技术出版社，1998：96-97.
〔5〕 Ghia P,Grawunder U,Winkler T,et al.FACS analysis of B lymphopoiesis in mouse and human bone marrow.In:Ivan Lefkovits ed.Immunology method manual:The comprehensive sourcebook of techniques〔M〕.1st ed.SanDiego:Acad Press,1997:925.
〔6〕 Theofilopoulos AN,Dixon FJ.Murine models of systemic lupus erythematosus〔J〕.Adv Immunol,1985;37:269-390.
收稿日期：1999-07-19
修回日期：1999-09-06, http://www.100md.com