PPD免疫小鼠胸腺内降钙素基因相关肽能神经纤维的可塑性
作者：段晓莉 王百忍 王凌 鞠躬
单位：段晓莉(第四军医大学全军神经科学研究所神经免疫调节研究室， 陕 西西安 710032)；王百忍(第四军医大学全军神经科学研究所神经免疫调节研究室， 陕 西西安 710032)；王凌(第四军医大学全军神经科学研究所神经免疫调节研究室， 陕 西西安 710032)；鞠躬(第四军医大学全军神经科学研究所神经免疫调节研究室， 陕 西西安 710032)
关键词：降钙素基因相关肽；结核菌素纯蛋白衍生物；胸腺；小鼠；免疫组织化学
细胞与分子免疫学杂志000311
摘要：目的 观察免疫应答时胸腺内降钙素基因相关肽(CGRP)能神经纤维的可塑性,为CGRP在胸腺的调节作用提供线索。方法 用PPD免疫Balb/c小鼠 ，胸腺切片用免疫组织化学法处理，光镜下观察。结果在正常Balb/c小鼠胸腺被囊、小梁内有较丰富的CGRP能神经纤维分布，胸腺实质中也 有阳性纤维存在。用 PPD免疫28d后，胸腺被囊、小梁内血管周围的CGRP阳性纤维明显增加，这 些纤维直径较粗、膨体少，多数围绕血管形成网状；有的聚集成束直行。胸腺实质内阳性纤维的数量少，免疫后较对照组略有增加，分布不均。此外，胸腺髓质中的一些较大的、三角形或椭圆形的上皮样细胞，亦呈CGRP免疫反应阳性。结论 CGRP与胸腺在免疫应答时的结构、机能变化有关。
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中图号：R322.8 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0215-04
Plasticity of calcitonin gene related peptidergic nerve fibers in the mouse thymus following PPD immunization
DUAN Xiao-li WANG Bai-ren WANG Ling JU Gong
(Department of Neuroimmunomodulation, Institute of PLA Neuroscience, Fourth Military Medical University, Xi'an, 710032, Shaanxi Province, China)
Abstract:Aim To elucidate the plasticity of calcitonin gene rel ated peptidergic(CGRP) nerve fibers in mouse thymus and to provide clues for the roles of immunomodulation of CGRP.Methods Balb/c mice were immunized peritoneally by purified protein from tuberculin derivatives(PPD). Sections of the thymic tissues were treated immunohistochemically and oberserved microscopically. Results In normal group, there were relatively abundant CGRP like immunoreactive(LI) fibers in capsule and tubercle. A few positive fibers were seen in parenchyma as well. Twenty eight days after PPD immunization, the perivesicular CGRP LI fibers were significantly increased. These fibers were thick in diameter with few buttons and formed reticular structures surrounding blood vessels or bundles going straightly.The CGRP LI fibers in parenchyma of the thymus were slightly increased in number and distributed unevenly. In addition, a few big triangular or ovoid epithelial like cells in the medulla of thymus were also CGRP LI. Conclusion The present results indicate that CGRP is related to the changes of structure and function of thymus during immune response. rel ated peptidergic(CGRP) nerve fibers in mouse thymus and to provide clues for the roles of immunomodulation of CGRP.Methods Balb/c mice were immunized peritoneally by purified protein from tuberculin derivatives(PPD). Sections of the thymic tissues were treated immunohistochemically and oberserved microscopically. Results In normal group, there were relatively abundant CGRP like immunoreactive(LI) fibers in capsule and tubercle. A few positive fibers were seen in parenchyma as well. Twenty eight days after PPD immunization, the perivesicular CGRP LI fibers were significantly increased. These fibers were thick in diameter with few buttons and formed reticular structures surrounding blood vessels or bundles going straightly.The CGRP LI fibers in parenchyma of the thymus were slightly increased in number and distributed unevenly. In addition, a few big triangular or ovoid epithelial like cells in the medulla of thymus were also CGRP LI. Conclusion The present results indicate that CGRP is related to the changes of structure and function of thymus during immune response.
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Keywords: calcitonin gene related peptide; purified protein derivative; thymus; mouse; immunohistochemistry▲
神经、内分泌和免疫系统间存在着复杂的相互联系。许多证据表明，脑可通过神经内分泌通路和自主神经传出纤维影响免疫器官的活动。胸腺是中枢性淋巴器官，胸腺的免疫功能受神经内分泌系统的调控。这种调控作用的形态学基础之一，是胸腺内有丰富的交感、副交感和传入纤维的支配〔1〕。许多证据表明，CGRP是一种重要的神经免疫通讯介质〔2，3〕，胸腺内有丰富的CGRP能神经纤维〔4〕，但在免疫应激时这些纤维是否有形态学上的变化还未见报道。我们用PPD免疫Balb/c小鼠建立了免疫应答模型，并用免疫组织化学方法，观察了胸腺内CGRP能神经纤维在免疫前后的形态、数量变化，以为进一步探讨CGRP对胸腺功能的调节提供实验依据。
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1 材料和方法
1.1动物分组和免疫过程3～4wk龄的雄性Balb/c小鼠8只，分为实验组与对照组(各4只)，饲养在自然光线、恒温和定期消毒的环境中，喂以小鼠专用块食和清水。实验组动物接受2次免疫注射，抗原为PPD(中国药品生物制品鉴定所产品)。初次免疫时，将抗原与福氏完全佐剂(Sigma)混合，腹腔内注射，每只动物300μL，内含PPD30μg。存活21d后，实验组再接受第2次免疫注射，将抗原溶于灭菌生理盐水，每只动物腹腔内注射500μL，含抗原30μg。7d后将动物处死。此时间点为再次免疫应答时抗体形成的高峰期〔5〕。对照组动物在与实验组2个相同的时间点接受相同量的灭菌生理盐水腹腔注射。
1.2组织处理和免疫组织化学所有动物以戊巴比妥钠深麻(60mg/kg，i.p.)，开胸剪开右心房，用注射器经升主动脉灌流生理盐水10mL，继而灌注4℃的含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB)50mL。取出胸腺,浸入相同固定液中固定4h，转入含200g/L蔗糖的4℃PB中，直至沉底。将胸腺两叶分开，取一叶的中间1/3段沿矢状面方向做冰冻切片，片厚15μm，隔5取1，贴于明胶处理的载玻片上，置20℃保存。反应时先用3mL/LH2O2(用800mL/L甲醇配制)封闭切片30min，以消除内源性过氧化物酶。结束后用0.01mol/LPBS洗3次(10min/次)。继之用含3mL/LTritonX100，10g/LBSA和30mL/L免血清的0.01mol/L钾磷酸盐缓冲液生理盐水(KPBS，pH7.6)孵育1h，以封闭非特异性结合反应。然后依次加入兔抗CGRP抗体(Chemicon，1∶3000室温24h)，生物素化的羊抗兔IgG(Sigma，1∶500室温12h)及ABC复合物(1∶500，室温4h)。以上每一步骤间均用0.01mol/LPBS(pH7.6)洗涤，10min×3。最后在含有0.5g/LDAB，5g/L硫酸镍铵和0.1mL/LH2O2的0.1mol/L醋酸缓冲液(pH6.2)中呈色10～15min，真至反应的颜色适度为止。切片在室温下晾干，部分切片用中性红复染，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片后，在OlympusBH60显微镜下观察并照相，对每只动物所有的胸腺切片均进行观察。在20倍物镜下，从每张切片的左上角开始，每隔1个视野取1个做分析，观察有无CGRP阳性纤维并记录，计算出含阳性纤维视野的数。
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2 结果
经免疫细胞化学法反应的胸腺切片背景着色较浅，阳性结构清晰，CGRP样免疫反应阳性产物呈蓝紫色或黑色。用中性红复染后，胸腺的组织学结构显示较清楚。空白对照实验未发现阳性染色。
对照组小鼠胸腺内CGRP样免疫反应阳性的纤维主要分布于被膜和小梁内，绝大部分围绕在血管周围。在较大血管的纵断面上，可见阳性纤
图1 正常和PPD免疫小鼠胸腺内CGRP样免疫阳性结构
Fig 1 CGRP like immunoreactive structures in the thymus of normal and PPD immunized mice(Immunocytochemical staining ， × 120)
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Notes:Microphotographes A and B showing respectively CGRP like immunoreactive fibers in the cortex of the normal and PPD immunized rat thymus. Microphotographes C and D showing CGRP like immunoreactive fibers in the medulla of the normal and PPD immunized rat thymus.Microphotograph E showing CGRP like immunoreactive fibers in the cortex of the thymus in normal rat.Microphotograph F showing the perivasicular CGRP like immunoreactive fibers which form network in the trabecula of thymus in the PPD immunized rat.
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维相互交织，在横断面上形成数层环状。也有一些CGRP阳性纤维在被膜和小梁中呈独立地走行。在胸腺实质内阳性纤维的数量很少,在20倍物镜下从每只动物随机选取20个视野，平均约每4个视野可见到有阳性纤维存在。一些阳性纤维从被膜走向皮质，分布于被膜下区，也有少数纤维走行于皮质深层的密集的淋巴细胞之间。皮、髓质交界处和髓质内也有少量CGRP阳性纤维分布。另外，胸腺髓质中一些较大的、三角形或椭圆形细胞亦呈CGRP样免疫反应阳性。
PPD再次免疫后7d，胸腺被囊、小梁内血管周围的CGRP阳性纤维数量明显增加，围绕血管形成复杂的纤维网，网中的纤维密度明显增多，也有的纤维聚集成束直行。阳性纤维的直径较粗，膨体少。实质内阳性纤维分布不均，亦多位于小血管周围；少数行于淋巴细胞间，其数量较对照组略有增加，在20倍物镜下平均每3.5个视野可见到阳性纤维。
3 讨论
胸腺是中枢性淋巴器官，许多证据表明，脑可通过神经内分泌通路和自主神经传出纤维影响胸腺的活动。交感神经化学切除术和免疫细胞化学技术，均已证明胸腺接受肾上腺素能、胆碱能和肽能神经纤维的支配〔1〕，这是脑调控免疫功能的直捷、快速联系。另外，神经、内分泌系统分泌的神经活性物质和激素可经循环系统至胸腺，作用于胸腺内免疫细胞上的相应受体而发挥作用。
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CGRP是一种由37个氨基酸组成的生物活性多肽，广泛地分布于中枢、外周神经系统及心血管系统等〔3，6〕。近年来许多研究表明，CGRP也存在于从胎鼠到老龄鼠的胸腺中〔7〕。胸腺内既存在CGRP能神经纤维〔4〕，胸腺上皮细胞甚或淋巴细胞本身也可以合成CGRP〔2，3〕。
大量研究表明，免疫应答过程中支配淋巴器官的交感神经纤维有明显的可塑性〔5〕，但免疫应答过程中胸腺内CGRP能纤维是否有变化还未见报道。PPD是一种胸腺依赖的抗原，既可用于体液免疫的研究，也可用于细胞免疫的研究。我们应用免疫组织化学ABC法，观察了正常小鼠胸腺内的CGRP阳性纤维及其细胞分布，以及两次PPD免疫后胸腺内CGRP阳性纤维的形态和数量变化。结果发现，正常对照组小鼠胸腺被囊和小梁中，存在CGRP样免疫反应阳性纤维，多围绕在血管周围，而胸腺实质内CGRP样纤维很少。我们发现，PPD免疫28d后，CGRP样阳性纤维的数量明显增加，主要出现于胸腺被囊和小梁内的血管周围；而胸腺实质内的CGRP阳性纤维免疫后较对照组仅略有增加。
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CGRP是目前体内抑制作用最强的舒血管物质，对躯体血管显示不同程度的量效依赖性舒张反应〔8〕。CGRP在心血管系统主要存在于支配心血管的感觉或自主神经末梢中〔6〕。我们发现，动物在免疫应激过程中，支配胸腺血管的CGRP能纤维的数量明显增加，提示分布于血管的CGRP神经丛可能以旁分泌的形式分泌CGRP，发挥扩血管作用，增加胸腺的血液供应。这与免疫应激过程中胸腺功能活动的增强相适应。
关于胸腺内CGRP能神经纤维的起源，有人将与辣根过氧化物酶结合的霍乱毒素B亚单位注入豚鼠颈段背根神经节，在同侧胸腺内发现标记的神经纤维，其形态与CGRP能神经纤维相似，提示CGRP能感觉性传入神经纤维支配胸腺，其胞体在背根神经节〔9〕。也有人推测，部分CGRP阳性纤维可能源于迷走神经复合体。我们推测，胸腺内CGRP能神经纤维的可塑性变化，可能是由于在针对特定抗原的免疫应答过程中，免疫信息通过免疫分子传递到中枢自主神经系统，进而影响了支配胸腺的迷走复合体和感觉神经元的活动，导致CGRP合成增加，从而表现为胸腺内CGRP纤维增多。CGRP可进而由终末释放，以旁分泌的形式发挥作用。
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越来越多的资料显示，免疫系统和神经内分泌系统共享一组结构相关的细胞因子受体和神经肽受体，免疫细胞本身可以合成神经肽，其上也有许多神经肽受体〔2〕。如前所述，CGRP还可在胸腺细胞内合成，并证实CGRP免疫反应存在于被膜下/血管周围的胸腺上皮细胞。最近，Xing等〔2〕采用放免测定、高压液相层析及反转录PCR法，发现大鼠胸腺细胞和肠系膜淋巴结细胞中有CGRP及其mRNA。也有一些证据提示，小鼠胸腺皮质和髓质细胞呈CGRP阳性〔10〕。近年来，越来越多的研究提示，CGRP直接参与免疫反应的调节。据报道，CGRP可调节巨噬细胞〔11〕、淋巴细胞〔12〕和其他免疫细胞〔13〕的功能。多种免疫细胞的亚群(包括巨噬细胞和淋巴细胞)都具有与cGMP生成相关的高亲和力CGRP受体〔3〕。CGRP与其受体结合后，可对免疫功能施加多种影响。一些研究显示，CGRP可强烈抑制免疫细胞的功能。体外研究显示，CGRP可减弱IFNγ或提呈抗原刺激巨噬细胞生成H2O2的能力，并能抑制有丝分裂原LPS在70Z/3细胞上对sIg蛋白表达的诱导作用，从而抑制前B细胞的分化〔3〕。CGRP可以剂量依赖的方式抑制ConA或PHA诱导的T细胞增殖〔10〕。其机制可能与其抑制IL2受体的表达有关。CGRP还可抑制淋巴细胞由IL2激发的杀伤活性〔15〕。另一方面，CGRP可对免疫细胞在受到刺激时细胞因子的生成进行调节，对IL-6和TNF-αmRNA的增加具有稳定作用，可通过细胞因子介导Swiss3T3成纤维细胞产生IL-6〔3〕。CGRP对T细胞和嗜酸性粒细胞有趋化作用〔16〕，并可促进嗜中性粒细胞与内皮细胞间的粘附〔11〕。新近Sakuta〔17〕等报道，CGRP还能增强淋巴细胞的凋亡，特别是CD4+CD8+的胸腺细胞。总之，CGRP在生物适应性、免疫系统的发生和体内平衡的维持中均起重要的作用，CGRP以自分泌或旁分泌的形式，参与中枢免疫器官内胸腺细胞的成熟、训育和选择。我们发现胸腺实质内有少量CGRP阳性纤维，在免疫应激时有轻度增加，可能反映了CGRP在免疫应激过程中对胸腺功能的负反馈作用。但本研究中观察到的胸腺髓质中CGRP样免疫反应阳性细胞的类型有待进一步用双标记的方法进行鉴别。■
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基金项目：国家自然科学基金资助，No.39830130; “九五” 重点基金资助，NO.962044
作者简介：段晓莉，女，30岁，实验员西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374489Email: wbrnim@fmmu.cn 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit@fmmu.edu.cn
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收稿日期：1999-11-22
修回日期：1999-01-28, 百拇医药
单位：段晓莉(第四军医大学全军神经科学研究所神经免疫调节研究室， 陕 西西安 710032)；王百忍(第四军医大学全军神经科学研究所神经免疫调节研究室， 陕 西西安 710032)；王凌(第四军医大学全军神经科学研究所神经免疫调节研究室， 陕 西西安 710032)；鞠躬(第四军医大学全军神经科学研究所神经免疫调节研究室， 陕 西西安 710032)
关键词：降钙素基因相关肽；结核菌素纯蛋白衍生物；胸腺；小鼠；免疫组织化学
细胞与分子免疫学杂志000311
摘要：目的 观察免疫应答时胸腺内降钙素基因相关肽(CGRP)能神经纤维的可塑性,为CGRP在胸腺的调节作用提供线索。方法 用PPD免疫Balb/c小鼠 ，胸腺切片用免疫组织化学法处理，光镜下观察。结果在正常Balb/c小鼠胸腺被囊、小梁内有较丰富的CGRP能神经纤维分布，胸腺实质中也 有阳性纤维存在。用 PPD免疫28d后，胸腺被囊、小梁内血管周围的CGRP阳性纤维明显增加，这 些纤维直径较粗、膨体少，多数围绕血管形成网状；有的聚集成束直行。胸腺实质内阳性纤维的数量少，免疫后较对照组略有增加，分布不均。此外，胸腺髓质中的一些较大的、三角形或椭圆形的上皮样细胞，亦呈CGRP免疫反应阳性。结论 CGRP与胸腺在免疫应答时的结构、机能变化有关。
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中图号：R322.8 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0215-04
Plasticity of calcitonin gene related peptidergic nerve fibers in the mouse thymus following PPD immunization
DUAN Xiao-li WANG Bai-ren WANG Ling JU Gong
(Department of Neuroimmunomodulation, Institute of PLA Neuroscience, Fourth Military Medical University, Xi'an, 710032, Shaanxi Province, China)
Abstract:Aim To elucidate the plasticity of calcitonin gene rel ated peptidergic(CGRP) nerve fibers in mouse thymus and to provide clues for the roles of immunomodulation of CGRP.Methods Balb/c mice were immunized peritoneally by purified protein from tuberculin derivatives(PPD). Sections of the thymic tissues were treated immunohistochemically and oberserved microscopically. Results In normal group, there were relatively abundant CGRP like immunoreactive(LI) fibers in capsule and tubercle. A few positive fibers were seen in parenchyma as well. Twenty eight days after PPD immunization, the perivesicular CGRP LI fibers were significantly increased. These fibers were thick in diameter with few buttons and formed reticular structures surrounding blood vessels or bundles going straightly.The CGRP LI fibers in parenchyma of the thymus were slightly increased in number and distributed unevenly. In addition, a few big triangular or ovoid epithelial like cells in the medulla of thymus were also CGRP LI. Conclusion The present results indicate that CGRP is related to the changes of structure and function of thymus during immune response. rel ated peptidergic(CGRP) nerve fibers in mouse thymus and to provide clues for the roles of immunomodulation of CGRP.Methods Balb/c mice were immunized peritoneally by purified protein from tuberculin derivatives(PPD). Sections of the thymic tissues were treated immunohistochemically and oberserved microscopically. Results In normal group, there were relatively abundant CGRP like immunoreactive(LI) fibers in capsule and tubercle. A few positive fibers were seen in parenchyma as well. Twenty eight days after PPD immunization, the perivesicular CGRP LI fibers were significantly increased. These fibers were thick in diameter with few buttons and formed reticular structures surrounding blood vessels or bundles going straightly.The CGRP LI fibers in parenchyma of the thymus were slightly increased in number and distributed unevenly. In addition, a few big triangular or ovoid epithelial like cells in the medulla of thymus were also CGRP LI. Conclusion The present results indicate that CGRP is related to the changes of structure and function of thymus during immune response.
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Keywords: calcitonin gene related peptide; purified protein derivative; thymus; mouse; immunohistochemistry▲
神经、内分泌和免疫系统间存在着复杂的相互联系。许多证据表明，脑可通过神经内分泌通路和自主神经传出纤维影响免疫器官的活动。胸腺是中枢性淋巴器官，胸腺的免疫功能受神经内分泌系统的调控。这种调控作用的形态学基础之一，是胸腺内有丰富的交感、副交感和传入纤维的支配〔1〕。许多证据表明，CGRP是一种重要的神经免疫通讯介质〔2，3〕，胸腺内有丰富的CGRP能神经纤维〔4〕，但在免疫应激时这些纤维是否有形态学上的变化还未见报道。我们用PPD免疫Balb/c小鼠建立了免疫应答模型，并用免疫组织化学方法，观察了胸腺内CGRP能神经纤维在免疫前后的形态、数量变化，以为进一步探讨CGRP对胸腺功能的调节提供实验依据。
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1 材料和方法
1.1动物分组和免疫过程3～4wk龄的雄性Balb/c小鼠8只，分为实验组与对照组(各4只)，饲养在自然光线、恒温和定期消毒的环境中，喂以小鼠专用块食和清水。实验组动物接受2次免疫注射，抗原为PPD(中国药品生物制品鉴定所产品)。初次免疫时，将抗原与福氏完全佐剂(Sigma)混合，腹腔内注射，每只动物300μL，内含PPD30μg。存活21d后，实验组再接受第2次免疫注射，将抗原溶于灭菌生理盐水，每只动物腹腔内注射500μL，含抗原30μg。7d后将动物处死。此时间点为再次免疫应答时抗体形成的高峰期〔5〕。对照组动物在与实验组2个相同的时间点接受相同量的灭菌生理盐水腹腔注射。
1.2组织处理和免疫组织化学所有动物以戊巴比妥钠深麻(60mg/kg，i.p.)，开胸剪开右心房，用注射器经升主动脉灌流生理盐水10mL，继而灌注4℃的含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB)50mL。取出胸腺,浸入相同固定液中固定4h，转入含200g/L蔗糖的4℃PB中，直至沉底。将胸腺两叶分开，取一叶的中间1/3段沿矢状面方向做冰冻切片，片厚15μm，隔5取1，贴于明胶处理的载玻片上，置20℃保存。反应时先用3mL/LH2O2(用800mL/L甲醇配制)封闭切片30min，以消除内源性过氧化物酶。结束后用0.01mol/LPBS洗3次(10min/次)。继之用含3mL/LTritonX100，10g/LBSA和30mL/L免血清的0.01mol/L钾磷酸盐缓冲液生理盐水(KPBS，pH7.6)孵育1h，以封闭非特异性结合反应。然后依次加入兔抗CGRP抗体(Chemicon，1∶3000室温24h)，生物素化的羊抗兔IgG(Sigma，1∶500室温12h)及ABC复合物(1∶500，室温4h)。以上每一步骤间均用0.01mol/LPBS(pH7.6)洗涤，10min×3。最后在含有0.5g/LDAB，5g/L硫酸镍铵和0.1mL/LH2O2的0.1mol/L醋酸缓冲液(pH6.2)中呈色10～15min，真至反应的颜色适度为止。切片在室温下晾干，部分切片用中性红复染，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片后，在OlympusBH60显微镜下观察并照相，对每只动物所有的胸腺切片均进行观察。在20倍物镜下，从每张切片的左上角开始，每隔1个视野取1个做分析，观察有无CGRP阳性纤维并记录，计算出含阳性纤维视野的数。
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2 结果
经免疫细胞化学法反应的胸腺切片背景着色较浅，阳性结构清晰，CGRP样免疫反应阳性产物呈蓝紫色或黑色。用中性红复染后，胸腺的组织学结构显示较清楚。空白对照实验未发现阳性染色。
对照组小鼠胸腺内CGRP样免疫反应阳性的纤维主要分布于被膜和小梁内，绝大部分围绕在血管周围。在较大血管的纵断面上，可见阳性纤
图1 正常和PPD免疫小鼠胸腺内CGRP样免疫阳性结构
Fig 1 CGRP like immunoreactive structures in the thymus of normal and PPD immunized mice(Immunocytochemical staining ， × 120)
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Notes:Microphotographes A and B showing respectively CGRP like immunoreactive fibers in the cortex of the normal and PPD immunized rat thymus. Microphotographes C and D showing CGRP like immunoreactive fibers in the medulla of the normal and PPD immunized rat thymus.Microphotograph E showing CGRP like immunoreactive fibers in the cortex of the thymus in normal rat.Microphotograph F showing the perivasicular CGRP like immunoreactive fibers which form network in the trabecula of thymus in the PPD immunized rat.
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维相互交织，在横断面上形成数层环状。也有一些CGRP阳性纤维在被膜和小梁中呈独立地走行。在胸腺实质内阳性纤维的数量很少,在20倍物镜下从每只动物随机选取20个视野，平均约每4个视野可见到有阳性纤维存在。一些阳性纤维从被膜走向皮质，分布于被膜下区，也有少数纤维走行于皮质深层的密集的淋巴细胞之间。皮、髓质交界处和髓质内也有少量CGRP阳性纤维分布。另外，胸腺髓质中一些较大的、三角形或椭圆形细胞亦呈CGRP样免疫反应阳性。
PPD再次免疫后7d，胸腺被囊、小梁内血管周围的CGRP阳性纤维数量明显增加，围绕血管形成复杂的纤维网，网中的纤维密度明显增多，也有的纤维聚集成束直行。阳性纤维的直径较粗，膨体少。实质内阳性纤维分布不均，亦多位于小血管周围；少数行于淋巴细胞间，其数量较对照组略有增加，在20倍物镜下平均每3.5个视野可见到阳性纤维。
3 讨论
胸腺是中枢性淋巴器官，许多证据表明，脑可通过神经内分泌通路和自主神经传出纤维影响胸腺的活动。交感神经化学切除术和免疫细胞化学技术，均已证明胸腺接受肾上腺素能、胆碱能和肽能神经纤维的支配〔1〕，这是脑调控免疫功能的直捷、快速联系。另外，神经、内分泌系统分泌的神经活性物质和激素可经循环系统至胸腺，作用于胸腺内免疫细胞上的相应受体而发挥作用。
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CGRP是一种由37个氨基酸组成的生物活性多肽，广泛地分布于中枢、外周神经系统及心血管系统等〔3，6〕。近年来许多研究表明，CGRP也存在于从胎鼠到老龄鼠的胸腺中〔7〕。胸腺内既存在CGRP能神经纤维〔4〕，胸腺上皮细胞甚或淋巴细胞本身也可以合成CGRP〔2，3〕。
大量研究表明，免疫应答过程中支配淋巴器官的交感神经纤维有明显的可塑性〔5〕，但免疫应答过程中胸腺内CGRP能纤维是否有变化还未见报道。PPD是一种胸腺依赖的抗原，既可用于体液免疫的研究，也可用于细胞免疫的研究。我们应用免疫组织化学ABC法，观察了正常小鼠胸腺内的CGRP阳性纤维及其细胞分布，以及两次PPD免疫后胸腺内CGRP阳性纤维的形态和数量变化。结果发现，正常对照组小鼠胸腺被囊和小梁中，存在CGRP样免疫反应阳性纤维，多围绕在血管周围，而胸腺实质内CGRP样纤维很少。我们发现，PPD免疫28d后，CGRP样阳性纤维的数量明显增加，主要出现于胸腺被囊和小梁内的血管周围；而胸腺实质内的CGRP阳性纤维免疫后较对照组仅略有增加。
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CGRP是目前体内抑制作用最强的舒血管物质，对躯体血管显示不同程度的量效依赖性舒张反应〔8〕。CGRP在心血管系统主要存在于支配心血管的感觉或自主神经末梢中〔6〕。我们发现，动物在免疫应激过程中，支配胸腺血管的CGRP能纤维的数量明显增加，提示分布于血管的CGRP神经丛可能以旁分泌的形式分泌CGRP，发挥扩血管作用，增加胸腺的血液供应。这与免疫应激过程中胸腺功能活动的增强相适应。
关于胸腺内CGRP能神经纤维的起源，有人将与辣根过氧化物酶结合的霍乱毒素B亚单位注入豚鼠颈段背根神经节，在同侧胸腺内发现标记的神经纤维，其形态与CGRP能神经纤维相似，提示CGRP能感觉性传入神经纤维支配胸腺，其胞体在背根神经节〔9〕。也有人推测，部分CGRP阳性纤维可能源于迷走神经复合体。我们推测，胸腺内CGRP能神经纤维的可塑性变化，可能是由于在针对特定抗原的免疫应答过程中，免疫信息通过免疫分子传递到中枢自主神经系统，进而影响了支配胸腺的迷走复合体和感觉神经元的活动，导致CGRP合成增加，从而表现为胸腺内CGRP纤维增多。CGRP可进而由终末释放，以旁分泌的形式发挥作用。
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越来越多的资料显示，免疫系统和神经内分泌系统共享一组结构相关的细胞因子受体和神经肽受体，免疫细胞本身可以合成神经肽，其上也有许多神经肽受体〔2〕。如前所述，CGRP还可在胸腺细胞内合成，并证实CGRP免疫反应存在于被膜下/血管周围的胸腺上皮细胞。最近，Xing等〔2〕采用放免测定、高压液相层析及反转录PCR法，发现大鼠胸腺细胞和肠系膜淋巴结细胞中有CGRP及其mRNA。也有一些证据提示，小鼠胸腺皮质和髓质细胞呈CGRP阳性〔10〕。近年来，越来越多的研究提示，CGRP直接参与免疫反应的调节。据报道，CGRP可调节巨噬细胞〔11〕、淋巴细胞〔12〕和其他免疫细胞〔13〕的功能。多种免疫细胞的亚群(包括巨噬细胞和淋巴细胞)都具有与cGMP生成相关的高亲和力CGRP受体〔3〕。CGRP与其受体结合后，可对免疫功能施加多种影响。一些研究显示，CGRP可强烈抑制免疫细胞的功能。体外研究显示，CGRP可减弱IFNγ或提呈抗原刺激巨噬细胞生成H2O2的能力，并能抑制有丝分裂原LPS在70Z/3细胞上对sIg蛋白表达的诱导作用，从而抑制前B细胞的分化〔3〕。CGRP可以剂量依赖的方式抑制ConA或PHA诱导的T细胞增殖〔10〕。其机制可能与其抑制IL2受体的表达有关。CGRP还可抑制淋巴细胞由IL2激发的杀伤活性〔15〕。另一方面，CGRP可对免疫细胞在受到刺激时细胞因子的生成进行调节，对IL-6和TNF-αmRNA的增加具有稳定作用，可通过细胞因子介导Swiss3T3成纤维细胞产生IL-6〔3〕。CGRP对T细胞和嗜酸性粒细胞有趋化作用〔16〕，并可促进嗜中性粒细胞与内皮细胞间的粘附〔11〕。新近Sakuta〔17〕等报道，CGRP还能增强淋巴细胞的凋亡，特别是CD4+CD8+的胸腺细胞。总之，CGRP在生物适应性、免疫系统的发生和体内平衡的维持中均起重要的作用，CGRP以自分泌或旁分泌的形式，参与中枢免疫器官内胸腺细胞的成熟、训育和选择。我们发现胸腺实质内有少量CGRP阳性纤维，在免疫应激时有轻度增加，可能反映了CGRP在免疫应激过程中对胸腺功能的负反馈作用。但本研究中观察到的胸腺髓质中CGRP样免疫反应阳性细胞的类型有待进一步用双标记的方法进行鉴别。■
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基金项目：国家自然科学基金资助，No.39830130; “九五” 重点基金资助，NO.962044
作者简介：段晓莉，女，30岁，实验员西安市长乐西路17号，Tel.(029)3374489Email: wbrnim@fmmu.cn 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit@fmmu.edu.cn
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收稿日期：1999-11-22
修回日期：1999-01-28, 百拇医药