人CD19基因在痘苗系统中的表达
作者：郭燕翔 胡美茹 舒翠玲 洪海燕 沈倍奋
单位：郭燕翔(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室 ， 北京 100850)；胡美茹(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室 ， 北京 100850)；舒翠玲(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室 ， 北京 100850)；洪海燕(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室 ， 北京 100850)；沈倍奋(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室 ， 北京 100850)
关键词：CD19； 痘苗系统 ；基因表达
细胞与分子免疫学杂志000306
摘要：目的 在痘苗系统中表达人CD19基因 ，为研究CD19分子的结构、功能及研制抗CD19的单克 隆抗体 (mAb)打下基础。方法 用 PCR技术扩增人CD19全长基因 ， 并重组入克隆载体pGEM T， 进行序列测定。将CD19全长基因克隆入痘苗表达载体pJSA1175中 ，用脂质体介导的方法， 与野生病毒共转染TK-143细胞 。运用蓝斑筛选获得含人CD19全长基因的重组痘苗病毒，并用此 重组病毒感 染 TK-143细胞 ， 以 APAAP法检测人CD19基因在真核细胞中的表达。结果 含人 CD19基因的重组痘苗病毒可表达在TK-143真核细胞的表面。结论 人CD19全长基因在痘苗系统中成功地得到表达。
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中图号 : Q786 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0200-05
Expression of human CD19 in vaccinia virus expression system
Guo Yan-xiang Hu Mei-ru Shu Cui-ling Hong Hai-yan Shen Bei-fen
(Department of Molecular Immunology， Institute of Basic Medical Sciences， Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China)
Abstract: Aim To express CD19 gene in vaccinia virus expression system and lay the foundation for preparing anti CD19 mAb and investigating its structure function relationship. Methods A fragment of CD19 gene obtained by PCR was inserted into pGEM T and sequenced. Recombinant vaccinia virus was obtained by transfecting TK- 143 cells with pJSA1175 CD19 plasmid in the presence of infectious TK+ vaccinia virus. APAAP method was used to detect the expression of CD19. Results The recombinant vaccinia virus bearing CD19 gene was found to express on the surface of TK- 143 cells. Conclusion The full length CD19 gene in vaccinia virus system was successfully expressed.
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Keywords: human CD19; vaccinia virus; gene expression ▲
CD19分子是B细胞表面相对分子质量(Mr)为95000的糖基化I型跨膜蛋白，仅表达于正常造血系统的B细胞和生发中心的滤泡树突状细胞(FDC)。CD19分子的表达在骨髓B祖细胞即开始，持续于整个B细胞成熟期，直至分化为浆细胞时消失〔1-4〕。CD19/CD21/CD81复合物与BCR形成B细胞的双重抗原结合模型，参与B细胞的信号转导〔8-10〕。另外，CD19分子可参与B细胞内Ca2+的移动，调节B细胞的活化与增殖〔5〕，还可通过mIgM的信号放大参与B1淋巴细胞的发育和再生〔6〕。研究发现，CD19分子还特异表达于B系恶性细胞中。国外曾利用抗CD19mAb的导向作用，与毒素连接形成免疫毒素，治疗白血病及淋巴瘤。本研究旨在痘苗系统中表达人CD19基因，以为抗CD19mAb的研制及对其结构、功能的研究奠定基础。
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1 材料和方法
1.1材料所用工具酶分别购自Promega公司和Gibco公司。DNA纯化试剂盒，购自Clontech公司。BuDr及Xgal购自Sigma公司。Lipofectin和MEM培养基，购自Gibco公司。重组质粒pUC19CD19，表达载体质粒pJSA1175和菌种Mc1061，由本室保存。pGEM-T-EASY载体试剂盒，购自Promega公司。TK-143细胞由本室保存，用含100mL/LFCS的MEM培养，培养液中含有250mg/L的Budr。
1.2方法
1.2.1DNA重组技术参照文献〔11，12〕中的有关章节。
1.2.2DNA序列测定采用T7启动子和SP6启动子作为上、下游引物，用本室ABI373A型DNA自动测序仪进行序列测定。
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1.2.3共转染用(0.05～0.1)pfu/细胞的野生痘苗病毒量，感染50%～90%贴壁的TK-143细胞。病毒感染的总体积为1mL。于37℃感染1.5h，每15min摇动培养瓶1次，使病毒充分吸附于细胞。期间制备质脂体-DNA混合液(参见GibcoLipofectin使用说明书进行质粒转染)。1.5h后移出病毒液，用无血清MEM培养基洗细胞3次，逐滴加入质脂体DNA混合液，轻轻转动培养瓶，使混合液均匀分布。于37℃培养4h～5h后，补加5mL含40mL/L小牛血清的MEM完全培养基，于37℃继续培养48h。连瓶一起反复冻融3次，以释放病毒，收集全部培养液作为病毒原液。
1.2.4病毒感染将病毒原液用含20mL/L小牛血清的MEM完全培养基做4次对数稀释。每个稀释度取1mL感染50%～90%贴壁的TK-143细胞，于37℃感染1.5h，每15min摇动培养瓶1次，使病毒充分吸附细胞。补加4mL含20mL/L小牛血清的MEM完全培养基，于37℃继续培养48h。然后，以结晶紫染色计数蚀斑或铺琼脂凝胶进行蓝斑筛选。
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1.2.5蓝斑筛选重组病毒病毒感染细胞48h后，去掉培养液，铺加营养琼脂(20mL/L小牛血清、10g/L琼脂糖和200mg/LXgal，融于MEM培养基中)。待琼脂糖凝固后反转培养瓶，37℃继续培养6～24h，观察病毒蚀斑的颜色变化，用前端弯曲的平头滴管挑取蓝斑，放于1mL含20mL/L小牛血清的MEM完全培养基中。反复冻融3次后，取0.5mL感染50%～90%贴壁的TK-143细胞。病毒感染48h后，倒掉培养液，铺加营养琼脂挑取蓝斑，如此反复3次以上，直到感染的细胞瓶中出现的病毒蚀斑达100%为蓝斑为止。
1.2.6结晶紫染色计数蚀斑病毒感染48h后的细胞，倒掉培养液，加1mL结晶紫染液(结晶紫1g，甲醇80mL和蒸馏水700mL)，室温放置5min后，用自来水冲去浮色计数蚀斑。
1.2.7表达蛋白的检测收集检测细胞，用PBS洗两次后离心甩片，自然吹干、丙酮固定10min，吹干。滴加抗CD19mAb(1∶50)15μL，室温作用30min后，用PBS洗3次，每次1min。然后滴加羊抗鼠IgG(1∶50)15μL，室温作用30min后，PBS洗3次，每次1min。滴加APAAP复合物15μL，室温作用30min，PBS洗3次，每次1min。滴加碱性磷酸酶底物溶液(含1g/L坚固红)，室温显色5～20min后，用水终止、甲基绿复染、明胶封片。
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1.2.8重组病毒的富集和滴度测定经APAAP法鉴定能稳定表达人CD19分子的重组痘苗病毒经4次传代后，在含有Xgal的营养琼脂上均为蓝色斑。挑取其中1个蚀斑于1mL维持液中，反复冻融3次后，感染Tk-143细胞(25mL小瓶)。48h后收集，冻融3次，再感染50mL培养瓶中的Tk-143细胞。48h后收集病毒，冻融3次，按1扩4的方式直至感染20个瓶中的细胞。48h后，以12000r/min离心15min，收集细胞，PBS洗两次。最后将沉淀放于5mLPBS中，反复冻融4次后，取上清分装小管，置20℃长期保存。病毒滴度的测定：以10倍稀释法稀释病毒，取0.5mL感染80%成片的TK-143细胞。吸附1.5h后，补加维持液5mL，继续培养48h，弃上清，用10g/L结晶紫室温染色计数空斑。计算公式为：
病毒滴度=空斑×2/病毒稀释度(pfu/mL)
2 结果
2.1人CD19全长基因的扩增根据CD19cDNA基因的序列，利用GOLDKEY软件，我们设计了扩增CD19全长基因的上游(P1)和下游(P2)引物，并将其中大肠杆菌的稀有密码子改为其偏爱密码子。同时，为了克隆表达的方便，我们在上、下游引物中均引入了酶切位点及保护碱基。引物的序列如下：
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P1：CGCGGATCCAAGCTTTGACCACCATGCCACCTCCTGG BamHIHindIII与CD19基因序列9～30bp互补
P2：TGCTCTAGAATTGTCCTGGCGACCGGCTGGG XbaI与CD19基因序列1420～1442bp互补
应用上述引物，以含有人CD19cDNA的质粒为模板，可扩增出1457bp的基因片段。电泳鉴定的结果如图1所示。
图1CD19基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig1AgarosegelelectrophoresismapofthePCRproductsof
CD19gene
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1：DL2000DNAmarker；2：FulllengthofCD19gene.
2.2重组质粒pGEMCD19的构建及序列测定我们将PCR产物与Promega公司的载体pGEMT连接，获得重组质粒pGEMCD19。用HindIII和XbaI双酶切鉴定，可切出约1437bp的片段，证实构建正确(图2)。以该克隆质粒为模板，以T7启动子和SP6启动子为上、下游引物，进行全自动测序的结果表明，其序列与文献报道的序列完全一致(结果未显示)。
图2重组质粒pGEMCD19的酶切鉴定
Fig2Restrictionenzymeanalysisofrecombinantplasmid
pGEMCD19
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1：MarkerλDNA/HindIII+EcoRI；2：FulllengthofCD19
gene；3：pGEMCD19/HindIII+XbaI.
2.3真核表达质粒的构建及鉴定将CD19全长基因片段从pGEMCD19中切下，连入pJSA1175痘苗表达载体中，获得表达质粒pJSA1175CD19(构建过程如图3所示)。因pJSA1175载体含两个EcoRI位点，故用EcoRI酶切获得约1857bp的片段，即为重组质粒；同时，利用该载体右侧多克隆位点上的1个BamHI位点，CD19全长基因片段上游的1个BamHI位点和其520bp的BglII位点，根据BamHI+BglII双酶切重组质粒片段的大小，即可判断CD19基因插入载体的方向。若切下约400bp的片段和520bp的片段为正向插入；切下约1337bp和520bp的片段则为反向插入。另外，载体和CD19基因片段上各有1个pstI位点，用pstI单酶切，若将质粒切成约4.6kbp和6.5kbp的片段，则为正向插入。酶切所切片段与预期结果相符，证明重组质粒连接正确(图4)。
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2.4重组痘苗病毒的蓝斑筛选含有人CD19基因的重组质粒借助于两侧TK基因区，在TK-143细胞与野生型天坛病毒(VTT)基因组可发生同源重组，故可采用BudR和lacZ双重筛选带有人CD19基因的重组痘苗病毒VCD19。由于外源基因插入载体pJSA1175的TK基因区，可导致TK基因失活，使重组痘苗病毒不受BudR的抑制而存活，形成病毒蚀斑，而非重组病毒则被BudR抑制而死亡。在药物选择压力下扩增重组病毒，同时借助与外源基因同步表达的lacZ在底物Xgal的存在下，显示蓝色蚀斑而挑选出重组痘苗病毒。经过4次克隆传代后，形成的病毒蚀斑达到100%呈蓝斑，表明重组病毒的纯度已达到要求(图5)。
图3重组质粒pJSA1175CD19的构建
Fig3ConstructionoftheexpressionplasmidpJSA1175CD19
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图4重组质粒pJSA1175CD19的酶切鉴定
Fig4Restrictionenzymeanalysisofrecombinantplasmid
pJSA1175CD19
1：MarkerλDNA/HindIII+EcoRI；2：pJSA1175CD19/pstI;
3：pJSA1175CD19/BglII+BamHI；4：pJSA1175CD19/EcoRI；
5：MarkerDL2000.
2.5CD19基因的表达用VCD19重组病毒感染TK-143细胞24h后，用免疫组化APAAP法检测CD19分子的表达情况。以野生型病毒VTT感染的TK-143细胞为阴性对照，结果表明，重组痘苗病毒感染的TK-143细胞胞膜及胞浆呈明显的红色；而野生病毒感染的TK-143细胞胞膜及胞浆呈透明(图6)。提示重组痘苗病毒表达的人CD19分子具有与特异性抗人CD19mAb结合的能力，而且被正确转运并定位于重组病毒感染的细胞膜上，其所表达的糖链与真核细胞相似。
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图5蓝斑筛选重组病毒
Fig5Screeningrecombinantvirusbyblueplague
I，IIandIIIrepresentthesecond,thirdandfourthgenerationofvirusplague,respectively.
2.6重组病毒的富集和滴度测定富集的重组病毒液用含20mL/LFCS的MEM完全培养基做7次对数稀释。取104～107的病毒液(总体积2mL)感染50%～90%贴壁的TK-143细胞，48h后以结晶紫染色。随着稀释度的增大，蚀斑数逐渐减少，106稀释度时共有46个蚀斑，所以病毒滴度约为1011pfu/L。
图7重组痘苗病毒滴度的测定
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Fig7Titredetectionoftherecombinantvacciniavirus
图6CD19分子表达的检测
Fig6DetectionofCD19expressionbyimmunochemicalstaining(APAAP,×400)
1：WildtypevirusTK-143；2：RecombinantvirusTK-143.
3 讨论
基因工程的最终目的是要在一合适的系统中，使外源基因高效表达，从而产生有重要价值的蛋白质产品。痘苗病毒载体系统使用于多种外源cDNA片段，且表达量较高，能够糖基化，具有分泌型和胞膜型两种。同时，其感染的细胞谱系广，便于研究外源基因在不同真核细胞中的表达情况。而且，应用痘苗病毒载体系统作为基因载体表达外源基因，表达产物具有与天然产物相似的生物学活性和理化性质。另外，重组痘苗病毒具有较好的免疫原性，已被广泛应用于研制疫苗及mAb或多克隆抗体的制备。
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我们将CD19全长基因克隆到痘苗病毒载体pJSA1175的TK基因区，从而导致TK基因失活，使重组痘苗病毒不受BudR的抑制而存活；而非重组病毒则被BudR抑制而死亡。经过蓝白斑筛选获得的重组人CD19痘苗病毒感染TK-143细胞后，可以通过免疫组化的方法，检测到人CD19分子表达在被感染细胞的表面。这样，我们可通过富集重组痘苗病毒而获得目的蛋白CD19，为研制抗人CD19mAb提供了条件，也为进一步研究其结构和功能的关系奠定了基础。■
基金项目：国家“863”生物技术抗体工程项目资助,No.102090103
作者简介：郭燕翔，女，28岁，博士生北京市太平路27号，Tel.(010)66931326 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit@fmmu.edu.cn
参考文献:
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收稿日期：1999-08-09
修回日期：1999-10-18, 百拇医药
单位：郭燕翔(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室 ， 北京 100850)；胡美茹(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室 ， 北京 100850)；舒翠玲(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室 ， 北京 100850)；洪海燕(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室 ， 北京 100850)；沈倍奋(军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室 ， 北京 100850)
关键词：CD19； 痘苗系统 ；基因表达
细胞与分子免疫学杂志000306
摘要：目的 在痘苗系统中表达人CD19基因 ，为研究CD19分子的结构、功能及研制抗CD19的单克 隆抗体 (mAb)打下基础。方法 用 PCR技术扩增人CD19全长基因 ， 并重组入克隆载体pGEM T， 进行序列测定。将CD19全长基因克隆入痘苗表达载体pJSA1175中 ，用脂质体介导的方法， 与野生病毒共转染TK-143细胞 。运用蓝斑筛选获得含人CD19全长基因的重组痘苗病毒，并用此 重组病毒感 染 TK-143细胞 ， 以 APAAP法检测人CD19基因在真核细胞中的表达。结果 含人 CD19基因的重组痘苗病毒可表达在TK-143真核细胞的表面。结论 人CD19全长基因在痘苗系统中成功地得到表达。
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Expression of human CD19 in vaccinia virus expression system
Guo Yan-xiang Hu Mei-ru Shu Cui-ling Hong Hai-yan Shen Bei-fen
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Abstract: Aim To express CD19 gene in vaccinia virus expression system and lay the foundation for preparing anti CD19 mAb and investigating its structure function relationship. Methods A fragment of CD19 gene obtained by PCR was inserted into pGEM T and sequenced. Recombinant vaccinia virus was obtained by transfecting TK- 143 cells with pJSA1175 CD19 plasmid in the presence of infectious TK+ vaccinia virus. APAAP method was used to detect the expression of CD19. Results The recombinant vaccinia virus bearing CD19 gene was found to express on the surface of TK- 143 cells. Conclusion The full length CD19 gene in vaccinia virus system was successfully expressed.
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Keywords: human CD19; vaccinia virus; gene expression ▲
CD19分子是B细胞表面相对分子质量(Mr)为95000的糖基化I型跨膜蛋白，仅表达于正常造血系统的B细胞和生发中心的滤泡树突状细胞(FDC)。CD19分子的表达在骨髓B祖细胞即开始，持续于整个B细胞成熟期，直至分化为浆细胞时消失〔1-4〕。CD19/CD21/CD81复合物与BCR形成B细胞的双重抗原结合模型，参与B细胞的信号转导〔8-10〕。另外，CD19分子可参与B细胞内Ca2+的移动，调节B细胞的活化与增殖〔5〕，还可通过mIgM的信号放大参与B1淋巴细胞的发育和再生〔6〕。研究发现，CD19分子还特异表达于B系恶性细胞中。国外曾利用抗CD19mAb的导向作用，与毒素连接形成免疫毒素，治疗白血病及淋巴瘤。本研究旨在痘苗系统中表达人CD19基因，以为抗CD19mAb的研制及对其结构、功能的研究奠定基础。
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1 材料和方法
1.1材料所用工具酶分别购自Promega公司和Gibco公司。DNA纯化试剂盒，购自Clontech公司。BuDr及Xgal购自Sigma公司。Lipofectin和MEM培养基，购自Gibco公司。重组质粒pUC19CD19，表达载体质粒pJSA1175和菌种Mc1061，由本室保存。pGEM-T-EASY载体试剂盒，购自Promega公司。TK-143细胞由本室保存，用含100mL/LFCS的MEM培养，培养液中含有250mg/L的Budr。
1.2方法
1.2.1DNA重组技术参照文献〔11，12〕中的有关章节。
1.2.2DNA序列测定采用T7启动子和SP6启动子作为上、下游引物，用本室ABI373A型DNA自动测序仪进行序列测定。
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1.2.3共转染用(0.05～0.1)pfu/细胞的野生痘苗病毒量，感染50%～90%贴壁的TK-143细胞。病毒感染的总体积为1mL。于37℃感染1.5h，每15min摇动培养瓶1次，使病毒充分吸附于细胞。期间制备质脂体-DNA混合液(参见GibcoLipofectin使用说明书进行质粒转染)。1.5h后移出病毒液，用无血清MEM培养基洗细胞3次，逐滴加入质脂体DNA混合液，轻轻转动培养瓶，使混合液均匀分布。于37℃培养4h～5h后，补加5mL含40mL/L小牛血清的MEM完全培养基，于37℃继续培养48h。连瓶一起反复冻融3次，以释放病毒，收集全部培养液作为病毒原液。
1.2.4病毒感染将病毒原液用含20mL/L小牛血清的MEM完全培养基做4次对数稀释。每个稀释度取1mL感染50%～90%贴壁的TK-143细胞，于37℃感染1.5h，每15min摇动培养瓶1次，使病毒充分吸附细胞。补加4mL含20mL/L小牛血清的MEM完全培养基，于37℃继续培养48h。然后，以结晶紫染色计数蚀斑或铺琼脂凝胶进行蓝斑筛选。
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1.2.5蓝斑筛选重组病毒病毒感染细胞48h后，去掉培养液，铺加营养琼脂(20mL/L小牛血清、10g/L琼脂糖和200mg/LXgal，融于MEM培养基中)。待琼脂糖凝固后反转培养瓶，37℃继续培养6～24h，观察病毒蚀斑的颜色变化，用前端弯曲的平头滴管挑取蓝斑，放于1mL含20mL/L小牛血清的MEM完全培养基中。反复冻融3次后，取0.5mL感染50%～90%贴壁的TK-143细胞。病毒感染48h后，倒掉培养液，铺加营养琼脂挑取蓝斑，如此反复3次以上，直到感染的细胞瓶中出现的病毒蚀斑达100%为蓝斑为止。
1.2.6结晶紫染色计数蚀斑病毒感染48h后的细胞，倒掉培养液，加1mL结晶紫染液(结晶紫1g，甲醇80mL和蒸馏水700mL)，室温放置5min后，用自来水冲去浮色计数蚀斑。
1.2.7表达蛋白的检测收集检测细胞，用PBS洗两次后离心甩片，自然吹干、丙酮固定10min，吹干。滴加抗CD19mAb(1∶50)15μL，室温作用30min后，用PBS洗3次，每次1min。然后滴加羊抗鼠IgG(1∶50)15μL，室温作用30min后，PBS洗3次，每次1min。滴加APAAP复合物15μL，室温作用30min，PBS洗3次，每次1min。滴加碱性磷酸酶底物溶液(含1g/L坚固红)，室温显色5～20min后，用水终止、甲基绿复染、明胶封片。
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1.2.8重组病毒的富集和滴度测定经APAAP法鉴定能稳定表达人CD19分子的重组痘苗病毒经4次传代后，在含有Xgal的营养琼脂上均为蓝色斑。挑取其中1个蚀斑于1mL维持液中，反复冻融3次后，感染Tk-143细胞(25mL小瓶)。48h后收集，冻融3次，再感染50mL培养瓶中的Tk-143细胞。48h后收集病毒，冻融3次，按1扩4的方式直至感染20个瓶中的细胞。48h后，以12000r/min离心15min，收集细胞，PBS洗两次。最后将沉淀放于5mLPBS中，反复冻融4次后，取上清分装小管，置20℃长期保存。病毒滴度的测定：以10倍稀释法稀释病毒，取0.5mL感染80%成片的TK-143细胞。吸附1.5h后，补加维持液5mL，继续培养48h，弃上清，用10g/L结晶紫室温染色计数空斑。计算公式为：
病毒滴度=空斑×2/病毒稀释度(pfu/mL)
2 结果
2.1人CD19全长基因的扩增根据CD19cDNA基因的序列，利用GOLDKEY软件，我们设计了扩增CD19全长基因的上游(P1)和下游(P2)引物，并将其中大肠杆菌的稀有密码子改为其偏爱密码子。同时，为了克隆表达的方便，我们在上、下游引物中均引入了酶切位点及保护碱基。引物的序列如下：
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P1：CGCGGATCCAAGCTTTGACCACCATGCCACCTCCTGG BamHIHindIII与CD19基因序列9～30bp互补
P2：TGCTCTAGAATTGTCCTGGCGACCGGCTGGG XbaI与CD19基因序列1420～1442bp互补
应用上述引物，以含有人CD19cDNA的质粒为模板，可扩增出1457bp的基因片段。电泳鉴定的结果如图1所示。
图1CD19基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig1AgarosegelelectrophoresismapofthePCRproductsof
CD19gene
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1：DL2000DNAmarker；2：FulllengthofCD19gene.
2.2重组质粒pGEMCD19的构建及序列测定我们将PCR产物与Promega公司的载体pGEMT连接，获得重组质粒pGEMCD19。用HindIII和XbaI双酶切鉴定，可切出约1437bp的片段，证实构建正确(图2)。以该克隆质粒为模板，以T7启动子和SP6启动子为上、下游引物，进行全自动测序的结果表明，其序列与文献报道的序列完全一致(结果未显示)。
图2重组质粒pGEMCD19的酶切鉴定
Fig2Restrictionenzymeanalysisofrecombinantplasmid
pGEMCD19
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1：MarkerλDNA/HindIII+EcoRI；2：FulllengthofCD19
gene；3：pGEMCD19/HindIII+XbaI.
2.3真核表达质粒的构建及鉴定将CD19全长基因片段从pGEMCD19中切下，连入pJSA1175痘苗表达载体中，获得表达质粒pJSA1175CD19(构建过程如图3所示)。因pJSA1175载体含两个EcoRI位点，故用EcoRI酶切获得约1857bp的片段，即为重组质粒；同时，利用该载体右侧多克隆位点上的1个BamHI位点，CD19全长基因片段上游的1个BamHI位点和其520bp的BglII位点，根据BamHI+BglII双酶切重组质粒片段的大小，即可判断CD19基因插入载体的方向。若切下约400bp的片段和520bp的片段为正向插入；切下约1337bp和520bp的片段则为反向插入。另外，载体和CD19基因片段上各有1个pstI位点，用pstI单酶切，若将质粒切成约4.6kbp和6.5kbp的片段，则为正向插入。酶切所切片段与预期结果相符，证明重组质粒连接正确(图4)。
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2.4重组痘苗病毒的蓝斑筛选含有人CD19基因的重组质粒借助于两侧TK基因区，在TK-143细胞与野生型天坛病毒(VTT)基因组可发生同源重组，故可采用BudR和lacZ双重筛选带有人CD19基因的重组痘苗病毒VCD19。由于外源基因插入载体pJSA1175的TK基因区，可导致TK基因失活，使重组痘苗病毒不受BudR的抑制而存活，形成病毒蚀斑，而非重组病毒则被BudR抑制而死亡。在药物选择压力下扩增重组病毒，同时借助与外源基因同步表达的lacZ在底物Xgal的存在下，显示蓝色蚀斑而挑选出重组痘苗病毒。经过4次克隆传代后，形成的病毒蚀斑达到100%呈蓝斑，表明重组病毒的纯度已达到要求(图5)。
图3重组质粒pJSA1175CD19的构建
Fig3ConstructionoftheexpressionplasmidpJSA1175CD19
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图4重组质粒pJSA1175CD19的酶切鉴定
Fig4Restrictionenzymeanalysisofrecombinantplasmid
pJSA1175CD19
1：MarkerλDNA/HindIII+EcoRI；2：pJSA1175CD19/pstI;
3：pJSA1175CD19/BglII+BamHI；4：pJSA1175CD19/EcoRI；
5：MarkerDL2000.
2.5CD19基因的表达用VCD19重组病毒感染TK-143细胞24h后，用免疫组化APAAP法检测CD19分子的表达情况。以野生型病毒VTT感染的TK-143细胞为阴性对照，结果表明，重组痘苗病毒感染的TK-143细胞胞膜及胞浆呈明显的红色；而野生病毒感染的TK-143细胞胞膜及胞浆呈透明(图6)。提示重组痘苗病毒表达的人CD19分子具有与特异性抗人CD19mAb结合的能力，而且被正确转运并定位于重组病毒感染的细胞膜上，其所表达的糖链与真核细胞相似。
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图5蓝斑筛选重组病毒
Fig5Screeningrecombinantvirusbyblueplague
I，IIandIIIrepresentthesecond,thirdandfourthgenerationofvirusplague,respectively.
2.6重组病毒的富集和滴度测定富集的重组病毒液用含20mL/LFCS的MEM完全培养基做7次对数稀释。取104～107的病毒液(总体积2mL)感染50%～90%贴壁的TK-143细胞，48h后以结晶紫染色。随着稀释度的增大，蚀斑数逐渐减少，106稀释度时共有46个蚀斑，所以病毒滴度约为1011pfu/L。
图7重组痘苗病毒滴度的测定
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Fig7Titredetectionoftherecombinantvacciniavirus
图6CD19分子表达的检测
Fig6DetectionofCD19expressionbyimmunochemicalstaining(APAAP,×400)
1：WildtypevirusTK-143；2：RecombinantvirusTK-143.
3 讨论
基因工程的最终目的是要在一合适的系统中，使外源基因高效表达，从而产生有重要价值的蛋白质产品。痘苗病毒载体系统使用于多种外源cDNA片段，且表达量较高，能够糖基化，具有分泌型和胞膜型两种。同时，其感染的细胞谱系广，便于研究外源基因在不同真核细胞中的表达情况。而且，应用痘苗病毒载体系统作为基因载体表达外源基因，表达产物具有与天然产物相似的生物学活性和理化性质。另外，重组痘苗病毒具有较好的免疫原性，已被广泛应用于研制疫苗及mAb或多克隆抗体的制备。
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我们将CD19全长基因克隆到痘苗病毒载体pJSA1175的TK基因区，从而导致TK基因失活，使重组痘苗病毒不受BudR的抑制而存活；而非重组病毒则被BudR抑制而死亡。经过蓝白斑筛选获得的重组人CD19痘苗病毒感染TK-143细胞后，可以通过免疫组化的方法，检测到人CD19分子表达在被感染细胞的表面。这样，我们可通过富集重组痘苗病毒而获得目的蛋白CD19，为研制抗人CD19mAb提供了条件，也为进一步研究其结构和功能的关系奠定了基础。■
基金项目：国家“863”生物技术抗体工程项目资助,No.102090103
作者简介：郭燕翔，女，28岁，博士生北京市太平路27号，Tel.(010)66931326 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit@fmmu.edu.cn
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收稿日期：1999-08-09
修回日期：1999-10-18, 百拇医药