DNA测序中去除过量链终止剂的方法比较
作者：程司 曹云新 刘智广
单位：程司(第四军医大学中心实验室，陕 西西安710032)；曹云新(第四军医大学中心实验室，陕 西西安710032)；刘智广(第四军医大学中心实验室，陕西西安710032)
关键词：DNA测序；链终止剂；纯化
细胞与分子免疫学杂志000233
中图号：Q78 文献标识码：B
文章编号：1007-8738(2000)02-0177-02
美国Perkin-Elmer(PE)公司生产的373A型DNA自动测序仪的原理，是通过测序反应生成荧光素标记的寡核苷酸，然后进行电泳分离,计算机依据荧光素颜色的不同自动进行实时检测、识别，并分析出所测模板中的每一个碱基。与373A型自动测序仪配套的测序反应试剂盒有两种：一种为DyePrimer(引物标记)，另一种为Dye Deoxy Terminators(双脱氧核苷三磷酸标记)。后者为将4种荧光素分别标记到相应的终止剂-ddATP，ddCTP，ddGTP和ddTTP上。用Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit测序时，往往在测序反应中加入过量的终止剂，促使模板与终止剂充分结合。测序反应完成后，在模板进行凝胶电泳分离之前，若不及时、有效地除去过量的荧光素终止剂，将会对序列的识别和分析产生严重干扰，直接影响测序的结果。目前，除去过量终止剂的方法有：旋转柱分离法、异丙醇沉淀法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀法和酚/氯仿抽提法。这些方法各有优、缺点，我们对4种纯化方法进行了比较，以提供较为理想的除去 过量终止剂的方法。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 373A型DNA测序仪、9600型PCR仪和Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit，均为Perkin-Elmer公司产品。1mL旋转柱为Boehringer-Mannheim公司产品。其它相关试剂均为Sigma公司的产品或国 产分析纯试剂。
1.2 方法 参照PE公司DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit中说
明书提供的去除过量链终止剂的方法，略有改进。
1.2.1 旋转柱分离法参照Boehringer-Mannheim公司的产品说明 书进行操作。
1.2.2 异丙醇沉淀法在20μL反应混合物中，加入40μL异丙醇，离心(6000r/min)15min；弃上清，真空抽干；加700mL/L乙醇500μL，混合均匀，离心(5000r/min)15min；弃上清，真空抽干；重复后两步骤1次。待模板干燥后，加入4μL去离子甲酰胺∶50mmol/LEDTApH8.0(5∶1)混合试剂，混合均匀，上样电泳。
, 百拇医药
1.2.3 CTAB沉淀法在20μL反应混合物中，加入50g/LCTAB2.5μL，混合均匀，离心(10000r/min)3～4min。弃上清，加入500μL700mL/L乙醇，充分混和15～30min；再离心(5000r/min)3～4mi
n；弃上清、晾干。加入4μL去离子甲酰胺∶50mmol/LEDTApH8.0( 5∶1)混合试剂，混合均匀，上样电泳。
1.2.4 酚/氯仿抽提法在20μL反应混合物中加入80μL去离子水；用100μL酚∶水∶氯仿(68∶18∶14)混合试剂抽提；离心(6000r/min)，弃去有机相；重复后两步骤1次。向水相加入15μL2mol/LNaAc(pH4.5)和300μL纯乙醇；离心(10000r/min)15min，弃上清，用700mL/L乙醇洗涤、晾干。加入4μL去离子甲酰胺∶50mmol/LEDTApH8.0(5∶1)混合试剂，混合均匀，上样电泳。
, 百拇医药
不同纯化方法的效果判断：采用上述4种方法各对20份样品进行纯化，上样电泳后按以下3个指标判断纯化的效果：①序列起始端残留终止剂峰的数目和大小；②可观察到的不受残留终止剂峰干扰的第1个碱基的位置；③是否存在终止剂杂质 峰(常位于196～208位碱基之间)。2结果 分别采用上述4种方法，各对20份样品进行了纯化。经统计测序结果表明，4种纯化方法各有其优、缺点(表1)。
表1 四种纯化方法纯化产物的测序结果比较 纯化方法
在序列起始端
残留终止剂峰
的数目和大小
可观察到的不
受残留终止剂峰
干扰的第1个碱基的位置
, 百拇医药
终止剂杂质峰(常
位于196～208位碱基)
出现的情况
旋转柱分离法
0～5，小到中
1～10
通常不存在
异丙醇沉淀法
6～10，大
～26
存在
CTAB沉淀法
, 百拇医药 0～10，中
10～20
通常不存在
酚/氯仿抽提法
4～5，中
10～20
不存在
3 讨论
根据上述实验结果，我们认为：旋转柱分离法费用高且耗时，有时会造成不连续的测试结果。用该法遇到的最常见问题是残留的终止剂峰(0～5个)，对序列起始端碱基峰可产生干扰。另外，有时在凝胶的部分区域残留着终止剂杂质(系操作因素造成)，使碱基识别系统发生识别错误。为此，建议通过以下措施加以改善：①尽量加样于柱床的中心，避免接触柱的边缘；②注意选择合适的旋转速度。转速的选择可根据公式：g=11.18·r·(r/1000min)2得出，其中g为 离心力，r为旋转半径，r/min为转速。通常离心力最好介于325～1310g之间。异丙醇沉淀法操作快速，测序信号清楚，并可用于检测柱分离的回收率。不足之处是，有较高的残留终止剂峰(6～10个)，对序列起始端前20多个碱基峰可产生严重干扰。另外，经常会在序列的196～208位碱基左右出现终止剂杂质峰。CTAB是一种阳离子洗涤剂，价格低廉。其优点是实验操作时间短；不足之处是由于残留终止剂峰的影响，起始端前10～20个碱基峰通常较为杂乱，易造成碱基识别软件发生识别错误；二是在196～208位碱基区域可能会出现终止剂杂质峰。我们建议在CTAB沉淀后，用乙醇再沉淀1次，上述问题便可得到改善。酚/氯仿抽提法较为经济，纯化更彻底，且回收率高，可用于评估柱分离的结果。该法操作的关键在于要使酚∶水∶氯仿(68∶18∶14)在使用前混合完全且成为均相。若抽提完全，对序列起始端10～20个碱基峰产生干扰的残留终止剂峰会减少(大约只有4～5个)。其最大的优点是，在序列中间没 有终止剂杂质峰的干扰。
总之，应用TaqDye DeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit测序时，用户可根据自己的情况选择纯化的方法。经综合考虑，我们认为用酚/氯仿抽提法效果最好，若操作规范，可获得理想的 测序结果。
作者简介：程司女，29岁，助教，硕士生 西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374573
收稿日期：1999-10-08
修回日期：1999-11-16, 百拇医药
单位：程司(第四军医大学中心实验室，陕 西西安710032)；曹云新(第四军医大学中心实验室，陕 西西安710032)；刘智广(第四军医大学中心实验室，陕西西安710032)
关键词：DNA测序；链终止剂；纯化
细胞与分子免疫学杂志000233
中图号：Q78 文献标识码：B
文章编号：1007-8738(2000)02-0177-02
美国Perkin-Elmer(PE)公司生产的373A型DNA自动测序仪的原理，是通过测序反应生成荧光素标记的寡核苷酸，然后进行电泳分离,计算机依据荧光素颜色的不同自动进行实时检测、识别，并分析出所测模板中的每一个碱基。与373A型自动测序仪配套的测序反应试剂盒有两种：一种为DyePrimer(引物标记)，另一种为Dye Deoxy Terminators(双脱氧核苷三磷酸标记)。后者为将4种荧光素分别标记到相应的终止剂-ddATP，ddCTP，ddGTP和ddTTP上。用Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit测序时，往往在测序反应中加入过量的终止剂，促使模板与终止剂充分结合。测序反应完成后，在模板进行凝胶电泳分离之前，若不及时、有效地除去过量的荧光素终止剂，将会对序列的识别和分析产生严重干扰，直接影响测序的结果。目前，除去过量终止剂的方法有：旋转柱分离法、异丙醇沉淀法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀法和酚/氯仿抽提法。这些方法各有优、缺点，我们对4种纯化方法进行了比较，以提供较为理想的除去 过量终止剂的方法。
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1 材料和方法
1.1 材料 373A型DNA测序仪、9600型PCR仪和Taq DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit，均为Perkin-Elmer公司产品。1mL旋转柱为Boehringer-Mannheim公司产品。其它相关试剂均为Sigma公司的产品或国 产分析纯试剂。
1.2 方法 参照PE公司DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit中说
明书提供的去除过量链终止剂的方法，略有改进。
1.2.1 旋转柱分离法参照Boehringer-Mannheim公司的产品说明 书进行操作。
1.2.2 异丙醇沉淀法在20μL反应混合物中，加入40μL异丙醇，离心(6000r/min)15min；弃上清，真空抽干；加700mL/L乙醇500μL，混合均匀，离心(5000r/min)15min；弃上清，真空抽干；重复后两步骤1次。待模板干燥后，加入4μL去离子甲酰胺∶50mmol/LEDTApH8.0(5∶1)混合试剂，混合均匀，上样电泳。
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1.2.3 CTAB沉淀法在20μL反应混合物中，加入50g/LCTAB2.5μL，混合均匀，离心(10000r/min)3～4min。弃上清，加入500μL700mL/L乙醇，充分混和15～30min；再离心(5000r/min)3～4mi
n；弃上清、晾干。加入4μL去离子甲酰胺∶50mmol/LEDTApH8.0( 5∶1)混合试剂，混合均匀，上样电泳。
1.2.4 酚/氯仿抽提法在20μL反应混合物中加入80μL去离子水；用100μL酚∶水∶氯仿(68∶18∶14)混合试剂抽提；离心(6000r/min)，弃去有机相；重复后两步骤1次。向水相加入15μL2mol/LNaAc(pH4.5)和300μL纯乙醇；离心(10000r/min)15min，弃上清，用700mL/L乙醇洗涤、晾干。加入4μL去离子甲酰胺∶50mmol/LEDTApH8.0(5∶1)混合试剂，混合均匀，上样电泳。
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不同纯化方法的效果判断：采用上述4种方法各对20份样品进行纯化，上样电泳后按以下3个指标判断纯化的效果：①序列起始端残留终止剂峰的数目和大小；②可观察到的不受残留终止剂峰干扰的第1个碱基的位置；③是否存在终止剂杂质 峰(常位于196～208位碱基之间)。2结果 分别采用上述4种方法，各对20份样品进行了纯化。经统计测序结果表明，4种纯化方法各有其优、缺点(表1)。
表1 四种纯化方法纯化产物的测序结果比较 纯化方法
在序列起始端
残留终止剂峰
的数目和大小
可观察到的不
受残留终止剂峰
干扰的第1个碱基的位置
, 百拇医药
终止剂杂质峰(常
位于196～208位碱基)
出现的情况
旋转柱分离法
0～5，小到中
1～10
通常不存在
异丙醇沉淀法
6～10，大
～26
存在
CTAB沉淀法
, 百拇医药 0～10，中
10～20
通常不存在
酚/氯仿抽提法
4～5，中
10～20
不存在
3 讨论
根据上述实验结果，我们认为：旋转柱分离法费用高且耗时，有时会造成不连续的测试结果。用该法遇到的最常见问题是残留的终止剂峰(0～5个)，对序列起始端碱基峰可产生干扰。另外，有时在凝胶的部分区域残留着终止剂杂质(系操作因素造成)，使碱基识别系统发生识别错误。为此，建议通过以下措施加以改善：①尽量加样于柱床的中心，避免接触柱的边缘；②注意选择合适的旋转速度。转速的选择可根据公式：g=11.18·r·(r/1000min)2得出，其中g为 离心力，r为旋转半径，r/min为转速。通常离心力最好介于325～1310g之间。异丙醇沉淀法操作快速，测序信号清楚，并可用于检测柱分离的回收率。不足之处是，有较高的残留终止剂峰(6～10个)，对序列起始端前20多个碱基峰可产生严重干扰。另外，经常会在序列的196～208位碱基左右出现终止剂杂质峰。CTAB是一种阳离子洗涤剂，价格低廉。其优点是实验操作时间短；不足之处是由于残留终止剂峰的影响，起始端前10～20个碱基峰通常较为杂乱，易造成碱基识别软件发生识别错误；二是在196～208位碱基区域可能会出现终止剂杂质峰。我们建议在CTAB沉淀后，用乙醇再沉淀1次，上述问题便可得到改善。酚/氯仿抽提法较为经济，纯化更彻底，且回收率高，可用于评估柱分离的结果。该法操作的关键在于要使酚∶水∶氯仿(68∶18∶14)在使用前混合完全且成为均相。若抽提完全，对序列起始端10～20个碱基峰产生干扰的残留终止剂峰会减少(大约只有4～5个)。其最大的优点是，在序列中间没 有终止剂杂质峰的干扰。
总之，应用TaqDye DeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit测序时，用户可根据自己的情况选择纯化的方法。经综合考虑，我们认为用酚/氯仿抽提法效果最好，若操作规范，可获得理想的 测序结果。
作者简介：程司女，29岁，助教，硕士生 西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374573
收稿日期：1999-10-08
修回日期：1999-11-16, 百拇医药