抗人肝癌mAbHAb18F(ab′)2半成品的制备与质量控制
作者：余晓玲 米力 陈志南 冯强
单位：余晓玲(第四军医大学基础部细胞工 程研究中心,陕西西安710032)；米力(第四军医大学基础部细胞工 程研究中心,陕西西安710032)；陈志南(第四军医大学基础部细胞工 程研究中心,陕西西安710032)；冯强(第四军医大学基础部细胞工 程研究中心,陕西西安710032)
关键词：片段抗体；高效疏水FPLC；制备；质控
细胞与分子免疫学杂志000225
摘要:目的 制备符合人用标准的抗人肝癌mAbHAb18F(ab′)2片段。方法 用胃蛋白酶消化经硫酸铵盐析的腹水抗体，然后在快速蛋白液相色谱(FPLC)上用Phenyl-SepharoseHP疏水柱纯化并进行质检。结果 经Phenyl-SepharoseHP疏水柱纯化后，F(ab′)2片段的纯度可达98.8%；回收率大于50%；免疫活性为1∶8000；细菌、热原质检测均呈阴性。结论 本制备工艺周期短、易于 质控，适宜进行中试放大及半成品生产。
, 百拇医药
中图号：R392.33 文献标识码：B
文章编号：1007-8738(2000)02-0161-03
Preparation and qualification of F(ab′ )2 frag ments of anti- human hepatocarcinoma mAb HAb18 for clinical application
YU Xiao- Ling MI Li CHEN Zhi- nan
(FENG Qang Cell Engineering Research Center the Fourth Military Medical
University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China)
, 百拇医药
Abstract: Aim To prepare F(ab′ )2 fragments of anti- human hepatocarcinoma mAb HAb18 for clinical application. Methods Mouse ascites containing mAb HAb18 IgG were precipitated with 291g/L ammonium sulfate and digested with pepsin in 0.1mol/L pH3.5 citrate buffer. The pepsin digests were applied to a column of Phenyl-Sepharose HP FPLC. Results The purity and recovery yield of F(ab′ )2 fragments were 98.8% and above 50% respectively, the immunoactivity was 1∶ 8 000 by ABC immunohistochemistry fluorescent assay. No bacteria and pyrogen were detected. Conclusion This method is a simple and rapid process with high recovery yield， especially suitable for large- scale preparation and purification of F(ab′ )2 fragments.
, 百拇医药
Keywords: monoclonal antibody; F(ab′ )2 fragment; hydropho bic interaction FPLC; preparation; qualification
抗体的片段在肿瘤患者的导向诊断及导向治疗中，已逐渐替代完整抗体，并显示出较大的应用潜力。国内外曾先后报道了不同Ig亚类mAbF(ab′)2片段的制备和纯化方法〔1-5〕，但有关人用抗体片断的制备与质量控制方面的报道较少。我们在mAbF(ab′)2片段的制备工艺上,采用了高效FPLC疏水色谱法，制备出符合人用鼠源性mAb质量控制标准的HAb18F(ab′)2片段半成品，其131I-HAb18F(ab′)2片段注射液成品已用于 I，II期临床研究。
1 材料和方法
1.1 F(ab′)2片段的制备 将经过硫酸铵粗纯化的腹水mAb HAb18用胃蛋白酶酶切，然后在FPLC上用Phenyl-Sepharose high performance疏水柱纯化。纯化后的产品立即冻干、4℃保存，具体方法参 见文献〔6〕。
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1.2 F(ab′)2片段的质量控制
1.2.1 纯度鉴定 采用SDS-PAGE法，将待测的HAb18F(ab′)2片段(10g/L)稀释至1g/L，在还原、非还原条件下进行SDS-PAGE，并用薄层色谱扫描仪(CS-9000)(Shimaduz)扫描，测定其纯度。
1.2.2 免疫结合活性的测定 采用ABC免疫组化法。组织抗原片用人肝癌组织和正常人肝组织的复合病理石蜡切片，F(ab′)2片段(1g/L)用pH7.40.01mol/LPBS倍比稀释为1∶500～1∶16000,用免疫组化ABC法染色(ABC试剂盒购自华美公司)测定免疫学结合活性的效价。阴 性对照为PBS，阳性对照为HAb18IgG。
1.2.3 无菌试验 按《生物制品制备及检定规程》中国药典1995版二部附录79页有关部分进行。需氧菌、厌氧菌的培养用疱肉管培养基，霉菌培养采用沙堡罗培养基，细菌培养用5g/L的 葡萄糖肉汤培养基。
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1.2.4 细菌内毒素试验 采用鲎试剂法，按中国药典(1995版)二部附录77页进行。鲎试剂(福建省福州东方鲎试剂厂生产)的灵敏度(λb)为0.5。设2Eμ内毒素工作标准品(由中国药品生物制
品检定所提供)为阳性对照，细菌内毒素的检查采用标准无热原的水作为阴性对照。同时设干扰试验，用供试品的最大有效稀释液将细菌内毒素工作标准品倍比稀释成2.0～0.25λb，每一稀释度平行做4管。将处理好的样品管封口，垂直放入37℃水 浴箱中反应1h。
1.2.5 残留DNA含量的测定 采用DNA分子杂交法。DNA标记测定盒(Boehringer Manhaim)、样品及骨髓瘤总DNA，用酚、氯仿抽提和过Sepladex-G200柱。阳性DNA对照用骨髓瘤DNA作10倍连续稀释即1000，100，10和1pg；样品DNA稀释为1,20和200μL3个滴度。然后点膜、探针标记和杂交显色。根据样品显色的深浅度，与阳性对照 进行对比判定样品DNA的残留量。
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1.2.6 残留胃蛋白酶含量的测定 采用高效凝胶过滤色谱法分析。HPLC系统(Beckman168)，凝胶过滤柱：Phenomenex BiosepSEC-3000(7.8mm×300mm，美国Phenomenex公司)，F(ab′)2片段(1g/L)及胃蛋白酶(1g/L),均以20mmol/LPBS(含2g/LSDS)pH7.0溶解，于37℃温育4h，离心后上样。
2 结果
2.1 纯度测定 根据“人用鼠源性mAb制备及质量控制要点”〔7〕的标准(以下简称“质控标准”)，在非还原条件下进行SDS-PAGE后，经薄层色谱扫描计算纯度百分比，F(ab′)2片段的纯度应大于95%。mAbHAb18F(ab′)2片段半成品经检测其纯度达98%以上。非还原条件下F(ab′)2的相对分子质量(Mr)为110000；还原条件下，重链的Mr约为28000，轻链约为26000( 图1)。
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图1 F(ab′)2片段半成品的SDS-PAGE
Fig1 SDS-PAGE of purified F(ab′)2 fragments
1：Marker(Mr);2,3,4:Purified F(ab′)2(reducing);
5,6,7:Purified F(ab′)2(non-reducing).
2.2 免疫活性的测定 HAb18F(ab′)2片段可与肝癌组织特异性结合，而与正常肝组织不结合；肝癌细胞呈棕黄色，周围肝细胞不着色，F(ab′)2片段(1g/L)的滴度>1∶8000，符合标准要求 。
2.3 无菌试验 需氧菌、厌氧菌、霉菌和细菌的培养结果均 呈阴性。
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2.4 内毒素试验 判定标准是：将试管从水浴中轻轻取出,缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阴性，反之则为阳性。HAb18F(ab′)2片段半成品的细 菌内毒素检测结果为阴性。
2.5 残留DNA及胃蛋白酶含量的测定 经测定HAb18F(ab′)2片段样品中残留DNA的含量小于100pg。经高效凝胶过滤色谱分析(图3)，HAb18F(ab′)2片段出峰时间tR为13.37min，胃蛋白酶出峰时间tR为15.28min。F(ab′)2片段峰中，在tR=15.28min时(胃蛋白酶峰)，未见峰形异常，说明在HAb18F(ab′)2片段半成品中无残留的胃蛋 白酶。
图2 HAb18F(ab′)2中残留胃蛋白酶的HPLC色谱分析
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Fig2 HPLC analysisof residual pepsin in HAb18F(ab′)2
3 讨论
近年来，我国mAb的研究进展很快，无论是mAb的种类或其质量均已接近于国际先进水平。根据中国药品质量管理局最近制定的《人用鼠源性mAb制备和质量控制要点》，用于人体的mAb或其片段的纯度必须达到95%以上；无细菌、真菌、支原菌及病毒污染；免疫学活性、残留DNA含量及残留胃蛋白酶含量，均应符合质量控制要求。因此，制备工艺的合理设计和严格质量控制至关重要。Morimoto等〔8〕对mAb(IgG1)F(ab′)2片段的一步纯化法进行了报道，这一方法虽可以使F(ab′)2片段的纯度达到98%，但对中试放大、半成品生产及质量控制等问题并未进一步阐述。而我们的制备工艺，不仅使F(ab′)2片段的纯度达到了98%以上，而且其它各项指标均符合人用标准,并进行了中试放大及半成品生产。在半成品的制备与质量控制方面，我们认为：①制备中所用的仪器及物品均经灭菌处理，配制溶液的水源为Millipore公司MILLI-Q超纯水系统生产的超纯无菌、无热原水，配制好的溶液再高压灭菌。严格地无菌操作可有效地控制半成品中热原的污染。②酶切后的F(ab′)2片段半成品的稳定性较差，易发生降解与聚合。在一般保存条件下，F(ab′)2片段半成品(液体状)置于37℃2d，纯度即降至95%以下，活性也随之下降〔9〕。我们采用较短的制备工艺且纯化后的半成品立即冻干，明显延长了F(ab′)2片段半成品的稳定性。③为保持F(ab′)2片段半成品的活性，我们采用了FPLC疏水色谱法，选用以硫酸铵为主的流动相，并确保所用的纯化操作既不损伤抗体的免疫学活性，又能达到95%以上的纯度。而且由于工艺流程短，从腹水的硫酸铵粗纯化到半成品的冰冻干燥，整个流程可在48h内完成，非常有利于保持F(ab′)2片段的免疫学活 性。
, 百拇医药
制备人用mAbF(ab′)2片段，必须做好每个环节的质量控制。在杂交瘤腹水的制备中，要防止细胞变异、染色体丢失，mAb的分泌量降低，以及外源因子的污染等问题。在制备工艺上，要保证尽可能的规范化和一致性，使产品间具有良好的重复性。半成品的稳定性和均一性，是核素标记后的成品在临 床应用中安全性和有效性的前提和保障。
基金项目：国家863课题资助，No.863-102-09-01-02
作者简介：余晓玲，女，26岁，助理实验师西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374547 2000byJCellMolImmunolPresswww.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
参考文献：
〔1〕 Parham P. On the fragmentation of monoclonal IgG1, IgG2a and IgG2b from Balb/c mice〔J〕 . JImmunol， 1983;131(6):2895- 2902.
, 百拇医药
〔2〕 Parham P. Monoclonal antibodies:purification of fragments and application to structural and functional
studies of MHC class I antigens〔 J〕 . J Immunol Meth， 1982;53(1):133- 139.
〔3〕仇凯，陈志南，刘智广，等.木瓜蛋白酶制备抗人肝
癌单抗F(ab′)2及Fab片段〔J〕.第四军医大学学报，1995;16(6):41 4-417.
〔4〕于鲁东，蒋先敏，程明,等.应用木瓜蛋白酶消化抗
甲胎蛋白单克隆抗体制备F(ab′)2片段〔J〕.中国生物制品学杂 志，1994;7(4):148-150.
, 百拇医药
〔5〕刘成刚，陈志南，边惠洁,等.单克隆抗体F(ab′)2片段
两种纯化方法的建立及比较〔J〕.第四军医大学学报，1998;19( 4):388-390.
〔6〕余晓玲，米力，陈志南.疏水作用FPLC一步法制备级
纯化抗人肝癌单抗HAb18F(ab′)2片段〔J〕.第四军医大学学报,20 00；21(1):123-126.
〔7〕中国药品生物制品检定所.人用鼠源性单克隆抗体的
制备及质量控制要点〔S〕.1990：卫药汉字(90)第37号.
〔8〕 Morimoto K, Inouye K. Single- step purification of F(ab′ )2 fragments of mouse monoclonal antibodies(IgG1) by hydrophobic interaction high performance liquid chromatography using TSKgel Phenyl- 5PW〔J〕 . Biochem Biophys Methods， 1992； 24:107- 117.
〔9〕米力，陈志南，余晓玲.单克隆抗体F(ab′)2片段的制备与质量控制〔J〕.中国生物制品学杂志，1999;12(4):216-219.
收稿日期：1999-11-05
修回日期：1999-12-27, 百拇医药
单位：余晓玲(第四军医大学基础部细胞工 程研究中心,陕西西安710032)；米力(第四军医大学基础部细胞工 程研究中心,陕西西安710032)；陈志南(第四军医大学基础部细胞工 程研究中心,陕西西安710032)；冯强(第四军医大学基础部细胞工 程研究中心,陕西西安710032)
关键词：片段抗体；高效疏水FPLC；制备；质控
细胞与分子免疫学杂志000225
摘要:目的 制备符合人用标准的抗人肝癌mAbHAb18F(ab′)2片段。方法 用胃蛋白酶消化经硫酸铵盐析的腹水抗体，然后在快速蛋白液相色谱(FPLC)上用Phenyl-SepharoseHP疏水柱纯化并进行质检。结果 经Phenyl-SepharoseHP疏水柱纯化后，F(ab′)2片段的纯度可达98.8%；回收率大于50%；免疫活性为1∶8000；细菌、热原质检测均呈阴性。结论 本制备工艺周期短、易于 质控，适宜进行中试放大及半成品生产。
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中图号：R392.33 文献标识码：B
文章编号：1007-8738(2000)02-0161-03
Preparation and qualification of F(ab′ )2 frag ments of anti- human hepatocarcinoma mAb HAb18 for clinical application
YU Xiao- Ling MI Li CHEN Zhi- nan
(FENG Qang Cell Engineering Research Center the Fourth Military Medical
University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China)
, 百拇医药
Abstract: Aim To prepare F(ab′ )2 fragments of anti- human hepatocarcinoma mAb HAb18 for clinical application. Methods Mouse ascites containing mAb HAb18 IgG were precipitated with 291g/L ammonium sulfate and digested with pepsin in 0.1mol/L pH3.5 citrate buffer. The pepsin digests were applied to a column of Phenyl-Sepharose HP FPLC. Results The purity and recovery yield of F(ab′ )2 fragments were 98.8% and above 50% respectively, the immunoactivity was 1∶ 8 000 by ABC immunohistochemistry fluorescent assay. No bacteria and pyrogen were detected. Conclusion This method is a simple and rapid process with high recovery yield， especially suitable for large- scale preparation and purification of F(ab′ )2 fragments.
, 百拇医药
Keywords: monoclonal antibody; F(ab′ )2 fragment; hydropho bic interaction FPLC; preparation; qualification
抗体的片段在肿瘤患者的导向诊断及导向治疗中，已逐渐替代完整抗体，并显示出较大的应用潜力。国内外曾先后报道了不同Ig亚类mAbF(ab′)2片段的制备和纯化方法〔1-5〕，但有关人用抗体片断的制备与质量控制方面的报道较少。我们在mAbF(ab′)2片段的制备工艺上,采用了高效FPLC疏水色谱法，制备出符合人用鼠源性mAb质量控制标准的HAb18F(ab′)2片段半成品，其131I-HAb18F(ab′)2片段注射液成品已用于 I，II期临床研究。
1 材料和方法
1.1 F(ab′)2片段的制备 将经过硫酸铵粗纯化的腹水mAb HAb18用胃蛋白酶酶切，然后在FPLC上用Phenyl-Sepharose high performance疏水柱纯化。纯化后的产品立即冻干、4℃保存，具体方法参 见文献〔6〕。
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1.2 F(ab′)2片段的质量控制
1.2.1 纯度鉴定 采用SDS-PAGE法，将待测的HAb18F(ab′)2片段(10g/L)稀释至1g/L，在还原、非还原条件下进行SDS-PAGE，并用薄层色谱扫描仪(CS-9000)(Shimaduz)扫描，测定其纯度。
1.2.2 免疫结合活性的测定 采用ABC免疫组化法。组织抗原片用人肝癌组织和正常人肝组织的复合病理石蜡切片，F(ab′)2片段(1g/L)用pH7.40.01mol/LPBS倍比稀释为1∶500～1∶16000,用免疫组化ABC法染色(ABC试剂盒购自华美公司)测定免疫学结合活性的效价。阴 性对照为PBS，阳性对照为HAb18IgG。
1.2.3 无菌试验 按《生物制品制备及检定规程》中国药典1995版二部附录79页有关部分进行。需氧菌、厌氧菌的培养用疱肉管培养基，霉菌培养采用沙堡罗培养基，细菌培养用5g/L的 葡萄糖肉汤培养基。
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1.2.4 细菌内毒素试验 采用鲎试剂法，按中国药典(1995版)二部附录77页进行。鲎试剂(福建省福州东方鲎试剂厂生产)的灵敏度(λb)为0.5。设2Eμ内毒素工作标准品(由中国药品生物制
品检定所提供)为阳性对照，细菌内毒素的检查采用标准无热原的水作为阴性对照。同时设干扰试验，用供试品的最大有效稀释液将细菌内毒素工作标准品倍比稀释成2.0～0.25λb，每一稀释度平行做4管。将处理好的样品管封口，垂直放入37℃水 浴箱中反应1h。
1.2.5 残留DNA含量的测定 采用DNA分子杂交法。DNA标记测定盒(Boehringer Manhaim)、样品及骨髓瘤总DNA，用酚、氯仿抽提和过Sepladex-G200柱。阳性DNA对照用骨髓瘤DNA作10倍连续稀释即1000，100，10和1pg；样品DNA稀释为1,20和200μL3个滴度。然后点膜、探针标记和杂交显色。根据样品显色的深浅度，与阳性对照 进行对比判定样品DNA的残留量。
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1.2.6 残留胃蛋白酶含量的测定 采用高效凝胶过滤色谱法分析。HPLC系统(Beckman168)，凝胶过滤柱：Phenomenex BiosepSEC-3000(7.8mm×300mm，美国Phenomenex公司)，F(ab′)2片段(1g/L)及胃蛋白酶(1g/L),均以20mmol/LPBS(含2g/LSDS)pH7.0溶解，于37℃温育4h，离心后上样。
2 结果
2.1 纯度测定 根据“人用鼠源性mAb制备及质量控制要点”〔7〕的标准(以下简称“质控标准”)，在非还原条件下进行SDS-PAGE后，经薄层色谱扫描计算纯度百分比，F(ab′)2片段的纯度应大于95%。mAbHAb18F(ab′)2片段半成品经检测其纯度达98%以上。非还原条件下F(ab′)2的相对分子质量(Mr)为110000；还原条件下，重链的Mr约为28000，轻链约为26000( 图1)。
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图1 F(ab′)2片段半成品的SDS-PAGE
Fig1 SDS-PAGE of purified F(ab′)2 fragments
1：Marker(Mr);2,3,4:Purified F(ab′)2(reducing);
5,6,7:Purified F(ab′)2(non-reducing).
2.2 免疫活性的测定 HAb18F(ab′)2片段可与肝癌组织特异性结合，而与正常肝组织不结合；肝癌细胞呈棕黄色，周围肝细胞不着色，F(ab′)2片段(1g/L)的滴度>1∶8000，符合标准要求 。
2.3 无菌试验 需氧菌、厌氧菌、霉菌和细菌的培养结果均 呈阴性。
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2.4 内毒素试验 判定标准是：将试管从水浴中轻轻取出,缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阴性，反之则为阳性。HAb18F(ab′)2片段半成品的细 菌内毒素检测结果为阴性。
2.5 残留DNA及胃蛋白酶含量的测定 经测定HAb18F(ab′)2片段样品中残留DNA的含量小于100pg。经高效凝胶过滤色谱分析(图3)，HAb18F(ab′)2片段出峰时间tR为13.37min，胃蛋白酶出峰时间tR为15.28min。F(ab′)2片段峰中，在tR=15.28min时(胃蛋白酶峰)，未见峰形异常，说明在HAb18F(ab′)2片段半成品中无残留的胃蛋 白酶。
图2 HAb18F(ab′)2中残留胃蛋白酶的HPLC色谱分析
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Fig2 HPLC analysisof residual pepsin in HAb18F(ab′)2
3 讨论
近年来，我国mAb的研究进展很快，无论是mAb的种类或其质量均已接近于国际先进水平。根据中国药品质量管理局最近制定的《人用鼠源性mAb制备和质量控制要点》，用于人体的mAb或其片段的纯度必须达到95%以上；无细菌、真菌、支原菌及病毒污染；免疫学活性、残留DNA含量及残留胃蛋白酶含量，均应符合质量控制要求。因此，制备工艺的合理设计和严格质量控制至关重要。Morimoto等〔8〕对mAb(IgG1)F(ab′)2片段的一步纯化法进行了报道，这一方法虽可以使F(ab′)2片段的纯度达到98%，但对中试放大、半成品生产及质量控制等问题并未进一步阐述。而我们的制备工艺，不仅使F(ab′)2片段的纯度达到了98%以上，而且其它各项指标均符合人用标准,并进行了中试放大及半成品生产。在半成品的制备与质量控制方面，我们认为：①制备中所用的仪器及物品均经灭菌处理，配制溶液的水源为Millipore公司MILLI-Q超纯水系统生产的超纯无菌、无热原水，配制好的溶液再高压灭菌。严格地无菌操作可有效地控制半成品中热原的污染。②酶切后的F(ab′)2片段半成品的稳定性较差，易发生降解与聚合。在一般保存条件下，F(ab′)2片段半成品(液体状)置于37℃2d，纯度即降至95%以下，活性也随之下降〔9〕。我们采用较短的制备工艺且纯化后的半成品立即冻干，明显延长了F(ab′)2片段半成品的稳定性。③为保持F(ab′)2片段半成品的活性，我们采用了FPLC疏水色谱法，选用以硫酸铵为主的流动相，并确保所用的纯化操作既不损伤抗体的免疫学活性，又能达到95%以上的纯度。而且由于工艺流程短，从腹水的硫酸铵粗纯化到半成品的冰冻干燥，整个流程可在48h内完成，非常有利于保持F(ab′)2片段的免疫学活 性。
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制备人用mAbF(ab′)2片段，必须做好每个环节的质量控制。在杂交瘤腹水的制备中，要防止细胞变异、染色体丢失，mAb的分泌量降低，以及外源因子的污染等问题。在制备工艺上，要保证尽可能的规范化和一致性，使产品间具有良好的重复性。半成品的稳定性和均一性，是核素标记后的成品在临 床应用中安全性和有效性的前提和保障。
基金项目：国家863课题资助，No.863-102-09-01-02
作者简介：余晓玲，女，26岁，助理实验师西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374547 2000byJCellMolImmunolPresswww.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
参考文献：
〔1〕 Parham P. On the fragmentation of monoclonal IgG1, IgG2a and IgG2b from Balb/c mice〔J〕 . JImmunol， 1983;131(6):2895- 2902.
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〔2〕 Parham P. Monoclonal antibodies:purification of fragments and application to structural and functional
studies of MHC class I antigens〔 J〕 . J Immunol Meth， 1982;53(1):133- 139.
〔3〕仇凯，陈志南，刘智广，等.木瓜蛋白酶制备抗人肝
癌单抗F(ab′)2及Fab片段〔J〕.第四军医大学学报，1995;16(6):41 4-417.
〔4〕于鲁东，蒋先敏，程明,等.应用木瓜蛋白酶消化抗
甲胎蛋白单克隆抗体制备F(ab′)2片段〔J〕.中国生物制品学杂 志，1994;7(4):148-150.
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〔5〕刘成刚，陈志南，边惠洁,等.单克隆抗体F(ab′)2片段
两种纯化方法的建立及比较〔J〕.第四军医大学学报，1998;19( 4):388-390.
〔6〕余晓玲，米力，陈志南.疏水作用FPLC一步法制备级
纯化抗人肝癌单抗HAb18F(ab′)2片段〔J〕.第四军医大学学报,20 00；21(1):123-126.
〔7〕中国药品生物制品检定所.人用鼠源性单克隆抗体的
制备及质量控制要点〔S〕.1990：卫药汉字(90)第37号.
〔8〕 Morimoto K, Inouye K. Single- step purification of F(ab′ )2 fragments of mouse monoclonal antibodies(IgG1) by hydrophobic interaction high performance liquid chromatography using TSKgel Phenyl- 5PW〔J〕 . Biochem Biophys Methods， 1992； 24:107- 117.
〔9〕米力，陈志南，余晓玲.单克隆抗体F(ab′)2片段的制备与质量控制〔J〕.中国生物制品学杂志，1999;12(4):216-219.
收稿日期：1999-11-05
修回日期：1999-12-27, 百拇医药