编码弓形虫ROP1蛋白基因的体外扩增、克隆及在E.coli中的表达*
作者：郭虹 陈观今 刘彦文 郑焕钦 罗树红
单位：中山医科大学寄生虫学研究所(广州，510089)
关键词：弓形虫；棒状体蛋白1；基因；克隆；表达
中国人兽共患病杂志990205 摘 要 目的 构建弓形虫棒状体蛋白(ROP1)基因重组质粒并在E.coli中表达。方法 用RH株接种小鼠，收集腹水，纯化速殖子，抽提基因组DNA；据ROP1基因序列设计合成一对引物，将上、下游引物分别引入EcoRI，BamHI酶切位点，用PCR技术从RH株基因组DNA中扩增编码ROP1的基因片段，插入pBV220质粒，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，于氨苄阳性LB培养平板上筛选阳性克隆，酶切鉴定；经温度诱导在E.coli中表达，SDS-PAGE及免疫印迹分析。结果 ROP1基因体外扩增产物大小与预期值相符，约756bp；构建成功pBV220-ROP1重组质粒；SDS-PAGE、免疫印迹显示特异蛋白条带的分子量约43kD，表达产量约占菌体蛋白13.23%。结论 从弓形虫基因组DNA中获取ROP1基因，并成功构建pBV220-ROP1重组质粒，诱导表达ROP1非融合蛋白，为进一步分离纯化、用于对弓形虫侵入机制及免疫特性的研究做好准备。
, http://www.100md.com
AMPLIFICATION，CLONING AND EXPRESSION IN E.COLI OF
THE GENE ENCODING ROP1 PROTEIN FROM
TOXOPLASMA GONDII IN VITRO
Guo Hong Chen Guanjin Liu Yanwen et al
(Institute of Parasitology，Sun Yat-Sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510089)
ABSTRACT Aim Construction of recombinant plasmid contained a gene encoding rhoptry protein 1 (ROP1) of Toxoplasma gondii and expression in E.coli.Methods Injecting mice with RH strain tachyzoites then harvesting infected ascites of mice，purifying tachyzoites and preparing genomic DNA.One pair of primers were designed according to the sequence of ROP1.Using PCR technique，a fragment of ROP1 gene was obtained by amplification of genomic DNA of tachyzoites.By cloning target gene into a high level expression vector，pBV220，a recombinant pBV220-ROP1 was constructed.Transferring pBV220-ROP1 into E.coli DH5 α，the nonfusion recombinant protein was expressed by temperature eliciting and was analyzed by means of SDS-PAGE and Western-blot.Results The size of the amplification ROP1 gene fragment was in accordance with the expected one matelly inditing the recombinant pBV220-ROP1 was successfully constructed.The results of SDS-PAGE and Western-blot revealed that the molecular weight of recombinant protein was approximately 43kD and can be specifically recognized by rabbit antiserum of Toxoplasma.Conclusion The gene encoding ROP1 was amplified from genomic DNA of Toxoplasma and pBV220-ROP1 recombinant was successfully constructed.The recombinant ROP1 protein was expressed in E.coli and will be used to carry out further study in pathology and immunology of T.gondii.
, 百拇医药
KEY WORDS Toxoplasma gondii Rhoptry proteinl Gene cloning Expression
对细胞内专性寄生虫弓形虫(Toxoplasma gondii)而言，侵入宿主细胞是虫体得以生存及繁殖的前提。当虫体侵入宿主细胞时需经识别、定位、附着、运动等一系列主动过程[1]。早在1966年Lycke等发现在弓形虫侵入过程中，可分泌产生一种能促进虫体侵入的物质，称之为因子(Penetration enhancing factor，PEF)[2]，然而PEF的确切成分一直不清楚。近来的研究发现，弓形虫的单克隆抗体TG49可抑制PEF的活性，同时可识别弓形虫的棒状体蛋白1(Rhoptry proteinl，ROP1)，从而提出ROP1可能就是PEF[3]。ROP1是存在于速殖子棒状体内的一种蛋白质，初步分析棒状体内约有11种蛋白质[4]，组成成分复杂，欲大量分离获取ROP1较为困难。本文采用基因扩增及重组技术，构建了ROP1基因重组质粒，并在E.coli中进行了表达。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 弓形虫虫株 国际标准株RH液氮保种
1.1.2 菌株和质粒 E.coli DH5 α与表达质粒pBV220均为本室保存。
1.1.3 PCR引物 据ROP1基因序列自行设计，经计算机“PCGENE”软件分析，由上海生工生物工程公司合成。两条引物5＇端分别引入EcoR I和BamH I限制性内切酶切点。上游引物为5’CAGAATCCATGGACTTCGCCTCCGACGAC，下游引物为5＇CGGGATCCTTACAGACTGGCACCACTTGT。其中两条引物5＇端的CA及CG分别是保护性碱基，ATG与TTA分别为起始及终止密码子。
1.1.4 主要试剂 限制性内切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ及PCR标准为华美公司产品，DNAT4连接酶为Promega产品，dNTP及Taq酶购自广州加拿大真达公司。SDS-PAGE试剂为Sigma公司产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 抗弓形虫高免兔血清的制备 用RH虫株接种昆明远交系小白鼠，于接种3天后收取腹水，纯化虫体，超声破碎，离心取上清作为弓形虫速殖子可溶性抗原。免疫新西兰家兔，方法参照文献[5]。
1.2.2 弓形虫基因组DNA的提取 按文献[6]进行。
1.2.3 ROP1基因扩增 以提取的基因组DNA为模板，反应条件为：预变性：96℃min，变性：94℃45s，退火：55℃45s，复性：72℃90s，共30个循环。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，低融点琼脂糖法回收。
1.2.4 ROP1基因重组质粒构建 用EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ双酶消化ROP1扩增回收产物及pBV-220质粒，将酶切后的ROP1基因定向插入pBV220的PRPL启动子下游的Ecor Ⅰ，BamH Ⅰ多克隆位点，构建重组质粒pBV220-ROP1，并转化E.coli DH5 α 感受态细胞；快速酚法筛选阳性克隆，EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ单、双酶切，1%琼脂糖电泳鉴定。
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1.2.5 重组质粒的表达 含有外源基因表达载体的菌种于30℃活化过夜后，1∶100稀释到100mlLB氨苄阳性培养液中，30℃250r/min恒温摇床培养至对数生长中期，即刻转入42℃振摇诱导6h。离心沉淀菌体，用3mlTE重悬，超声波破碎，15000r/min、4℃离心30min，取上清进行SDS-PAGE。
1.2.6 表达产物分析 SDS-PAGE按[7]，分离胶15%，浓缩胶5%。Western-blot参照[7]，抗弓形虫兔高免血清1∶50稀释，羊抗兔HRP第二抗体1∶500释释。
2 结 果
2.1 免疫血清效价ELISA测定1∶3200。
2.2 ROP1基因重组质粒的鉴定 从RH分离株基因组DNA中扩增出ROP1基因片段，根据引物1及引物2的理论扩增值，ROP1的PCR片段应为756bp，1%琼脂糖，扩增产物泳动速率与理论值大小基本相符，插入目的基因片段的重组质粒pBV220-ROP1，用EcoR Ⅰ单酶切后，电泳条带的迁移率略慢于空载质粒；用EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ双酶切后，出现一条大小与ROP1扩增条带迁移率相同的电泳带，表明已获得正确克隆(图1)。
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2.3 pBV220-ROP1在E.coli DH5 α中的表达产物分析鉴定
SDS-PAGE电泳凝胶经考马斯亮蓝染色，可见在42℃诱导后，pBV220-ROP1出现一条43kD蛋白带(图2)，分子量大于预测理论值(30kD)。未诱导的重组子及空载质粒未显示此带。蛋白含量扫描分析，表达的蛋白量约占菌体总蛋白的13.23%(图3)。免疫印迹分析，该蛋白带能被弓形虫高免兔血清所识别(图4)。
图1.弓形虫ROP1基因PCR及pBV220-ROP1重组子酶切鉴定结果
1.pBV220 Ecor Ⅰ，BamH Ⅰ双酶切 2.pBV220-ROP1 EcoR Ⅰ单酶切
3.pBV220-ROP1 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ双酶切 4.ROP1 PCR产物 5.PCR标准
, 百拇医药
Fig.1 The results of PCR for gene encoding ROP1 of Toxoplasma and identification of pBV220-ROP1 recombinant by digesting using restrict enzymes. 1.pBV220 Ecor Ⅰ，BamH Ⅰ double enzymes digested 2.pBV220-ROP1 EcoR Ⅰ digested
3.pBV220-ROP1 EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ double enzymes digested 4.The PCR product of ROP1
5.PCR markers
图2 pBV220-ROP1表达产物SDS-PAGE结果
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1.DH5 α 2，8.PBV-220 3，7.pBV-220-ROP1未诱导
4，6，10.pBV-220-ROP1 42℃诱导 5.分子量标准
Fig.2 SDS-PAGE results for the expression products of pBV220-ROP1 recombinant
1.DH5 α 2，8.pBV220 3，7.pBV220-ROP1 uninduced
4，6，10.pBV220-ROP1 42℃ induced 5.Low molecular weight Markers
图3.pBV220-ROP2表达产物含量分析
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条带6为表达产物
Fig.3 The content analysis of pBV220-ROP1expression product The sixth band is expression protein
图4.pBV220-ROP1表达产物免疫印记分析
1，3，5为弓形虫免疫血清识别的ROP1重组子表达产物条带
2.弓形虫抗原对照 4.分子量标准 6.未诱导pBV220-ROP1
7.pBV220 8.DN5 α
Fig.4 Western-blot analysis of pBV220-ROP1 expression product1，3，5 pBV220-ROP1 recombinant protein band recognized by rabbit antiserum of Toxoplasma 2.Toxoplasma antigen control 4.Low molecular weight markers 6.BV220-ROP1 uninduced 7.BV220 8.DN5 α
, 百拇医药
3 讨 论
Ossorio等报道的弓形虫ROP1基因是单拷贝，全长约2.1kb[3]。该基因序列显示出一些有趣的特征，包括两个各尾随一疏水区的潜在的其始密码子，具特殊的不对称性，富脯氨酸的酸性区继之是富甘氨酸的碱性区。本文扩增的ROP1基因片段，是原序列的第395碱基至1151个碱基，共756bp，略去了上游序列的第1、第2起位点，信号序列及下游的非编码区，包括了ROP1基因含6个富脯氨酸的重复序列及高度不对称的特殊结构[3]，这些特殊的编码基因序列结构，可能与所转录的ROP1蛋白的功能密切相关。
将ROP1基因片段插入原核高效表达质粒pBV220[8]，在E.coli DH5 α体系中表达非融合蛋白，便于对表达产物进一步研究及应用。插入的外源基因如为抗原蛋白基因，所表达的非融合蛋白的特异性可高于融合蛋白。该体系的表达产物，能特异性地被弓形虫抗血清所识别，然而在SDS-PAGE凝胶中的迁移率明显慢于理论预测值，分子量超出约13kD。Ossorio[3]等在pEXP1.1、pOTs-E.coli AR120体系中表达全序列ROP1蛋白基因时，表达产物比序列分析预测值大了约31kD，并认为这种异常的迁移速率似乎不是由于转录后修饰形成，因为这一现象同时出现在该天然及重组蛋白。ROP1蛋白的迁移率可能反映了其不寻常的氨基酸肽链的组成。不少蛋白在SDS-PAGE分析时迁移率异常，特别是富脯氨酸蛋白[3，9]。pBV220-ROP1表达了ROP1蛋白含富脯氨酸的重复序列的特殊结构的部分成分，所显示的增大的分子量可能与这种特殊结构有关，与Ossorio等报道的结果基本一致。
, 百拇医药
有关弓形虫抗原，研究较多的属弓形虫主要膜抗原P30[10]，对ROP1的研究少有报道。ROP1属于分泌抗原，在虫体侵入宿主细胞时从棒状体内释出[11]，具有较强的免疫原性。在弓形虫组织培养液的上清中，存在着可促进虫体侵入宿主细胞的促进因子(PEF)[3]，二者能同时被弓形虫单克隆抗体TG49所识别，可能为同一分子，通过对ROP1分子可探讨弓形虫的致病机制，欲进一步研究ROP1的生物活性及其在虫体侵入过程中的作用，研究其免疫学特性，利用DNA重组技术获取大量ROP1是很有必要的。
*该研究为中山医大“211”重点学科建设科题
4 参考文献
1.Werk R.How does Toxoplasma gondii enter host cells?Rev Infect Dis，1985，7∶449.
, 百拇医药
2.Lycke E，et al.Demonstration of a factor of Toxoplasma gondii enhencing the penetration of toxoplasma parasites into cultured host cells.Br J Exp Pathol，1966，47∶248.
3.Ossorio P N，et al.A Toxoplasma gondii rhoptry protein associated with host cell penetration has unusual charge asymmetry.Mol Biochem Parasitol，1992，50∶1.
4.Leriche M A，and Dubremetz J F.Characterization of the protein contents of rhoptries and dense granules of Toxoplasma gondii tachyzoites by subcelular fraction and monoclonal antibodies.Mol Biochem Parasitol，1991，45∶294.
, http://www.100md.com
5.李成文编著.现代免疫化学技术.上海：上海科学技术出版社，1992，235～238.
6.姜泊，等主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996，65～67.
7.金冬雁，等译.分子克隆实验指南.第二版，北京：科学出版社，1993，852～897.
8.张智清，等.含PPRL启动子的原核高效表达载体的组建及应用.病毒学报，1990，6(2)∶111.
9.Roditi I，et al.Expression of Trypanoasome brucei procyclin as a fusion protein in Escherichia coli.Mol Biochem Parasitol，1989，34∶35.
10.Kasper L H，et al.Purification of a major membrane protein of Toxoplasma gondii by immunoabsorption with a monoclonal antibody.J Immunol，1983，135∶2407.
11.Nichls B A，et al.Secretion from the rhoptries of Toxoplasma gondii during host-cell invasion.J Ultrastruct Res，1983，83∶85.
1998年2月12日收稿, 百拇医药
单位：中山医科大学寄生虫学研究所(广州，510089)
关键词：弓形虫；棒状体蛋白1；基因；克隆；表达
中国人兽共患病杂志990205 摘 要 目的 构建弓形虫棒状体蛋白(ROP1)基因重组质粒并在E.coli中表达。方法 用RH株接种小鼠，收集腹水，纯化速殖子，抽提基因组DNA；据ROP1基因序列设计合成一对引物，将上、下游引物分别引入EcoRI，BamHI酶切位点，用PCR技术从RH株基因组DNA中扩增编码ROP1的基因片段，插入pBV220质粒，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，于氨苄阳性LB培养平板上筛选阳性克隆，酶切鉴定；经温度诱导在E.coli中表达，SDS-PAGE及免疫印迹分析。结果 ROP1基因体外扩增产物大小与预期值相符，约756bp；构建成功pBV220-ROP1重组质粒；SDS-PAGE、免疫印迹显示特异蛋白条带的分子量约43kD，表达产量约占菌体蛋白13.23%。结论 从弓形虫基因组DNA中获取ROP1基因，并成功构建pBV220-ROP1重组质粒，诱导表达ROP1非融合蛋白，为进一步分离纯化、用于对弓形虫侵入机制及免疫特性的研究做好准备。
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AMPLIFICATION，CLONING AND EXPRESSION IN E.COLI OF
THE GENE ENCODING ROP1 PROTEIN FROM
TOXOPLASMA GONDII IN VITRO
Guo Hong Chen Guanjin Liu Yanwen et al
(Institute of Parasitology，Sun Yat-Sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510089)
ABSTRACT Aim Construction of recombinant plasmid contained a gene encoding rhoptry protein 1 (ROP1) of Toxoplasma gondii and expression in E.coli.Methods Injecting mice with RH strain tachyzoites then harvesting infected ascites of mice，purifying tachyzoites and preparing genomic DNA.One pair of primers were designed according to the sequence of ROP1.Using PCR technique，a fragment of ROP1 gene was obtained by amplification of genomic DNA of tachyzoites.By cloning target gene into a high level expression vector，pBV220，a recombinant pBV220-ROP1 was constructed.Transferring pBV220-ROP1 into E.coli DH5 α，the nonfusion recombinant protein was expressed by temperature eliciting and was analyzed by means of SDS-PAGE and Western-blot.Results The size of the amplification ROP1 gene fragment was in accordance with the expected one matelly inditing the recombinant pBV220-ROP1 was successfully constructed.The results of SDS-PAGE and Western-blot revealed that the molecular weight of recombinant protein was approximately 43kD and can be specifically recognized by rabbit antiserum of Toxoplasma.Conclusion The gene encoding ROP1 was amplified from genomic DNA of Toxoplasma and pBV220-ROP1 recombinant was successfully constructed.The recombinant ROP1 protein was expressed in E.coli and will be used to carry out further study in pathology and immunology of T.gondii.
, 百拇医药
KEY WORDS Toxoplasma gondii Rhoptry proteinl Gene cloning Expression
对细胞内专性寄生虫弓形虫(Toxoplasma gondii)而言，侵入宿主细胞是虫体得以生存及繁殖的前提。当虫体侵入宿主细胞时需经识别、定位、附着、运动等一系列主动过程[1]。早在1966年Lycke等发现在弓形虫侵入过程中，可分泌产生一种能促进虫体侵入的物质，称之为因子(Penetration enhancing factor，PEF)[2]，然而PEF的确切成分一直不清楚。近来的研究发现，弓形虫的单克隆抗体TG49可抑制PEF的活性，同时可识别弓形虫的棒状体蛋白1(Rhoptry proteinl，ROP1)，从而提出ROP1可能就是PEF[3]。ROP1是存在于速殖子棒状体内的一种蛋白质，初步分析棒状体内约有11种蛋白质[4]，组成成分复杂，欲大量分离获取ROP1较为困难。本文采用基因扩增及重组技术，构建了ROP1基因重组质粒，并在E.coli中进行了表达。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 弓形虫虫株 国际标准株RH液氮保种
1.1.2 菌株和质粒 E.coli DH5 α与表达质粒pBV220均为本室保存。
1.1.3 PCR引物 据ROP1基因序列自行设计，经计算机“PCGENE”软件分析，由上海生工生物工程公司合成。两条引物5＇端分别引入EcoR I和BamH I限制性内切酶切点。上游引物为5’CAGAATCCATGGACTTCGCCTCCGACGAC，下游引物为5＇CGGGATCCTTACAGACTGGCACCACTTGT。其中两条引物5＇端的CA及CG分别是保护性碱基，ATG与TTA分别为起始及终止密码子。
1.1.4 主要试剂 限制性内切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ及PCR标准为华美公司产品，DNAT4连接酶为Promega产品，dNTP及Taq酶购自广州加拿大真达公司。SDS-PAGE试剂为Sigma公司产品。
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1.2 方法
1.2.1 抗弓形虫高免兔血清的制备 用RH虫株接种昆明远交系小白鼠，于接种3天后收取腹水，纯化虫体，超声破碎，离心取上清作为弓形虫速殖子可溶性抗原。免疫新西兰家兔，方法参照文献[5]。
1.2.2 弓形虫基因组DNA的提取 按文献[6]进行。
1.2.3 ROP1基因扩增 以提取的基因组DNA为模板，反应条件为：预变性：96℃min，变性：94℃45s，退火：55℃45s，复性：72℃90s，共30个循环。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，低融点琼脂糖法回收。
1.2.4 ROP1基因重组质粒构建 用EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ双酶消化ROP1扩增回收产物及pBV-220质粒，将酶切后的ROP1基因定向插入pBV220的PRPL启动子下游的Ecor Ⅰ，BamH Ⅰ多克隆位点，构建重组质粒pBV220-ROP1，并转化E.coli DH5 α 感受态细胞；快速酚法筛选阳性克隆，EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ单、双酶切，1%琼脂糖电泳鉴定。
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1.2.5 重组质粒的表达 含有外源基因表达载体的菌种于30℃活化过夜后，1∶100稀释到100mlLB氨苄阳性培养液中，30℃250r/min恒温摇床培养至对数生长中期，即刻转入42℃振摇诱导6h。离心沉淀菌体，用3mlTE重悬，超声波破碎，15000r/min、4℃离心30min，取上清进行SDS-PAGE。
1.2.6 表达产物分析 SDS-PAGE按[7]，分离胶15%，浓缩胶5%。Western-blot参照[7]，抗弓形虫兔高免血清1∶50稀释，羊抗兔HRP第二抗体1∶500释释。
2 结 果
2.1 免疫血清效价ELISA测定1∶3200。
2.2 ROP1基因重组质粒的鉴定 从RH分离株基因组DNA中扩增出ROP1基因片段，根据引物1及引物2的理论扩增值，ROP1的PCR片段应为756bp，1%琼脂糖，扩增产物泳动速率与理论值大小基本相符，插入目的基因片段的重组质粒pBV220-ROP1，用EcoR Ⅰ单酶切后，电泳条带的迁移率略慢于空载质粒；用EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ双酶切后，出现一条大小与ROP1扩增条带迁移率相同的电泳带，表明已获得正确克隆(图1)。
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2.3 pBV220-ROP1在E.coli DH5 α中的表达产物分析鉴定
SDS-PAGE电泳凝胶经考马斯亮蓝染色，可见在42℃诱导后，pBV220-ROP1出现一条43kD蛋白带(图2)，分子量大于预测理论值(30kD)。未诱导的重组子及空载质粒未显示此带。蛋白含量扫描分析，表达的蛋白量约占菌体总蛋白的13.23%(图3)。免疫印迹分析，该蛋白带能被弓形虫高免兔血清所识别(图4)。
图1.弓形虫ROP1基因PCR及pBV220-ROP1重组子酶切鉴定结果
1.pBV220 Ecor Ⅰ，BamH Ⅰ双酶切 2.pBV220-ROP1 EcoR Ⅰ单酶切
3.pBV220-ROP1 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ双酶切 4.ROP1 PCR产物 5.PCR标准
, 百拇医药
Fig.1 The results of PCR for gene encoding ROP1 of Toxoplasma and identification of pBV220-ROP1 recombinant by digesting using restrict enzymes. 1.pBV220 Ecor Ⅰ，BamH Ⅰ double enzymes digested 2.pBV220-ROP1 EcoR Ⅰ digested
3.pBV220-ROP1 EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ double enzymes digested 4.The PCR product of ROP1
5.PCR markers
图2 pBV220-ROP1表达产物SDS-PAGE结果
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1.DH5 α 2，8.PBV-220 3，7.pBV-220-ROP1未诱导
4，6，10.pBV-220-ROP1 42℃诱导 5.分子量标准
Fig.2 SDS-PAGE results for the expression products of pBV220-ROP1 recombinant
1.DH5 α 2，8.pBV220 3，7.pBV220-ROP1 uninduced
4，6，10.pBV220-ROP1 42℃ induced 5.Low molecular weight Markers
图3.pBV220-ROP2表达产物含量分析
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条带6为表达产物
Fig.3 The content analysis of pBV220-ROP1expression product The sixth band is expression protein
图4.pBV220-ROP1表达产物免疫印记分析
1，3，5为弓形虫免疫血清识别的ROP1重组子表达产物条带
2.弓形虫抗原对照 4.分子量标准 6.未诱导pBV220-ROP1
7.pBV220 8.DN5 α
Fig.4 Western-blot analysis of pBV220-ROP1 expression product1，3，5 pBV220-ROP1 recombinant protein band recognized by rabbit antiserum of Toxoplasma 2.Toxoplasma antigen control 4.Low molecular weight markers 6.BV220-ROP1 uninduced 7.BV220 8.DN5 α
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3 讨 论
Ossorio等报道的弓形虫ROP1基因是单拷贝，全长约2.1kb[3]。该基因序列显示出一些有趣的特征，包括两个各尾随一疏水区的潜在的其始密码子，具特殊的不对称性，富脯氨酸的酸性区继之是富甘氨酸的碱性区。本文扩增的ROP1基因片段，是原序列的第395碱基至1151个碱基，共756bp，略去了上游序列的第1、第2起位点，信号序列及下游的非编码区，包括了ROP1基因含6个富脯氨酸的重复序列及高度不对称的特殊结构[3]，这些特殊的编码基因序列结构，可能与所转录的ROP1蛋白的功能密切相关。
将ROP1基因片段插入原核高效表达质粒pBV220[8]，在E.coli DH5 α体系中表达非融合蛋白，便于对表达产物进一步研究及应用。插入的外源基因如为抗原蛋白基因，所表达的非融合蛋白的特异性可高于融合蛋白。该体系的表达产物，能特异性地被弓形虫抗血清所识别，然而在SDS-PAGE凝胶中的迁移率明显慢于理论预测值，分子量超出约13kD。Ossorio[3]等在pEXP1.1、pOTs-E.coli AR120体系中表达全序列ROP1蛋白基因时，表达产物比序列分析预测值大了约31kD，并认为这种异常的迁移速率似乎不是由于转录后修饰形成，因为这一现象同时出现在该天然及重组蛋白。ROP1蛋白的迁移率可能反映了其不寻常的氨基酸肽链的组成。不少蛋白在SDS-PAGE分析时迁移率异常，特别是富脯氨酸蛋白[3，9]。pBV220-ROP1表达了ROP1蛋白含富脯氨酸的重复序列的特殊结构的部分成分，所显示的增大的分子量可能与这种特殊结构有关，与Ossorio等报道的结果基本一致。
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有关弓形虫抗原，研究较多的属弓形虫主要膜抗原P30[10]，对ROP1的研究少有报道。ROP1属于分泌抗原，在虫体侵入宿主细胞时从棒状体内释出[11]，具有较强的免疫原性。在弓形虫组织培养液的上清中，存在着可促进虫体侵入宿主细胞的促进因子(PEF)[3]，二者能同时被弓形虫单克隆抗体TG49所识别，可能为同一分子，通过对ROP1分子可探讨弓形虫的致病机制，欲进一步研究ROP1的生物活性及其在虫体侵入过程中的作用，研究其免疫学特性，利用DNA重组技术获取大量ROP1是很有必要的。
*该研究为中山医大“211”重点学科建设科题
4 参考文献
1.Werk R.How does Toxoplasma gondii enter host cells?Rev Infect Dis，1985，7∶449.
, 百拇医药
2.Lycke E，et al.Demonstration of a factor of Toxoplasma gondii enhencing the penetration of toxoplasma parasites into cultured host cells.Br J Exp Pathol，1966，47∶248.
3.Ossorio P N，et al.A Toxoplasma gondii rhoptry protein associated with host cell penetration has unusual charge asymmetry.Mol Biochem Parasitol，1992，50∶1.
4.Leriche M A，and Dubremetz J F.Characterization of the protein contents of rhoptries and dense granules of Toxoplasma gondii tachyzoites by subcelular fraction and monoclonal antibodies.Mol Biochem Parasitol，1991，45∶294.
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5.李成文编著.现代免疫化学技术.上海：上海科学技术出版社，1992，235～238.
6.姜泊，等主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996，65～67.
7.金冬雁，等译.分子克隆实验指南.第二版，北京：科学出版社，1993，852～897.
8.张智清，等.含PPRL启动子的原核高效表达载体的组建及应用.病毒学报，1990，6(2)∶111.
9.Roditi I，et al.Expression of Trypanoasome brucei procyclin as a fusion protein in Escherichia coli.Mol Biochem Parasitol，1989，34∶35.
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1998年2月12日收稿, 百拇医药