单纯疱疹病毒糖蛋白C模拟表位mgC真核表达载体的构建和表达
作者：杨乔欣 马文煜 余颖
单位：杨乔欣(第四军医大学微生物学教研室 ，陕西西安710032)；马文煜(第四军医大学微生物学教研室 ，陕西西安710032)；余颖(第四军医大学微生物学教研室 ，陕西西安710032)
关键词：单纯疱疹病毒；糖蛋白；表位；真核表达
细胞与分子免疫学杂志000203
摘要：目的为鉴定单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白C(gC)一个短肽模拟表位mgC基因作为HSVDNA表位疫苗的可能性，需构建含此表位的真核载体。方法合成编码该表位的单链DNA，经不对称PCR扩增后，克隆入真核表达载体pcDNA3.1中，并在CHO细胞中表达。用RT-PCR法鉴定mRNA的表达。结果含mgC基因的真核表达载体在哺乳动物细胞中可以在mRNA水平表达外源蛋白。结论成功地构建了HSVgC中短肽模拟表位mgC基因的真核表达载体，为进一 步探讨该HSV模拟表位的功能奠定了基础。
, 百拇医药
中图号：Q786
文献标识码：A
文章编号：1007-8738(2000)02-0100-03
Construction and expression of the eukaryotic vector of mimotope mgC derived from glycoprotein C of Herpessimplex virus
YANG Qiao- xin MA Wen- yu YU Ying
(Department of Microbiology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032, Shaanxi Province, China )
, 百拇医药
Keywords: herpes simplex virus; glycoprotein; epitope;eukaryotic expression
单纯疱疹病毒(HSV)属有囊膜的双链DNA病毒，在目前已发现的其11个糖蛋白中，有近一半可诱发机体高强度的保护性免疫，特别是糖蛋白D和C〔1〕。因此，HSV预防性和治疗性疫苗研究的焦点，主要集中在HSV糖蛋白亚单位疫苗和表位疫苗的研究上。我们利用本室制备的具有高保护性的1株抗HSVgC的型共同性mAb淘筛噬菌体12肽随机肽库，找到了该mAb针对的模拟表位，为进一步鉴定该表位基因作为DNA疫苗的可行性，特构建了此表 位基因的真核表达载体。
1材料和方法
1.1材料 试剂来源：制性内切酶、T4DNA连接酶购自华美生物工程公司。PCR反应试剂为日本Takara公司产品。TRIZOL总RNA提取试剂盒和mRNA逆转录试剂盒，均购自Gibco公司。模拟表位的来源：作者用抗HSV糖蛋C(gC)的mAb1A12淘筛噬菌体随机肽库，获得了HSVgC的模拟表位mgC，由12个氨基酸组成：ADAKVWIIHPGS(另文详述)。目的片段和引物的合成：由Takara公司合成的包含mgC基因的单链DNA片段共69个碱基，起始码附近设计有可促进载体pcDNA3.1表达的Kozek结构，目的片段两端含有保护碱基和HindⅢ,BamHI酶切位点，并设计了两条扩增引物：引物(P1)：5′-GGG AGA TCT GGG AAG CTT GAG-3′；引物(P2)：5′-CCG GCT AGC GGG GAT CCG CGA ACC ACG-3′.mgC基因外源片段：5′-GGG AAG CTT GAG GAA ACA ACT ATG GCG GAT GCG AAG GTT TGG ATT ATT CAT CGT GGT TCG CGG ATC CCC-3′,予列下划线处为mgC基因序列。
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1.2方法
1.2.1目的基因的扩增 采用不对称PCR法。以单链mgC基因为模板，分两步扩增。第1轮PCR反应体系：P2引物100pmol,模板7.5pmol,加常规量dNTP，Mg2+及Taq酶。反应条件：94℃45s,58℃30s,72℃ 30s,共60个循环，再于72℃延伸7min。第2轮PCR反应体系：第1轮反应产物加入P1引物90pmol,补足dNTP及Taq酶，反应条件：94℃45 s,52℃30s,72℃30s,共10个循环。
1.2.2PCR产物的酶切鉴定及克隆 参照文献〔3〕进行。取PCR产物纯化后,用HindⅢ,BamHI双酶切，30g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。同时制备载体质粒pcDNA3.1,重组DNA,转化入EcoliDH5α中，经双酶切及序列测定鉴定阳性克隆。
1.2.3转染宿主细胞 将重组质粒mgC/pcDNA3.1用BglⅡ酶切成线性，用低压电穿孔法转染5×106个CHO细胞(Bio-RadGenepulser II 电穿孔仪)，在含200mL/L小牛血清的DMEM中培养48h，实验中设 空白质粒作为对照。
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1.2.4目的基因片段表达的鉴定 用TRIZOL总RNA提取试剂盒，按说明书提取CHO细胞总RNA，溶于10μL水中。用逆转录PCR法合成cDNA第1链，总反应体积20μL。取5μL作为模板，用引物P2,P3(5′-CCG GCT AGC GGG GAT CCG CGA ACC ACG-3′)扩增cDNA，观察结果。
2结果
2.1mgC目的基因片段的扩增 用不对称PCR法，分两步扩增单链目的基因片段mgC。取5μL扩增产物经30g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见靠近100bP处有1条清晰带(图1)。
图1mgC基因片段的扩增
Fig1 Amplification of mgC gene
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1:mgC gene;2:PCR-marker(2000,1000,750,500,200
and 100bp from top to bottom).
2.2重组体mgC/pcDNA3.1的构建及鉴定 PCR产物双酶切后，用酚、氯仿抽提，以10∶1的比例与质粒pcDNA3.1连接16h。用连接产物转化DH5α后，挑取4个菌落，提取质粒，经BamHI，Hin
dⅢ双酶切鉴定，其中有1个阳性克隆切下略小于100bp的片段，命名为mgC/pcDNA(图2)。
图2重组克隆mgC/pcDNA3.1的酶切鉴定
Fig2 Identification of recombinant clone
, 百拇医药
mgC/pcDNA3.1 by BamH Ⅰ and Hind Ⅲ digestion
1:PCR-marker(2000,1000,750,500,200and100bp
from top to bottom);2:Posi tive clone.
2.3测序鉴定 挑取阳性克隆，以T7启动子通用引物作为引物，用PE公司的373DNA全自动测序仪测序，结果显示外源基因片段完全正确插入载体中。
2.4目的基因转录的RT-PCR鉴定 CHO细胞转染后48h，有约35%的细胞死亡。将其余细胞提取总RNA，经电泳鉴定表明，提取的RNA未分解。经RT-PCR后，取10μL电泳，可见近100bP处有1条
带，对照组(只转染空载体pcDNA)未见任何扩增条带(图3)。
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图3 mgC cDNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig3 Agarose gel electrophorosis of amplified mgC cDNA
1:PCR-marker;2:Experimental group;3:Control group.
3讨论
HSV是严重危害人类健康、可引起人类多种疾病的常见病原体。近年来对其研究日趋深入，特别是对其囊膜糖蛋白的分子结构和免疫学活性的研究已成为HSV的研究重点。利用其囊膜糖蛋白的高免疫原性研制的治疗性亚单位疫苗已取得了一定的进展。1997年，Stanberry等以克隆表达的HSV-2gD2抗原加氢氧化铝佐剂对生殖道疱疹患者进行临床双盲治疗试验，取得了一定效果，证明HSV糖蛋白疫苗可改变患者的临床病程〔4〕。但HSV糖蛋白均较大，如gC含有511个氨基酸，其中极可能存在着抑制性表位甚或是毒性表位等对保护性免疫不利的结构。现代免疫理论认为，天然蛋白抗原在诱发免疫应答时，不能满足清除病原体的需要，其原因可能是隐匿的具有保护性功能的表位未能表达，因而诱发的保护性免疫不够强大，或是所诱发的免疫应答发生了免疫偏移。因此，诱发有效的保护性免疫应归于一组表位的合理组合与搭配，这已表位免疫学研究成为疫苗研究的发展方向〔5〕。
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新近研究表明，噬菌体表达的线型多肽与大分子抗原空间依赖性表位可引起相同特异性的强免疫应答，而且可模拟糖基化表位，尽管它们的氨基酸顺序可能完全不同，这就是所谓的模拟表位〔6〕。本研究所针对的HSVgC模拟表位mgC，是我们用1株高保护活性的抗gCmAb筛选噬菌体随机肽库而获得的12个氨基酸的短肽。该短肽可特异与抗HSVgC的1株mAb产生特异性反应，且用其免疫小鼠后可诱生抗HSV的抗体(另文报道)。mgC基因作为核酸疫苗免疫动物是否具有保护活性尚不清楚，因此，我们构建了mgC基因的真核表达载体，旨在对这一表位做进一 步的研究。
本研究的难点在于小片段的DNA在纯化和克隆中容易丢失，且不易观察。研究中我们发现，当DNA片段与载体的比例大于5∶1时，短片段基因(〈100bp)可成功地插入较大片段的载体
中；且在30g/L的琼脂糖凝胶电泳后，于10min之内可清楚地看到此短片段；酚、氯仿抽提亦可获得较满意的回收效果，证明50～100bp的短片段基因无须特殊方式也可成功地与载体重组。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39770040
作者简介：杨乔欣，男，31岁，博士生西安市长乐西路17号,Tel.(029)3374526 Email.wswx@fmmu.edu.cn2000byJCellMolImmunolPress www.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
参考文献：
〔1〕Mcclements WL，Armstrong ME,Keys RD,et al.Immunization with DNA vaccines encoding gD or gB,alone or in combination,induces protective immunity in animal models of HSV 2 disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93(21):11414-11420.
, 百拇医药
〔2〕Nass PH, Elkins KL, Weir JP. Antibody response and protective capacity of plasmid vaccines expressing three different herpes simplex virus glycoproteins〔J〕.J Infect Dis,1998;178(3):611-617.
〔3〕Sambrook J,Fretsch EF,Maniatis T.Molecular cloning,a laboratory manual〔M〕.New York:Cold Spring Harbor Labortory Press,1989:5-82.
〔4〕Bernstein DI,Stanberry LR.Herpes simplex virus vaccines〔J〕.Vaccine,1999;17:1681-1689.
, http://www.100md.com
〔5〕朱锡华,吴玉章.对表位生物学研究的认识和体会〔J〕.上海免疫学杂志,1998；18(1)：1-2.
〔6〕Heiskanen T,Lundkvist A,Soliymani R,et al.Phage-displayed peptides mimicking the discontinuous neutralization sites of puumala hantavirus envelope glycoproteins〔J〕.Virology,1999;262(2):321-332.
收稿日期：2000-01-07
修回日期：2000-01-30, 百拇医药
单位：杨乔欣(第四军医大学微生物学教研室 ，陕西西安710032)；马文煜(第四军医大学微生物学教研室 ，陕西西安710032)；余颖(第四军医大学微生物学教研室 ，陕西西安710032)
关键词：单纯疱疹病毒；糖蛋白；表位；真核表达
细胞与分子免疫学杂志000203
摘要：目的为鉴定单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白C(gC)一个短肽模拟表位mgC基因作为HSVDNA表位疫苗的可能性，需构建含此表位的真核载体。方法合成编码该表位的单链DNA，经不对称PCR扩增后，克隆入真核表达载体pcDNA3.1中，并在CHO细胞中表达。用RT-PCR法鉴定mRNA的表达。结果含mgC基因的真核表达载体在哺乳动物细胞中可以在mRNA水平表达外源蛋白。结论成功地构建了HSVgC中短肽模拟表位mgC基因的真核表达载体，为进一 步探讨该HSV模拟表位的功能奠定了基础。
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中图号：Q786
文献标识码：A
文章编号：1007-8738(2000)02-0100-03
Construction and expression of the eukaryotic vector of mimotope mgC derived from glycoprotein C of Herpessimplex virus
YANG Qiao- xin MA Wen- yu YU Ying
(Department of Microbiology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032, Shaanxi Province, China )
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Keywords: herpes simplex virus; glycoprotein; epitope;eukaryotic expression
单纯疱疹病毒(HSV)属有囊膜的双链DNA病毒，在目前已发现的其11个糖蛋白中，有近一半可诱发机体高强度的保护性免疫，特别是糖蛋白D和C〔1〕。因此，HSV预防性和治疗性疫苗研究的焦点，主要集中在HSV糖蛋白亚单位疫苗和表位疫苗的研究上。我们利用本室制备的具有高保护性的1株抗HSVgC的型共同性mAb淘筛噬菌体12肽随机肽库，找到了该mAb针对的模拟表位，为进一步鉴定该表位基因作为DNA疫苗的可行性，特构建了此表 位基因的真核表达载体。
1材料和方法
1.1材料 试剂来源：制性内切酶、T4DNA连接酶购自华美生物工程公司。PCR反应试剂为日本Takara公司产品。TRIZOL总RNA提取试剂盒和mRNA逆转录试剂盒，均购自Gibco公司。模拟表位的来源：作者用抗HSV糖蛋C(gC)的mAb1A12淘筛噬菌体随机肽库，获得了HSVgC的模拟表位mgC，由12个氨基酸组成：ADAKVWIIHPGS(另文详述)。目的片段和引物的合成：由Takara公司合成的包含mgC基因的单链DNA片段共69个碱基，起始码附近设计有可促进载体pcDNA3.1表达的Kozek结构，目的片段两端含有保护碱基和HindⅢ,BamHI酶切位点，并设计了两条扩增引物：引物(P1)：5′-GGG AGA TCT GGG AAG CTT GAG-3′；引物(P2)：5′-CCG GCT AGC GGG GAT CCG CGA ACC ACG-3′.mgC基因外源片段：5′-GGG AAG CTT GAG GAA ACA ACT ATG GCG GAT GCG AAG GTT TGG ATT ATT CAT CGT GGT TCG CGG ATC CCC-3′,予列下划线处为mgC基因序列。
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1.2方法
1.2.1目的基因的扩增 采用不对称PCR法。以单链mgC基因为模板，分两步扩增。第1轮PCR反应体系：P2引物100pmol,模板7.5pmol,加常规量dNTP，Mg2+及Taq酶。反应条件：94℃45s,58℃30s,72℃ 30s,共60个循环，再于72℃延伸7min。第2轮PCR反应体系：第1轮反应产物加入P1引物90pmol,补足dNTP及Taq酶，反应条件：94℃45 s,52℃30s,72℃30s,共10个循环。
1.2.2PCR产物的酶切鉴定及克隆 参照文献〔3〕进行。取PCR产物纯化后,用HindⅢ,BamHI双酶切，30g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。同时制备载体质粒pcDNA3.1,重组DNA,转化入EcoliDH5α中，经双酶切及序列测定鉴定阳性克隆。
1.2.3转染宿主细胞 将重组质粒mgC/pcDNA3.1用BglⅡ酶切成线性，用低压电穿孔法转染5×106个CHO细胞(Bio-RadGenepulser II 电穿孔仪)，在含200mL/L小牛血清的DMEM中培养48h，实验中设 空白质粒作为对照。
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1.2.4目的基因片段表达的鉴定 用TRIZOL总RNA提取试剂盒，按说明书提取CHO细胞总RNA，溶于10μL水中。用逆转录PCR法合成cDNA第1链，总反应体积20μL。取5μL作为模板，用引物P2,P3(5′-CCG GCT AGC GGG GAT CCG CGA ACC ACG-3′)扩增cDNA，观察结果。
2结果
2.1mgC目的基因片段的扩增 用不对称PCR法，分两步扩增单链目的基因片段mgC。取5μL扩增产物经30g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见靠近100bP处有1条清晰带(图1)。
图1mgC基因片段的扩增
Fig1 Amplification of mgC gene
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1:mgC gene;2:PCR-marker(2000,1000,750,500,200
and 100bp from top to bottom).
2.2重组体mgC/pcDNA3.1的构建及鉴定 PCR产物双酶切后，用酚、氯仿抽提，以10∶1的比例与质粒pcDNA3.1连接16h。用连接产物转化DH5α后，挑取4个菌落，提取质粒，经BamHI，Hin
dⅢ双酶切鉴定，其中有1个阳性克隆切下略小于100bp的片段，命名为mgC/pcDNA(图2)。
图2重组克隆mgC/pcDNA3.1的酶切鉴定
Fig2 Identification of recombinant clone
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mgC/pcDNA3.1 by BamH Ⅰ and Hind Ⅲ digestion
1:PCR-marker(2000,1000,750,500,200and100bp
from top to bottom);2:Posi tive clone.
2.3测序鉴定 挑取阳性克隆，以T7启动子通用引物作为引物，用PE公司的373DNA全自动测序仪测序，结果显示外源基因片段完全正确插入载体中。
2.4目的基因转录的RT-PCR鉴定 CHO细胞转染后48h，有约35%的细胞死亡。将其余细胞提取总RNA，经电泳鉴定表明，提取的RNA未分解。经RT-PCR后，取10μL电泳，可见近100bP处有1条
带，对照组(只转染空载体pcDNA)未见任何扩增条带(图3)。
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图3 mgC cDNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig3 Agarose gel electrophorosis of amplified mgC cDNA
1:PCR-marker;2:Experimental group;3:Control group.
3讨论
HSV是严重危害人类健康、可引起人类多种疾病的常见病原体。近年来对其研究日趋深入，特别是对其囊膜糖蛋白的分子结构和免疫学活性的研究已成为HSV的研究重点。利用其囊膜糖蛋白的高免疫原性研制的治疗性亚单位疫苗已取得了一定的进展。1997年，Stanberry等以克隆表达的HSV-2gD2抗原加氢氧化铝佐剂对生殖道疱疹患者进行临床双盲治疗试验，取得了一定效果，证明HSV糖蛋白疫苗可改变患者的临床病程〔4〕。但HSV糖蛋白均较大，如gC含有511个氨基酸，其中极可能存在着抑制性表位甚或是毒性表位等对保护性免疫不利的结构。现代免疫理论认为，天然蛋白抗原在诱发免疫应答时，不能满足清除病原体的需要，其原因可能是隐匿的具有保护性功能的表位未能表达，因而诱发的保护性免疫不够强大，或是所诱发的免疫应答发生了免疫偏移。因此，诱发有效的保护性免疫应归于一组表位的合理组合与搭配，这已表位免疫学研究成为疫苗研究的发展方向〔5〕。
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新近研究表明，噬菌体表达的线型多肽与大分子抗原空间依赖性表位可引起相同特异性的强免疫应答，而且可模拟糖基化表位，尽管它们的氨基酸顺序可能完全不同，这就是所谓的模拟表位〔6〕。本研究所针对的HSVgC模拟表位mgC，是我们用1株高保护活性的抗gCmAb筛选噬菌体随机肽库而获得的12个氨基酸的短肽。该短肽可特异与抗HSVgC的1株mAb产生特异性反应，且用其免疫小鼠后可诱生抗HSV的抗体(另文报道)。mgC基因作为核酸疫苗免疫动物是否具有保护活性尚不清楚，因此，我们构建了mgC基因的真核表达载体，旨在对这一表位做进一 步的研究。
本研究的难点在于小片段的DNA在纯化和克隆中容易丢失，且不易观察。研究中我们发现，当DNA片段与载体的比例大于5∶1时，短片段基因(〈100bp)可成功地插入较大片段的载体
中；且在30g/L的琼脂糖凝胶电泳后，于10min之内可清楚地看到此短片段；酚、氯仿抽提亦可获得较满意的回收效果，证明50～100bp的短片段基因无须特殊方式也可成功地与载体重组。
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基金项目：国家自然科学基金资助，No.39770040
作者简介：杨乔欣，男，31岁，博士生西安市长乐西路17号,Tel.(029)3374526 Email.wswx@fmmu.edu.cn2000byJCellMolImmunolPress www.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
参考文献：
〔1〕Mcclements WL，Armstrong ME,Keys RD,et al.Immunization with DNA vaccines encoding gD or gB,alone or in combination,induces protective immunity in animal models of HSV 2 disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93(21):11414-11420.
, 百拇医药
〔2〕Nass PH, Elkins KL, Weir JP. Antibody response and protective capacity of plasmid vaccines expressing three different herpes simplex virus glycoproteins〔J〕.J Infect Dis,1998;178(3):611-617.
〔3〕Sambrook J,Fretsch EF,Maniatis T.Molecular cloning,a laboratory manual〔M〕.New York:Cold Spring Harbor Labortory Press,1989:5-82.
〔4〕Bernstein DI,Stanberry LR.Herpes simplex virus vaccines〔J〕.Vaccine,1999;17:1681-1689.
, http://www.100md.com
〔5〕朱锡华,吴玉章.对表位生物学研究的认识和体会〔J〕.上海免疫学杂志,1998；18(1)：1-2.
〔6〕Heiskanen T,Lundkvist A,Soliymani R,et al.Phage-displayed peptides mimicking the discontinuous neutralization sites of puumala hantavirus envelope glycoproteins〔J〕.Virology,1999;262(2):321-332.
收稿日期：2000-01-07
修回日期：2000-01-30, 百拇医药