类风湿关节炎患者关节中Th1/Th2型细胞因子的模式及临床意义
作者：张浩 朱平 王彦宏
单位：张浩(第四军医大学西京医院临床免疫科，陕西西安710032)；朱平(第四军医大学西京医院临床免疫科，陕西西安710032)；王彦宏(第四军医大学西京医院临床免疫科，陕西西安710032)
关键词：类风湿关节炎;Th1/Th2细胞；酶联免疫斑点法；细胞因子
细胞与分子免疫学杂志000319
摘要：目的分析类风湿关节炎(RA)患者滑膜液及外周血中Th1/Th2型细胞因子网络的偏移及其在疾病过程中的意义。方法用酶联免疫斑点法(enzymelinkedimmunospotassay,ELISPOT)，检测RA患者滑膜液单个核细胞(SFMC)和外周血单个核细胞(PBMC)中的Th1和Th2细胞，并分析Th1/Th2细胞的比值与血沉(ESR)和C反应蛋白(CRP)的相关性。结果与PBMC相比较，RA患者SFMC中CD3+T细胞的百分率，Th1细胞及Th1/Th2细胞的比值显著升高(P∨0.01)，且此比值与患者的ESR和CRP均呈正相关(分别为r=0.84,P∨0.01和r=0.74,P∨0.02)。结论在RA患者关节中Th1细胞明显增多并占优势，Th1/Th2细胞的比值与疾病的活动程度明显相关，Th1/Th2细胞的平衡在RA的发病机制及疾病进展中可能具有重要的作用。
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中图号：R593.2 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0237-03
Study on the Th1/Th2 cytokine profile in joints of patients with rheumatoid arthritis and its clinical significance
ZHANG Hao ZHU Ping WANG Yan-hong
(Department of Clinical Immunology， Xijing Hospital， Fourth Military Medical University， Xi'an 710032， Shaanxi Province,China)
Abstract: Aim To analyize the shift of Th1/Th2 type cytokine profile in synovial fluid and peripheral blood from patients with rheumatoid arthritis (RA) and its clinical significance. Methods Th1 and Th2 cells in synovial fluid mononuclear cells (SFMC) and paired peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 12 RA patients were detected by enzyme linked immunospot assay (ELISPOT). Correlation of Th1/Th2 cell ratio with erythrocyte sedimentation rate (ESR) and C reactive protein(CRP) were analyized. Results The mean percentages of CD3+ T cells,Th1 cells and Th1/Th2 cell ratio were significantly increased in the SFMC as compared with PBMC(P∨ 0.01). The Th1/Th2 cell ratio of SFMC in RA patients was correlated significantly with ESR and CRP(r=0.84, P∨ 0.01 and r=0.74,P∨ 0.02, respectively). Conclusion The Th1 cells in joints of RA patients increased and predominated. Th1/Th2 ratio correlated markedly with the disease activity.Th1/Th2 cell balance has important implications for the pathogensis of RA.
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Keywords: rheumatoid arthritis;Th1/Th2 cell;ELISPOT; cytokine ▲
类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是一种以慢性滑膜炎为主要特征的全身性疾病，发病机制尚不清楚。近年研究表明，辅助性T细胞(Th1/Th2)在RA的发病机制中有重要的作用〔1〕，并在基因水平上分析了RA患者Th1/Th2型细胞因子的表达〔2〕。为了深入探讨Th1/Th2细胞及其分泌的细胞因子在RA患者体内的表达模式及临床意义，我们采用ELISPOT法，在单细胞水平检测了RA患者滑膜液中单个核细胞(SFMC)和外周血单个核细胞(PBMC)中Th1/Th2细胞的分布，并分析了其与患者疾病活动程度的相关性。
1 材料和方法
1.1材料SFMC及PBMC取自12例活动期RA患者〔平均受累关节为(5.2±3.6)个，病程为(8.4±7.5)年,ESR为(61.2±24.2)mm/h，CRP为(32.2±17.5)mg/L〕。10例类风湿因子(RF)阳性，2例阴性。RA根据1987年美国风湿病学会(ACR)修订的标准而确诊〔3〕。滑膜液由膝关节无菌穿刺抽取，平均白细胞计数为(17.3.±9.7×109)个/L。以5份健康成人血液标本的PBMC作为阴性对照。CD3/CD4/CD8检测试剂盒购自北京邦定泰克公司。小鼠抗人IFN-γ和抗人IL-4mAb购自美国RD公司。生物素链霉卵白素/碱性磷酸酶试剂盒，购自LabVision公司。多聚甲醛、皂素、PMA，离子霉素、莫能菌素和透明质酸酶，均购自Sigma公司。淋巴细胞分离液为上海第一生化制品厂产品，RPMI1640培养液为Gibco公司产品。
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1.2方法
1.2.1SFMC和PBMC的分离和培养取EDTA抗凝的滑膜液，每mL加入10U透明质酸酶，37℃孵育30min以降低粘度。以等量生理盐水稀释后,用淋巴细胞分离液按密度梯度离心法分离SFMC。PBMC按常规密度梯度离心法分离。将所获SFMC或PBMC以2×109/L的密度悬浮于含100mL/L胎牛血清(FCS)的RPMI1640中。取24孔培养板(NUNC，丹麦)，每孔加1mL细胞悬液，20μg/LPMA，1μmol/L离子霉素(ionomycin)及2μmol/L莫能菌素(monensin)，于37℃50mL/LCO2条件下培养6h。收集培养的细胞，以PBS洗两次，用离心涂片机制成细胞涂片，检测细胞的表面标志及细胞内的细胞因子。
1.2.2细胞表面标志的检测SFMC和PBMC表面CD3，CD4和CD8的检测，采用邦定公司的T淋巴细胞亚群检测试剂盒(APAAP法)，按说明书进行。细胞表面有红色标记物者即为阳性细胞。
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1.2.3细胞内细胞因子的检测按文献〔4〕的方法进行，主要步骤为：细胞涂片用40mL/L多聚甲醛(PFA)固定30min，再以100mL/L正常羊血清封闭10min，加1g/L皂素PBS150μL通透10min，以使抗细胞因子单抗易于进入细胞内，然后加抗IFN-γmAb0.5μg或抗IL4mAb0.25μg(阴性对照用PBS代替)，4℃反应过夜。用PBS冲洗后，每片加生物素标记的羊抗小鼠IgG(二抗)50μL，室温反应30min。最后加链霉卵白素-碱性磷酸酶复合物50μL，室温反应30min，用坚固红溶液显色、苏木精复染后，甘油明胶封片、镜检(日本NikonOPTIPHOT)并照像。结果用
±s表示，并做t检验。Th1/Th2细胞的比值与ESR和CRP的结果做直线相关分析。
2 结果
2.1SFMC和PBMC的表型分析对12例RA患者SFMC和PBMC上CD3，CD4和CD8检测的结果表明，SFMC中CD3+细胞的比率显著高于PBMC(分别为:81%±11%和53%±8%，P∨0.01)，但CD4+和CD8+细胞的比率并无明显差异(P∧0.05)。
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2.2SFMC和PBMC中Th1和Th2细胞的阳性率
用PMA/离子霉素刺激培养后，做ELISPOT染色，结果如图1所示。以IFN-γ+细胞代表Th1细胞，IL4+细胞代表Th2细胞，每张涂片计数500个淋巴细胞中阳性细胞的百分率。RA患者SFMC中，Th1细胞的平均阳性率明显高于PBMC(分别为：25.4%±6.6%和10.8%±2.6%,P∨0.01)；而Th2细胞的平均阳性率无显著差异(分别为：4.6%±2.7%和4.5%±2.1%,P∧0.1，图2)。另外，12例RA患者的PBMC与5例正常人的PBMC相比较，Th1和Th2细胞的阳性率也无显著差异(Th1细胞分别为：10.8%±2.6%和12.6%±3.6%,P∧0.3;Th2细胞分别为：4.5%±2.1%和4.8%±1.8%，P∧0.7)。
2.3SFMC和PBMC中Th1/Th2细胞的比值RA患者SFMC中，Th1/Th2细胞的比值明显高于PBMC中的比值(分别为：7.3±4.2和3.1±2.1,P∨0.01),与正常人PBMC中Th1/Th2细胞的比值(2.9±1.2)相比较，亦差异显著(P∨0.01，图3)。
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2.4Th1/Th2细胞比值与CRP和ESR的相关性以CRP和ESR作为两种衡量RA活动程度的敏感指标，将它们分别与Th1/Th2细胞的比值做相关分析。结果表明，RA患者SFMC中Th1/Th2细胞的比值与CRP和ESR均呈正相关(分别为r=0.74,P∨0.02和r=0.84,P∨0.01)(图4)。
图1RA患者SFMC中的CD3+,IFN-γ+和IL-4+T细胞
Fig 1 CD3+ , IFN γ + and IL 4+ T cells in SFMC from RA patients
A:CD3+ T cells in SFMC of RA patients (APAAP， × 400); B: IFN γ + T cells (Th1 cells) in SFMC of RA patients.Positive cells are characterized by some distinct red spots next to the nucleus (ELISPOT， × 400); C:IL 4+ T cells (Th2 cells)in SFMC of RA patients(ELISPOT， × 600).
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图2RA患者SFMC及PBMC中IFN-γ+和IL-4+T细胞的
百分率(%) bP∨0.01vsPBMC.
Fig 2 Percentages of IFN-γ+and IL-4+ T cells in SFMC and PBMC from RA patients
图3RA患者SFMC,PBMC及正常人(N)PBMC中Th1/
Th2细胞的比值
Fig 3 Th1/Th2 cell ratio in SFMC and PBMC from RA pa tients and normal control bP∨ 0.01 vs PBMC(RA) and PBMC(N).
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Fig 4 Correlation of Th1/Th2 cell ratio in SFMC to ESR and CRP of RA patients
图4RA患者SFMC中Th1/Th2细胞的比值与ESR和
CRP的相关性
3 讨论
正常人的Th1/Th2型细胞因子处于平衡状态，而RA患者的细胞因子网络则发生偏移。因此有人认为，促炎性Th1细胞及其分泌的IFNγ和抗炎性Th2细胞及其分泌的IL4的失衡，在RA的发病机制中具有重要的作用〔6〕。本文的结果表明，RA患者SFMC中Th1细胞的数明显高于其自身及正常人PBMC中的Th1细胞数。即在RA患者的关节中，Th1细胞及其分泌的细胞因子占显著优势，与一些学者推测的“Th1漂移(Th1shift)学说”相符合〔7〕，提示RA为器官特异性的自身免疫病。本研究还表明，RA患者SFMC中Th1/Th2细胞的比值明显升高，且与ESR和CRP呈正相关。最近有作者报道,血中Th1/Th2细胞的比值在RA病程进展中的作用，并认为Th1细胞有使RA患者病情慢性化的作用，而Th2细胞则主要起保护性作用〔8〕，因此，检测Th1/Th2细胞的比值对评价RA患者的预后具有一定的意义。应用胶原性关节炎动物模型表明，IL-4/IL-10(Th2型细胞因子)联合治疗，能使动物体内的Th0细胞向Th2细胞转化，并使病情显著好转〔9〕，因此，恢复关节内Th1/Th2细胞的平衡可能是控制RA慢性炎症的一条新途径。
, 百拇医药
采用ELISPOT法，通过检测细胞内的细胞因子而确定Th1/Th2细胞比值的基本原理是，莫能菌素可阻断细胞因子向胞膜外转运，使之滞留在胞浆中，而并不影响细胞因子的合成，因此可用于检测细胞内的IFN-γ和IL-4。由于进入细胞内的抗IFN-γ和IL-4抗体与之结合，通过第二抗体和生物素亲合素放大系统，在胞浆内可形成颗粒状斑点，用免疫组化染色方法即可显示。因此，ELISPOT法具有灵敏、简便和形象直观等优点，是检测Th细胞亚群比值的一种值得推广的好方法〔10〕。■
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39870719
作者简介：张浩，男，27岁，硕士生西安市长乐西路15号，Tel.(029)33753602000by J Cell Mol Immunol Press www.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
, 百拇医药
参考文献:
〔1〕 Racke MK, Bonomo A. Cytokine induced immune deviation as a therapy for inflammatory autoimmune disease〔J〕 . J Exp Med, 1994;180:1961- 1966.
〔2〕 Simon AK, Seipelt E, Seiper J. Divergent T cell cytokine patterns in inflammatory arthritis〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA, 1994;91:8562- 8566.
〔3〕 Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA. American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis〔J〕 . Arthritis Rheum,1988;31:315- 324.
, http://www.100md.com
〔4〕 Dolhain RJEM, Andersson U, ter Haar NT. Detection of intracellular interferon γ by light microscopy using an immunoperoxidase technique〔J〕 . J Leukocyte Biol,1993;54:545- 551.
〔5〕 Miossec P. Th1/Th2 cytokine balance in arthritis〔J〕 . Arthritis Rheum, 1997; 40:2105- 2115.
〔6〕 Matyniak JE, Reiner SL. T helper phenotype and genetic susceptibility in experimental Lyme disease〔J〕 . J Exp Med,1995;181:1251- 1254.
, http://www.100md.com
〔7〕 van der Graaf WL, Prins APA. Prognostic value of Th1/Th2 ratio in rheumatoid arthritis〔J〕 . Lancet, 1998;315:1931.
〔8〕 Joosten LAB, Lubberts E. Role of IL 4 and IL 10 in murine collagen induced arthritis:protective effect of IL 4 and IL 10 treatment on cartilage destruction〔J〕 . Arthritis Rheum,1997;40:249- 260.
〔9〕 赵武述.辅助性T细胞亚群的研究及其临床意义〔J〕.中华医学检验杂志,1998;21:7-8.
收稿日期：1999-12-28
修回日期：1999-02-10, 百拇医药
单位：张浩(第四军医大学西京医院临床免疫科，陕西西安710032)；朱平(第四军医大学西京医院临床免疫科，陕西西安710032)；王彦宏(第四军医大学西京医院临床免疫科，陕西西安710032)
关键词：类风湿关节炎;Th1/Th2细胞；酶联免疫斑点法；细胞因子
细胞与分子免疫学杂志000319
摘要：目的分析类风湿关节炎(RA)患者滑膜液及外周血中Th1/Th2型细胞因子网络的偏移及其在疾病过程中的意义。方法用酶联免疫斑点法(enzymelinkedimmunospotassay,ELISPOT)，检测RA患者滑膜液单个核细胞(SFMC)和外周血单个核细胞(PBMC)中的Th1和Th2细胞，并分析Th1/Th2细胞的比值与血沉(ESR)和C反应蛋白(CRP)的相关性。结果与PBMC相比较，RA患者SFMC中CD3+T细胞的百分率，Th1细胞及Th1/Th2细胞的比值显著升高(P∨0.01)，且此比值与患者的ESR和CRP均呈正相关(分别为r=0.84,P∨0.01和r=0.74,P∨0.02)。结论在RA患者关节中Th1细胞明显增多并占优势，Th1/Th2细胞的比值与疾病的活动程度明显相关，Th1/Th2细胞的平衡在RA的发病机制及疾病进展中可能具有重要的作用。
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中图号：R593.2 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0237-03
Study on the Th1/Th2 cytokine profile in joints of patients with rheumatoid arthritis and its clinical significance
ZHANG Hao ZHU Ping WANG Yan-hong
(Department of Clinical Immunology， Xijing Hospital， Fourth Military Medical University， Xi'an 710032， Shaanxi Province,China)
Abstract: Aim To analyize the shift of Th1/Th2 type cytokine profile in synovial fluid and peripheral blood from patients with rheumatoid arthritis (RA) and its clinical significance. Methods Th1 and Th2 cells in synovial fluid mononuclear cells (SFMC) and paired peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 12 RA patients were detected by enzyme linked immunospot assay (ELISPOT). Correlation of Th1/Th2 cell ratio with erythrocyte sedimentation rate (ESR) and C reactive protein(CRP) were analyized. Results The mean percentages of CD3+ T cells,Th1 cells and Th1/Th2 cell ratio were significantly increased in the SFMC as compared with PBMC(P∨ 0.01). The Th1/Th2 cell ratio of SFMC in RA patients was correlated significantly with ESR and CRP(r=0.84, P∨ 0.01 and r=0.74,P∨ 0.02, respectively). Conclusion The Th1 cells in joints of RA patients increased and predominated. Th1/Th2 ratio correlated markedly with the disease activity.Th1/Th2 cell balance has important implications for the pathogensis of RA.
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Keywords: rheumatoid arthritis;Th1/Th2 cell;ELISPOT; cytokine ▲
类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是一种以慢性滑膜炎为主要特征的全身性疾病，发病机制尚不清楚。近年研究表明，辅助性T细胞(Th1/Th2)在RA的发病机制中有重要的作用〔1〕，并在基因水平上分析了RA患者Th1/Th2型细胞因子的表达〔2〕。为了深入探讨Th1/Th2细胞及其分泌的细胞因子在RA患者体内的表达模式及临床意义，我们采用ELISPOT法，在单细胞水平检测了RA患者滑膜液中单个核细胞(SFMC)和外周血单个核细胞(PBMC)中Th1/Th2细胞的分布，并分析了其与患者疾病活动程度的相关性。
1 材料和方法
1.1材料SFMC及PBMC取自12例活动期RA患者〔平均受累关节为(5.2±3.6)个，病程为(8.4±7.5)年,ESR为(61.2±24.2)mm/h，CRP为(32.2±17.5)mg/L〕。10例类风湿因子(RF)阳性，2例阴性。RA根据1987年美国风湿病学会(ACR)修订的标准而确诊〔3〕。滑膜液由膝关节无菌穿刺抽取，平均白细胞计数为(17.3.±9.7×109)个/L。以5份健康成人血液标本的PBMC作为阴性对照。CD3/CD4/CD8检测试剂盒购自北京邦定泰克公司。小鼠抗人IFN-γ和抗人IL-4mAb购自美国RD公司。生物素链霉卵白素/碱性磷酸酶试剂盒，购自LabVision公司。多聚甲醛、皂素、PMA，离子霉素、莫能菌素和透明质酸酶，均购自Sigma公司。淋巴细胞分离液为上海第一生化制品厂产品，RPMI1640培养液为Gibco公司产品。
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1.2方法
1.2.1SFMC和PBMC的分离和培养取EDTA抗凝的滑膜液，每mL加入10U透明质酸酶，37℃孵育30min以降低粘度。以等量生理盐水稀释后,用淋巴细胞分离液按密度梯度离心法分离SFMC。PBMC按常规密度梯度离心法分离。将所获SFMC或PBMC以2×109/L的密度悬浮于含100mL/L胎牛血清(FCS)的RPMI1640中。取24孔培养板(NUNC，丹麦)，每孔加1mL细胞悬液，20μg/LPMA，1μmol/L离子霉素(ionomycin)及2μmol/L莫能菌素(monensin)，于37℃50mL/LCO2条件下培养6h。收集培养的细胞，以PBS洗两次，用离心涂片机制成细胞涂片，检测细胞的表面标志及细胞内的细胞因子。
1.2.2细胞表面标志的检测SFMC和PBMC表面CD3，CD4和CD8的检测，采用邦定公司的T淋巴细胞亚群检测试剂盒(APAAP法)，按说明书进行。细胞表面有红色标记物者即为阳性细胞。
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1.2.3细胞内细胞因子的检测按文献〔4〕的方法进行，主要步骤为：细胞涂片用40mL/L多聚甲醛(PFA)固定30min，再以100mL/L正常羊血清封闭10min，加1g/L皂素PBS150μL通透10min，以使抗细胞因子单抗易于进入细胞内，然后加抗IFN-γmAb0.5μg或抗IL4mAb0.25μg(阴性对照用PBS代替)，4℃反应过夜。用PBS冲洗后，每片加生物素标记的羊抗小鼠IgG(二抗)50μL，室温反应30min。最后加链霉卵白素-碱性磷酸酶复合物50μL，室温反应30min，用坚固红溶液显色、苏木精复染后，甘油明胶封片、镜检(日本NikonOPTIPHOT)并照像。结果用
±s表示，并做t检验。Th1/Th2细胞的比值与ESR和CRP的结果做直线相关分析。2 结果
2.1SFMC和PBMC的表型分析对12例RA患者SFMC和PBMC上CD3，CD4和CD8检测的结果表明，SFMC中CD3+细胞的比率显著高于PBMC(分别为:81%±11%和53%±8%，P∨0.01)，但CD4+和CD8+细胞的比率并无明显差异(P∧0.05)。
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2.2SFMC和PBMC中Th1和Th2细胞的阳性率
用PMA/离子霉素刺激培养后，做ELISPOT染色，结果如图1所示。以IFN-γ+细胞代表Th1细胞，IL4+细胞代表Th2细胞，每张涂片计数500个淋巴细胞中阳性细胞的百分率。RA患者SFMC中，Th1细胞的平均阳性率明显高于PBMC(分别为：25.4%±6.6%和10.8%±2.6%,P∨0.01)；而Th2细胞的平均阳性率无显著差异(分别为：4.6%±2.7%和4.5%±2.1%,P∧0.1，图2)。另外，12例RA患者的PBMC与5例正常人的PBMC相比较，Th1和Th2细胞的阳性率也无显著差异(Th1细胞分别为：10.8%±2.6%和12.6%±3.6%,P∧0.3;Th2细胞分别为：4.5%±2.1%和4.8%±1.8%，P∧0.7)。
2.3SFMC和PBMC中Th1/Th2细胞的比值RA患者SFMC中，Th1/Th2细胞的比值明显高于PBMC中的比值(分别为：7.3±4.2和3.1±2.1,P∨0.01),与正常人PBMC中Th1/Th2细胞的比值(2.9±1.2)相比较，亦差异显著(P∨0.01，图3)。
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2.4Th1/Th2细胞比值与CRP和ESR的相关性以CRP和ESR作为两种衡量RA活动程度的敏感指标，将它们分别与Th1/Th2细胞的比值做相关分析。结果表明，RA患者SFMC中Th1/Th2细胞的比值与CRP和ESR均呈正相关(分别为r=0.74,P∨0.02和r=0.84,P∨0.01)(图4)。
图1RA患者SFMC中的CD3+,IFN-γ+和IL-4+T细胞
Fig 1 CD3+ , IFN γ + and IL 4+ T cells in SFMC from RA patients
A:CD3+ T cells in SFMC of RA patients (APAAP， × 400); B: IFN γ + T cells (Th1 cells) in SFMC of RA patients.Positive cells are characterized by some distinct red spots next to the nucleus (ELISPOT， × 400); C:IL 4+ T cells (Th2 cells)in SFMC of RA patients(ELISPOT， × 600).
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图2RA患者SFMC及PBMC中IFN-γ+和IL-4+T细胞的
百分率(%) bP∨0.01vsPBMC.
Fig 2 Percentages of IFN-γ+and IL-4+ T cells in SFMC and PBMC from RA patients
图3RA患者SFMC,PBMC及正常人(N)PBMC中Th1/
Th2细胞的比值
Fig 3 Th1/Th2 cell ratio in SFMC and PBMC from RA pa tients and normal control bP∨ 0.01 vs PBMC(RA) and PBMC(N).
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Fig 4 Correlation of Th1/Th2 cell ratio in SFMC to ESR and CRP of RA patients
图4RA患者SFMC中Th1/Th2细胞的比值与ESR和
CRP的相关性
3 讨论
正常人的Th1/Th2型细胞因子处于平衡状态，而RA患者的细胞因子网络则发生偏移。因此有人认为，促炎性Th1细胞及其分泌的IFNγ和抗炎性Th2细胞及其分泌的IL4的失衡，在RA的发病机制中具有重要的作用〔6〕。本文的结果表明，RA患者SFMC中Th1细胞的数明显高于其自身及正常人PBMC中的Th1细胞数。即在RA患者的关节中，Th1细胞及其分泌的细胞因子占显著优势，与一些学者推测的“Th1漂移(Th1shift)学说”相符合〔7〕，提示RA为器官特异性的自身免疫病。本研究还表明，RA患者SFMC中Th1/Th2细胞的比值明显升高，且与ESR和CRP呈正相关。最近有作者报道,血中Th1/Th2细胞的比值在RA病程进展中的作用，并认为Th1细胞有使RA患者病情慢性化的作用，而Th2细胞则主要起保护性作用〔8〕，因此，检测Th1/Th2细胞的比值对评价RA患者的预后具有一定的意义。应用胶原性关节炎动物模型表明，IL-4/IL-10(Th2型细胞因子)联合治疗，能使动物体内的Th0细胞向Th2细胞转化，并使病情显著好转〔9〕，因此，恢复关节内Th1/Th2细胞的平衡可能是控制RA慢性炎症的一条新途径。
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采用ELISPOT法，通过检测细胞内的细胞因子而确定Th1/Th2细胞比值的基本原理是，莫能菌素可阻断细胞因子向胞膜外转运，使之滞留在胞浆中，而并不影响细胞因子的合成，因此可用于检测细胞内的IFN-γ和IL-4。由于进入细胞内的抗IFN-γ和IL-4抗体与之结合，通过第二抗体和生物素亲合素放大系统，在胞浆内可形成颗粒状斑点，用免疫组化染色方法即可显示。因此，ELISPOT法具有灵敏、简便和形象直观等优点，是检测Th细胞亚群比值的一种值得推广的好方法〔10〕。■
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39870719
作者简介：张浩，男，27岁，硕士生西安市长乐西路15号，Tel.(029)33753602000by J Cell Mol Immunol Press www.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
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参考文献:
〔1〕 Racke MK, Bonomo A. Cytokine induced immune deviation as a therapy for inflammatory autoimmune disease〔J〕 . J Exp Med, 1994;180:1961- 1966.
〔2〕 Simon AK, Seipelt E, Seiper J. Divergent T cell cytokine patterns in inflammatory arthritis〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA, 1994;91:8562- 8566.
〔3〕 Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA. American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis〔J〕 . Arthritis Rheum,1988;31:315- 324.
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〔4〕 Dolhain RJEM, Andersson U, ter Haar NT. Detection of intracellular interferon γ by light microscopy using an immunoperoxidase technique〔J〕 . J Leukocyte Biol,1993;54:545- 551.
〔5〕 Miossec P. Th1/Th2 cytokine balance in arthritis〔J〕 . Arthritis Rheum, 1997; 40:2105- 2115.
〔6〕 Matyniak JE, Reiner SL. T helper phenotype and genetic susceptibility in experimental Lyme disease〔J〕 . J Exp Med,1995;181:1251- 1254.
, http://www.100md.com
〔7〕 van der Graaf WL, Prins APA. Prognostic value of Th1/Th2 ratio in rheumatoid arthritis〔J〕 . Lancet, 1998;315:1931.
〔8〕 Joosten LAB, Lubberts E. Role of IL 4 and IL 10 in murine collagen induced arthritis:protective effect of IL 4 and IL 10 treatment on cartilage destruction〔J〕 . Arthritis Rheum,1997;40:249- 260.
〔9〕 赵武述.辅助性T细胞亚群的研究及其临床意义〔J〕.中华医学检验杂志,1998;21:7-8.
收稿日期：1999-12-28
修回日期：1999-02-10, 百拇医药