汉坦病毒核蛋白基因片段真核表达载体的构建及鉴定
作者：谢鑫 朱勇 陈丽华 刘飞 欧阳为明 张建平 金伯泉
单位：谢鑫 朱勇 陈丽华 刘飞 欧阳为明 张建平 金伯泉(第四军医大学免疫学教研室，陕西西安710032)
关键词：汉坦病毒；核蛋白；GFP；转染
细胞与分子免疫学杂志000205
摘要:目的 确定特定小鼠MHCI类分子H-2d限制性加工提呈的汉坦病毒核蛋白(NP)抗原表位。方法在计算机预测的基础上，以编码NP的S基因为模板，合成了3个相互重叠的基因片段
，构建了以携带GFP报告基因的pEGFP-N2为载体的重组质粒，并进行了初步表达及鉴定。结果目的基因片段已插入质粒载体，并在转染的真核细胞内成功表达。结论汉坦病毒核蛋白 片段能够被细胞加工提呈。
, http://www.100md.com
中图号:Q282,R393.3+2
文献标识码：A
文章编号：1007-8738(2000)02-0106-03
Construction and identification of eukaryotic expression vector bearing segments of Hataan virus nucleocapsid
protein
XIE Xin ZHU Yong CHEN Li- Hua LIU Fei
(OUYANG Wei- ming, ZHANG Jian- ping, JIN Bo- quan
, 百拇医药
Department of Immunology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China)
Abstract: Aim To identify the exact epitopes of Hantaan virus nucleocapsid protein(NP) presented by murine MHCclass I molecule, H- 2d. Methods We amplified three overlapping gene segments based on computer epitope-predicting software, using the viral genome S encoding NP as template. These three segments were inserted into
, http://www.100md.com eukaryotic expression vector pEGFP- N2. Results The constructs were successfully inserted and expressed.Conclusion The segments can be presented by the transfected cells and the method is a useful tool for epitopedetermination.
Keywords： Hantaan virus; nucleocapsid protein; GFP; transfection
肾综合征出血热是由汉坦病毒感染而引起的一类严重危害我国人民健康的急性传染病。对于出血热的研究既往主要集中于体液免疫，近年发现，诱发机体特异性细胞免疫应答的抗原表位主要定位于病毒S基因所编码的核蛋白(NP)上[1]，但对于小鼠特定MHCI类分子所识别的抗原表位尚未见报道。本文在计算机预测的基础上，成功地构建了含有相互重叠片段的3个 质粒载体，为最终确定抗原表位奠定了基础。
, 百拇医药
1材料和方法
1.1 材料 质粒pBV220/HTV-NP由本校唐都医院传染科黄长形博士惠赠，内含去除了5′端非编码区的1.6Kb HTV 76-118株NPcDNA。PCR产物的连接及测序载体pGEM-T和pUC测序通用引物，均购自Promega公司。PCR产物回收试剂盒及胶回收试剂盒均购自Qiagen公司。真核表达载体pEGFP-N2购自Clontech公司。核酸Marker DL-2000和连接试剂盒(Ver2)购自TaKaRa公司。转染试剂Fugene6购自Roche公司。质粒小量提取试剂盒购自华舜公司。以PE公司ABI PRISM 310型遗 传分析仪测定核酸序列。
1.2 方法 计算机预测及引物设计，利用本室设计的MHCI类分子识别表位预测程序对小鼠H-2d分子加工提呈的抗原表位进行了预测[2]。由起始密码开始，分别设计用以合成1～384，330～762和706～1287位碱基的3对引物，对应的3个目的片段含有预测表位的数目分别是1，2和5个。引物的序列如下：(划线处分 别为EcoRI和SmaI的酶切位点)。
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引物1forward：
5′-CGCGC GAATTC ATG GCA ACT ATG GAG GAA TTAC；
backward：
5′-CCCGGG GGA TGT AAG ATA GAC GAT GAT GC；
引物2 forward：
5′-CGAATTC ATG GAA CCT ACA GGA CAG ACA GC；
backward：
5′-CCCGGG GCT AAC TGC TGC TGT ATC TGG AA；
引物3forward：
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5′-GGCCGCGC GAATTC ATG GAA CAA TGG TTA ATTG；
backward：
5′-CCCGGG GAG TTT CAA AGG CTC TTG GTT GG.
1.3 目的基因片段的扩增和测序 利用常规PCR方法进行目标片段扩增。以纯化质粒pBV220/HTV-NP为模板，以下列体系进行PCR反应：质粒DNA5ng，引物各0.5μg，Taq酶2U，dNTPs2μL，10×buffer5μL，加水至50μL；扩增条件：94°C变性5min，然后94°C1min，68°C1min，72°C延伸1min，循环30次，再72°C延伸5min。取5μL终产物进行100g/L琼脂糖凝胶电泳，并以胶回收试剂盒纯化PCR产物。将其连接至载体pGEM-T，转化JM109菌株。将转化后的菌涂布于含0.05mmol/L IPTG和80mg/LX-Gal的琼脂板上。置37°C培养24h，挑取白色克隆，扩增后小量提取质粒，用EcoR I和Sma I双酶切鉴定及测序。
, 百拇医药
1.4 重组质粒的构建及鉴定 载体为Clontech公司的pEGFP-N2，分别用EcoR I和Sma I双酶切含有3个基因片段的pGEM-T载体和pEGFP-N2，经100g/L琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，以胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段和载体以10∶1的摩尔比混合，加入等体积连接试剂盒中的溶液I于16°C作用3h后，分别转化于E.coli DH 5α菌株。同样，以EcoRI和Sma I双酶切上述连接后的产物，100g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。小量提取后，以1μg质粒：3μlFugene6转染NIH3T3细胞,37°C 50mL/LCO2培养24h后，于荧光显微镜下观察转染的情况。
2 结果
2.1 PCR产物的鉴定 克隆的3个片段的长度为384，433和582bp，分别命名为S1，S2和S3。从PCR反应后的电泳结果可看到，克隆后的片段符合预期的长度(图1)。测序结果与76-118株病毒的读 框序列完全一致(资料未显示)。
, 百拇医药
图1 PCR产物的电泳图
Fig1 Electrophoretic map of PCR products
M:Marker DL-2000;S:Segment.
2.2 重组质粒的构建和鉴定 从双酶切后的结果(图2)可看出，重组质粒EcoR I/Sma I双酶切片段与PCR产物的分 子量相近。
图2 重组质粒的酶切鉴定电泳图
Fig2 Restrictive enzyme analysis of recombinant plasmid
M:Markor DL-2000;R:Recombinant vector；N2:pEGFP-N2.
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2.3 瞬时转染 由于所用载体是pEGFP-N2，插入片段和GFP受同一个调控序列调节，GFP处于插入片段的N端，所以只有在插入片段表达的前提下，GFP(绿荧光蛋白)才能得以表达。结果显示，3个目的基因片段都获得表达，并均匀地分布于细胞浆 中(图3为重组质粒3的荧光照片)。
图3 用重组质粒(R3)瞬时转染的NIH3T3细胞
Fig3 NIH3T3 cells transiently transfected
with recombinat plasmid(R3)
3 讨论
在抗汉坦病毒感染中，特异性CTL在清除病毒感染的细胞中具有重要的作用。以往对汉坦病毒的研究中，主要集中于体液免疫方面。我们的研究表明，汉坦病毒的NP是诱导特异性 CTL杀伤靶细胞的抗原[1]。因此，确定MHCI类分子特异性识别的抗原肽，然后便可利用MHCI类分子/抗原肽四聚体(tetramer)技术，动态观察病程中特异性CTL的变化[3],以及制备汉坦病毒亚单位疫苗均具有重要的意义[4]。由于MHCI类分子的多态性，无法也不可能利用固定的多肽序列作为疫苗的候选对象，而尽量缩小并对亚单位疫苗进行优化，也要求进一步开展此项研究。MHCI类分子一般识别的是9肽，我们所构建的3个片段之间有相互重叠的18个氨基酸，保证了特异性表位读框不会被遗失。
, 百拇医药
利用Clontech公司的绿色荧光蛋白表达系统，一方面可确定转染的基因是否表达及表达的水平，同时可实时判定表达产物在细胞内加工提呈的部位和动态变化；另一方面可利用其表达的neo基因产物进行G418筛选，建立NP基因片段稳定表达的克隆[5]。由于转染基因的产物属于异源蛋白，所以能够被细胞MHCI类分子加工、提呈。这样，在效靶细胞MHCI类分子同型的前提下，可以利用感染动物为模型，分离CD8+ CTL，利用杀伤实 验确定特异性表位的分布。
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39700128
作者简介：谢鑫，男，26岁，硕士生
西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374531 2000byJCellMolImmunolPress
www.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn 返回主列表(ReturntoMainList)
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参考文献：
[1] 张婷婷，朱勇，金伯泉，等 .HFRSV核蛋白诱导产生特异性CTL的实验研究 [J]. 中华微生物与免疫学杂志 ,2000;20(1):23- 25.
[2] 张建平,朱勇, 张婷婷，等 . H2b和H2d单体型小鼠MHCI类分子结合的HFRSV蛋白抗原表位的预测 [J].细胞与分子免疫学杂志,1994; 14(4): 282- 285.
[3] Letvin NL, Schmitz JE, Jordan HL, et al. Cytotoxic T lymphocytes specific for the simian immunodeficiencyvirus[J]. Immunol Rev, 1999; 170:127- 134.
[4] Heather LD. Plasmid DNA expression systems for the purpose of immunization[J]. Current Opin Biochem, 1997;8: 635- 640.
[5] van der Leij FR, Kram AM, Bartelds B, et al. Cytological evidence that the C- terminus of carnitinepalmitoyltransferase I is on the cytosolic face of the mitochondrial outer membrane[J]. Biochem J, 1999;341(Pt3):777- 784.
收稿日期：1999-10-21
修回日期：1999-11-02, http://www.100md.com
单位：谢鑫 朱勇 陈丽华 刘飞 欧阳为明 张建平 金伯泉(第四军医大学免疫学教研室，陕西西安710032)
关键词：汉坦病毒；核蛋白；GFP；转染
细胞与分子免疫学杂志000205
摘要:目的 确定特定小鼠MHCI类分子H-2d限制性加工提呈的汉坦病毒核蛋白(NP)抗原表位。方法在计算机预测的基础上，以编码NP的S基因为模板，合成了3个相互重叠的基因片段
，构建了以携带GFP报告基因的pEGFP-N2为载体的重组质粒，并进行了初步表达及鉴定。结果目的基因片段已插入质粒载体，并在转染的真核细胞内成功表达。结论汉坦病毒核蛋白 片段能够被细胞加工提呈。
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中图号:Q282,R393.3+2
文献标识码：A
文章编号：1007-8738(2000)02-0106-03
Construction and identification of eukaryotic expression vector bearing segments of Hataan virus nucleocapsid
protein
XIE Xin ZHU Yong CHEN Li- Hua LIU Fei
(OUYANG Wei- ming, ZHANG Jian- ping, JIN Bo- quan
, 百拇医药
Department of Immunology, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China)
Abstract: Aim To identify the exact epitopes of Hantaan virus nucleocapsid protein(NP) presented by murine MHCclass I molecule, H- 2d. Methods We amplified three overlapping gene segments based on computer epitope-predicting software, using the viral genome S encoding NP as template. These three segments were inserted into
, http://www.100md.com eukaryotic expression vector pEGFP- N2. Results The constructs were successfully inserted and expressed.Conclusion The segments can be presented by the transfected cells and the method is a useful tool for epitopedetermination.
Keywords： Hantaan virus; nucleocapsid protein; GFP; transfection
肾综合征出血热是由汉坦病毒感染而引起的一类严重危害我国人民健康的急性传染病。对于出血热的研究既往主要集中于体液免疫，近年发现，诱发机体特异性细胞免疫应答的抗原表位主要定位于病毒S基因所编码的核蛋白(NP)上[1]，但对于小鼠特定MHCI类分子所识别的抗原表位尚未见报道。本文在计算机预测的基础上，成功地构建了含有相互重叠片段的3个 质粒载体，为最终确定抗原表位奠定了基础。
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1材料和方法
1.1 材料 质粒pBV220/HTV-NP由本校唐都医院传染科黄长形博士惠赠，内含去除了5′端非编码区的1.6Kb HTV 76-118株NPcDNA。PCR产物的连接及测序载体pGEM-T和pUC测序通用引物，均购自Promega公司。PCR产物回收试剂盒及胶回收试剂盒均购自Qiagen公司。真核表达载体pEGFP-N2购自Clontech公司。核酸Marker DL-2000和连接试剂盒(Ver2)购自TaKaRa公司。转染试剂Fugene6购自Roche公司。质粒小量提取试剂盒购自华舜公司。以PE公司ABI PRISM 310型遗 传分析仪测定核酸序列。
1.2 方法 计算机预测及引物设计，利用本室设计的MHCI类分子识别表位预测程序对小鼠H-2d分子加工提呈的抗原表位进行了预测[2]。由起始密码开始，分别设计用以合成1～384，330～762和706～1287位碱基的3对引物，对应的3个目的片段含有预测表位的数目分别是1，2和5个。引物的序列如下：(划线处分 别为EcoRI和SmaI的酶切位点)。
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引物1forward：
5′-CGCGC GAATTC ATG GCA ACT ATG GAG GAA TTAC；
backward：
5′-CCCGGG GGA TGT AAG ATA GAC GAT GAT GC；
引物2 forward：
5′-CGAATTC ATG GAA CCT ACA GGA CAG ACA GC；
backward：
5′-CCCGGG GCT AAC TGC TGC TGT ATC TGG AA；
引物3forward：
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5′-GGCCGCGC GAATTC ATG GAA CAA TGG TTA ATTG；
backward：
5′-CCCGGG GAG TTT CAA AGG CTC TTG GTT GG.
1.3 目的基因片段的扩增和测序 利用常规PCR方法进行目标片段扩增。以纯化质粒pBV220/HTV-NP为模板，以下列体系进行PCR反应：质粒DNA5ng，引物各0.5μg，Taq酶2U，dNTPs2μL，10×buffer5μL，加水至50μL；扩增条件：94°C变性5min，然后94°C1min，68°C1min，72°C延伸1min，循环30次，再72°C延伸5min。取5μL终产物进行100g/L琼脂糖凝胶电泳，并以胶回收试剂盒纯化PCR产物。将其连接至载体pGEM-T，转化JM109菌株。将转化后的菌涂布于含0.05mmol/L IPTG和80mg/LX-Gal的琼脂板上。置37°C培养24h，挑取白色克隆，扩增后小量提取质粒，用EcoR I和Sma I双酶切鉴定及测序。
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1.4 重组质粒的构建及鉴定 载体为Clontech公司的pEGFP-N2，分别用EcoR I和Sma I双酶切含有3个基因片段的pGEM-T载体和pEGFP-N2，经100g/L琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，以胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段和载体以10∶1的摩尔比混合，加入等体积连接试剂盒中的溶液I于16°C作用3h后，分别转化于E.coli DH 5α菌株。同样，以EcoRI和Sma I双酶切上述连接后的产物，100g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。小量提取后，以1μg质粒：3μlFugene6转染NIH3T3细胞,37°C 50mL/LCO2培养24h后，于荧光显微镜下观察转染的情况。
2 结果
2.1 PCR产物的鉴定 克隆的3个片段的长度为384，433和582bp，分别命名为S1，S2和S3。从PCR反应后的电泳结果可看到，克隆后的片段符合预期的长度(图1)。测序结果与76-118株病毒的读 框序列完全一致(资料未显示)。
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图1 PCR产物的电泳图
Fig1 Electrophoretic map of PCR products
M:Marker DL-2000;S:Segment.
2.2 重组质粒的构建和鉴定 从双酶切后的结果(图2)可看出，重组质粒EcoR I/Sma I双酶切片段与PCR产物的分 子量相近。
图2 重组质粒的酶切鉴定电泳图
Fig2 Restrictive enzyme analysis of recombinant plasmid
M:Markor DL-2000;R:Recombinant vector；N2:pEGFP-N2.
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2.3 瞬时转染 由于所用载体是pEGFP-N2，插入片段和GFP受同一个调控序列调节，GFP处于插入片段的N端，所以只有在插入片段表达的前提下，GFP(绿荧光蛋白)才能得以表达。结果显示，3个目的基因片段都获得表达，并均匀地分布于细胞浆 中(图3为重组质粒3的荧光照片)。
图3 用重组质粒(R3)瞬时转染的NIH3T3细胞
Fig3 NIH3T3 cells transiently transfected
with recombinat plasmid(R3)
3 讨论
在抗汉坦病毒感染中，特异性CTL在清除病毒感染的细胞中具有重要的作用。以往对汉坦病毒的研究中，主要集中于体液免疫方面。我们的研究表明，汉坦病毒的NP是诱导特异性 CTL杀伤靶细胞的抗原[1]。因此，确定MHCI类分子特异性识别的抗原肽，然后便可利用MHCI类分子/抗原肽四聚体(tetramer)技术，动态观察病程中特异性CTL的变化[3],以及制备汉坦病毒亚单位疫苗均具有重要的意义[4]。由于MHCI类分子的多态性，无法也不可能利用固定的多肽序列作为疫苗的候选对象，而尽量缩小并对亚单位疫苗进行优化，也要求进一步开展此项研究。MHCI类分子一般识别的是9肽，我们所构建的3个片段之间有相互重叠的18个氨基酸，保证了特异性表位读框不会被遗失。
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利用Clontech公司的绿色荧光蛋白表达系统，一方面可确定转染的基因是否表达及表达的水平，同时可实时判定表达产物在细胞内加工提呈的部位和动态变化；另一方面可利用其表达的neo基因产物进行G418筛选，建立NP基因片段稳定表达的克隆[5]。由于转染基因的产物属于异源蛋白，所以能够被细胞MHCI类分子加工、提呈。这样，在效靶细胞MHCI类分子同型的前提下，可以利用感染动物为模型，分离CD8+ CTL，利用杀伤实 验确定特异性表位的分布。
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39700128
作者简介：谢鑫，男，26岁，硕士生
西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374531 2000byJCellMolImmunolPress
www.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn 返回主列表(ReturntoMainList)
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参考文献：
[1] 张婷婷，朱勇，金伯泉，等 .HFRSV核蛋白诱导产生特异性CTL的实验研究 [J]. 中华微生物与免疫学杂志 ,2000;20(1):23- 25.
[2] 张建平,朱勇, 张婷婷，等 . H2b和H2d单体型小鼠MHCI类分子结合的HFRSV蛋白抗原表位的预测 [J].细胞与分子免疫学杂志,1994; 14(4): 282- 285.
[3] Letvin NL, Schmitz JE, Jordan HL, et al. Cytotoxic T lymphocytes specific for the simian immunodeficiencyvirus[J]. Immunol Rev, 1999; 170:127- 134.
[4] Heather LD. Plasmid DNA expression systems for the purpose of immunization[J]. Current Opin Biochem, 1997;8: 635- 640.
[5] van der Leij FR, Kram AM, Bartelds B, et al. Cytological evidence that the C- terminus of carnitinepalmitoyltransferase I is on the cytosolic face of the mitochondrial outer membrane[J]. Biochem J, 1999;341(Pt3):777- 784.
收稿日期：1999-10-21
修回日期：1999-11-02, http://www.100md.com