γ-干扰素和地塞米松对成纤维细胞生长的影响
作者：崔玉芳 高亚兵 杨红 熊呈琦 夏国伟 王德文
单位：100850 北京放射医学研究所
关键词：γ-干扰素；地塞米松 IL-1；成纤维细胞；Ⅲ型胶原；增殖抑制
中华放射医学与防护杂志/990411 【摘要】 目的 观察γ-干扰素(IFN-γ)和地塞米松(Dexa)对正常和IL-1刺激的成纤维细胞生长的影响，旨在从细胞因子角度为抗纤维化有效措施的制定提供依据。方法 用MTT比色、AgNORs银染和免疫组化技术，观察两种抑制剂对成纤维细胞增殖、AgNORs合成和Ⅲ型胶原表达的影响。结果 250×103 U/L浓度的IFN-γ和100 μg/L浓度的Dexa均能明显抑制正常和IL-1刺激的成纤维细胞增殖、AgNORs合成和Ⅲ型胶原表达。结论 一定浓度的IFN-γ和Dexa对正常和IL-1刺激的成纤维细胞生长、增殖、AgNORs合成和Ⅲ型胶原表达均显示出明显的抑制作用。
, 百拇医药
Effects of interferon-γand dexamathasone on growth of fibroblasts stimulated by interleukin-1
CUI Yufang, GAO Yabing, YANG Hong, et al.
Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China.
【Abstract】 Objectives Our studies were aimed at providing a basis for effective therapeutic strategy against fibrosis using cytokines through observing the effects of interferon-γ (IFN-γ) and dexamathasone (dexa) on growth of normal and interleukin-1(IL-1)-stimulated fibroblasts. Methods MTT colorimetry,a silver colloid technique to identify nucleolar organizer regions (AgNORs) and immunohistochemical methods were used to study the effects of the two inhibitors on growth of fibroblasts. Results Growth,proliferation activity,synthesis of AgNORs and expression of collagen type Ⅲ in normal and IL-1-stimulated fibroblasts were depressed evidently by IFN-γ at 250×103 U/L and dexa at 100μg/L. Conclusions The authors believe that IFN-γ and dexa at certain concentrations can inhibit obviously the growth, proliferation,AgNORs synthesis and collagen type Ⅲ expression of IL-1-stimulated fibroblasts.
, 百拇医药
【Key words】 Interferon-γ Dexamathasone Interleukin-1 Fibroblasts Collagen type Ⅲ Proliferation inhibition
作者观察了γ-干扰素(IFN-γ)和地塞米松(Dexamathasone,Dexa)对IL-1促成纤维细胞增生的抑制作用，旨在从细胞因子角度为抗纤维化有效措施的制定提供依据。
材料和方法
1.成纤维细胞培养：用无血清和10%FCS+DMEM体系对NIH/3T3成纤维细胞进行体外培养。
2.实验分组：分为IFN-γ+正常、Dexa+正常、IFN-γ+IL-1和Dexa+IL-1 4个组。rhIFN-γ和rhIL-1均为北京四环医学生物高技术中心生产，Dexa购自上海东风制药厂。
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3.照射：60Co γ源一次照射(吸收剂量30 Gy)，照射量率5.01×10-2 C.kg-1.min-1，源距2.5 m。
4.细胞计数和离心涂片制备：在成纤维细胞指数生长期，将其接种于96孔板，细胞浓度为2.5×104/孔。同时加入不同浓度的IL-1、IFN-γ和Dexa，培养后第3、5天进行细胞计数；其余样品离心后涂片、固定，进行各种组织学和免疫细胞化学染色。
5.MTT比色[1]：加入不同浓度的IL-1、250×103 U/L浓度的IFN-γ和100 μg/L浓度的Dexa于培养后第3天，每孔加1%浓度的MTT(二甲基二苯乙基溴化四唑，中山公司)15 μl继续培养4小时，用BIO-550型酶标仪在570 nm波长下测量A(OD)值。
, 百拇医药
6.AgNORs银染法[2]：将新鲜配制的1份2%明胶和2份50%硝酸银溶液均匀混合，滴加在细胞涂片上，室温避光染色15分钟，经冲洗、脱水、透明后，树脂封片。每个样品计数300个细胞，计算每个细胞平均AgNORs颗粒数。
7.Ⅲ型胶原染色：Ⅲ型胶原单抗购自中山公司，ABC试剂盒为Vector产品。用ABC免疫组化法染色。每个样品计数300个细胞，计算阳性细胞百分比。
8.统计学处理：正文表中数据均为3次实验的平均值，用t检验进行统计学处理。数据表中：*示P<0.05；**示P<0.01(均与对照组比较)。
结果
1.IFN-γ和Dexa对正常成纤维细胞生长的影响
加入250×103 U/L浓度的IFN-γ和100 μg/L的Dexa培养后第3、5天，均可观察到对正常成纤维细胞生长的抑制作用，Dexa的抑制作用似乎更强一些，在培养第3、5天分别为对照值的33%和38%(见表1)。
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表1 IFN-γ和Dexa对正常成纤维细胞生长的影响(
±s)
培养天数(天)
样本数
成纤维细胞计数(×108/L)
对照
IFN-γ
Dexa
3
9
15.8±3.2
6.8±0.7**
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5.2±0.7**
5
9
25.6±4.9
15.1±1.4**
9.7±3.7**
2.IFN-γ对IL-1促成纤维细胞增殖的影响
以往实验发现，(50～200)×103 U/L浓度的IL-1对成纤维细胞的生长显示出较强的促进作用，因而本实验选用上述浓度的IL-1作为刺激成纤维细胞生长的最适条件，观察IFN-γ对成纤维细胞生长的影响。结果显示，250×103 U/L的IFN-γ对3种浓度IL-1刺激的成纤维细胞生长均显示出不同程度的抑制作用，培养第3天成纤维细胞计数分别为对照值的58%、67%和69%(见表2)，然而未发现有统计学上的差异。
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表2 IFN-γ对IL-1刺激的成纤维 细胞生长的影响(±s)
IL-1(×103 U/L)
样本数
成纤维细胞计数(×108/L)
IL-1
IFN-γ+IL-1
50
9
11.0±7.4
6.4±3.7
, 百拇医药
100
9
13.8±8.1
9.2±4.3
200
9
12.2±6.1
8.4±3.4
3.IFN-γ和Dexa对IL-1刺激的正常和受照射成纤维细胞增殖的影响
用MTT比色法进一步观察加入250×103 U/L浓度的IFN-γ对IL-1刺激的成纤维细胞增殖的影响，结果指出，IFN-γ对不同浓度IL-1刺激的成纤维细胞增殖均显示出一定程度的抑制作用。在正常组，当IL-1浓度为100、200和400×103 U/L时，其A值分别为对照值的81%、82%和83%；在照射组，三者分别为对照值的87%、86%和86%，然而未发现有统计学上的差异(见表3)。
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表3 IFN-γ对IL-1刺激的正常和受照射成纤维细胞增殖的影响(±s)
IL-1(×103 U/L)
样本数
MTT(A值)
IFN-γ+正常
IFN-γ+照射
0
9
0.153±0.010
0.126±0.034
, 百拇医药
50
9
0.134±0.004**
0.136±0.028
100
9
0.124±0.012**
0.110±0.008
200
9
0.125±0.006**
0.109±0.018
, http://www.100md.com
400
9
0.127±0.009**
0.108±0.024
1 000
9
0.145±0.013
0.107±0.004
Dexa的抑制作用：随着IL-1浓度的增加，Dexa的抑制作用有增强的趋势，当其浓度为100、200和400×103 U/L时，在正常组，A值分别为对照值的88%、84%和65%；在照射组，三者分别为对照值的87%、89%和79%，然而当IL-1增至1 000×103 U/L时，Dexa未显示有统计学上的差异(见表4)。
, 百拇医药
表4 Dexa对IL-1刺激的正常和受照射成纤维细胞增殖的影响(±s)
IL-1(×103 U/L)
样本数
MTT(A值)
Dexa+正常
Dexa+照射
0
9
0.153±0.010
0.142±0.034
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50
9
0.134±0.012**
0.134±0.046
100
9
0.134±0.014**
0.123±0.025
200
9
0.129±0.015**
0.126±0.009
, 百拇医药
400
9
0.100±00.056*
0.112±0.018*
1 000
9
0.168±0.024
0.134±0.046
4.IFN-γ和Dexa对正常和IL-1刺激的成纤维细胞AgNORs的影响
3种浓度的IFN-γ对正常和IL-1刺激的成纤维细胞AgNORs合成，均显示出明显的抑制作用，其中以250和500×103 U/L的IFN-γ显示出较强的抑制作用。在正常组，AgNORs颗粒数分别为对照值的46%和62%；在IL-1组，二者分别为对照值的63%和54%。而Dexa的抑制作用与其浓度有关，在正常组，150 μg/L的Dexa显示出明显的抑制作用。在IL-1组，100和150 μg/L的Dexa均显示有统计学上的差异(P<0.01)，AgNORs颗粒数分别为对照值的58%和67%(见表5)。
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表5 IFN-γ和Dexa对正常和IL-1刺激的成纤维细胞AgNORs的影响(±s)
抑制剂
样本数
AgNORs颗粒数(个/细胞)
正常
IL-1
IFN-γ(×103 U/L)
0
9
5.2±0.7
, http://www.100md.com 5.2±0.7
250
9
2.4±0.2**
3.3±0.2**
500
9
3.2±0.4**
2.8±0.1**
750
9
3.4±0.1**
4.2±0.3*
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Dexa(μg/L)
0
9
5.2±0.7
5.2±0.7
50
9
3.6±1.9
4.3±0.2
100
9
4.1±1.2
3.0±0.3**
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150
9
3.4±0.4**
3.5±0.2**
5.IFN-γ和Dexa对成纤维细胞Ⅲ型胶原的影响
在所用3种浓度范围内，只有250×103 U/L的IFN-γ对正常和IL-1刺激的成纤维细胞Ⅲ型胶原合成显示出明显的抑制作用，Ⅲ型胶原阳性细胞数分别为对照值的79%和50%。而所用3种浓度的Dexa对正常成纤维细胞均显示明显的抑制作用，Ⅲ型胶原阳性细胞数分别为对照值的71%、57%和59%；在IL-1组只有100 μg/L的Dexa显示出明显的抑制作用(P<0.05，见表6)。
表6 IFN-γ和Dexa对正常和IL-1刺激的成纤维细胞Ⅲ型胶原的影响(±s)
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抑制剂
样本数
Ⅲ型胶原阳性细胞数(%)
正常
IL-1
IFN-γ(×103 U/L)
0
9
58.00±5.85
58.00±5.85
250
9
46.00±4.00*
, 百拇医药
29.00±7.77**
500
9
50.00±17.00
—
750
9
56.00±7.57
63.00±4.36
Dexa(μg/L)
0
9
58.00±5.85
, 百拇医药
58.00±5.85
50
9
41.00±9.64*
54.00±6.81
100
9
33.00±6.11**
43.00±10.10*
150
9
34.00±6.11**
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50.00±7.37
讨论
整体和离体实验资料均表明，由各种因素(如电离辐射、化学药物)引起的器官纤维化的发生，除了多种细胞成分参与外，某些细胞因子单独的或协同的效应也起着不可低估的作用。因而目前认为，在抗纤维化作用的研究中，最有效的措施应放在阻止细胞因子作用于靶细胞上。有学者报道，IL-1是肥大细胞分泌的在器官纤维化中可能起着重要作用的细胞因子之一[3]；本实验室最近研究也发现，(100～200)×103 U/L浓度的IL-1对成纤维细胞的生长、增殖活性、DNA合成及Ⅲ型胶原的表达均显示出明显的促进作用。据此，作者观察了IFN-γ和Dexa对IL-1刺激成纤维细胞增殖的影响。现就两种抑制剂可能的作用机理讨论如下。
1.IFN-γ：近期研究表明，IFN除了具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性外，IFN-γ在抗纤维化方面也具有重要作用，甚至有学者认为，IFN-γ可能是终止纤维化反应的生理调节因子[4]。因而本文作者系统观察了IFN-γ对离体培养的成纤维细胞增殖的影响。证实：IFN-γ能明显抑制正常和IL-1刺激的成纤维细胞的增殖；相同浓度的IFN-γ也能有效抑制IL-1刺激的正常和受照射成纤维细胞的增殖；所用3种浓度的IFN-γ均能抑制正常和IL-1刺激的成纤维细胞AgNORs合成；对正常和IL-1刺激的成纤维细胞Ⅲ型胶原的合成也显示出有效的拮抗作用。分析其抑制增殖的机理，Raines等人[5]认为，IL-1与成纤维细胞表面受体作用，能促使其分泌PDGF A链同源二聚体(PDGF-AA)，后者可直接刺激成纤维细胞增殖，而IFN-γ能明显减少PDGF对成纤维细胞的丝裂活性，从而抑制成纤维细胞增殖；此外他们还发现IFN-γ能明显抑制成纤维细胞Ⅲ型胶原的合成[5]。Okata等人的研究也发现，IFN-γ抑制肺纤维化作用的机理：一是能抑制胶原合成；二是抑制成纤维细胞增殖[6]。最近Bird等人观察IFN-γ和Dexa对体外培养的人成纤维细胞的抑制作用，发现375×103 U/L浓度的IFN-γ能达到最大的抑制率(相当于对照值的55%)[7]，与本实验获得的最大抑制率浓度250×103 U/L很接近。
, 百拇医药
2.Dexa：Dexa作为免疫抑制剂治疗各种自身免疫性疾病已经应用于临床。然而，有关其抗纤维化作用的研究仅见个别治疗全身硬化症的报道[8]。本实验观察到Dexa对成纤维细胞生长、增殖和Ⅲ型胶原合成也显示出较强的抑制作用；对AgNORs合成的抑制作用虽然不如IFN-γ明显，但其AgNORs颗粒数仍明显低于对照组。分析Dexa抑制成纤维细胞增殖的机理，本实验结果可能是通过抑制成纤维细胞AgNORs合成进而抑制成纤维增殖。已知AgNORs与细胞核DNA合成及与转录有关的蛋白质合成有密切关系，因而AgNORs合成的减少必然会影响DNA复制和成纤维细胞增殖；此外最近有资料表明，Dexa还能通过胶原基因启动和转录机制影响胶原基因mRNA合成，进而抑制胶原合成；并通过降低成纤维细胞胶原合成酶水平而影响胶原生成[9]。
上述实验结果，为针对肥大细胞分泌的细胞因子参与器官纤维化，特别是放射性器官纤维化采取相应的防治措施，尤其是为今后将上述抗纤维化因子进一步应用于整体实验动物治疗提供了有价值的参考资料。作者认为随着对上述抑制剂抑制成纤维细胞增殖分子机制的进一步认识，有可能通过研究抑制成纤维细胞增殖和胶原合成的因子，从阻止细胞因子对靶细胞作用的环节上，寻找出最合适、最有效的治疗措施。
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本课题受总后“九五”指令性基金资助(项目号：9105020)
参考文献
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, http://www.100md.com
3 Kovacs EJ.Fibrogenic cytokines:the role of immune mediators in the development of scar tissue.Immunol Today,1991,12:17-23.
4 何威，叶庆佾.干扰素对皮肤成纤维细胞的作用.国外医学生理病理科学与临床分册，1995，15：207-209.
5 Raines EW,Dower SK,Ross R. Interleukin-1 mitogenic activity for fibroblasts and smooth muscle cells is due to PDGF-AA.Science,1989,243:393-396.
6 Okada T,Sugie I,Aisaka K.Effects of γ-interferon on collagen and histamine content in bleomycin-induced lung fibrosis in rats.Lymphokine Cytokine Res,1993,12:87-91.
, 百拇医药
7 Bird JLE,Tyler JA.Tumour necrosis factor α,interferon-γ and dexamathasone regulate IGF-1-maintained collagen production in cultured human fibroblasts.J Endocrinol,1995,147:167-172.
8 Pai BS,Srinis CR,Sabitha L,et al.Efficacy of dexamathasone pulse therapy in progressive systemic sclerosis.Pharmacol Ther,1995,34:726-728.
9 Weiner FR,Czaja MJ,Jefferson DM.The effects of dexamathasone on in vitro collagen gene expression.J Biol Chem,1987,262:6955-6958.
(收稿:1998-10-27 修回：1999-01-09), 百拇医药
单位：100850 北京放射医学研究所
关键词：γ-干扰素；地塞米松 IL-1；成纤维细胞；Ⅲ型胶原；增殖抑制
中华放射医学与防护杂志/990411 【摘要】 目的 观察γ-干扰素(IFN-γ)和地塞米松(Dexa)对正常和IL-1刺激的成纤维细胞生长的影响，旨在从细胞因子角度为抗纤维化有效措施的制定提供依据。方法 用MTT比色、AgNORs银染和免疫组化技术，观察两种抑制剂对成纤维细胞增殖、AgNORs合成和Ⅲ型胶原表达的影响。结果 250×103 U/L浓度的IFN-γ和100 μg/L浓度的Dexa均能明显抑制正常和IL-1刺激的成纤维细胞增殖、AgNORs合成和Ⅲ型胶原表达。结论 一定浓度的IFN-γ和Dexa对正常和IL-1刺激的成纤维细胞生长、增殖、AgNORs合成和Ⅲ型胶原表达均显示出明显的抑制作用。
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Effects of interferon-γand dexamathasone on growth of fibroblasts stimulated by interleukin-1
CUI Yufang, GAO Yabing, YANG Hong, et al.
Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China.
【Abstract】 Objectives Our studies were aimed at providing a basis for effective therapeutic strategy against fibrosis using cytokines through observing the effects of interferon-γ (IFN-γ) and dexamathasone (dexa) on growth of normal and interleukin-1(IL-1)-stimulated fibroblasts. Methods MTT colorimetry,a silver colloid technique to identify nucleolar organizer regions (AgNORs) and immunohistochemical methods were used to study the effects of the two inhibitors on growth of fibroblasts. Results Growth,proliferation activity,synthesis of AgNORs and expression of collagen type Ⅲ in normal and IL-1-stimulated fibroblasts were depressed evidently by IFN-γ at 250×103 U/L and dexa at 100μg/L. Conclusions The authors believe that IFN-γ and dexa at certain concentrations can inhibit obviously the growth, proliferation,AgNORs synthesis and collagen type Ⅲ expression of IL-1-stimulated fibroblasts.
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【Key words】 Interferon-γ Dexamathasone Interleukin-1 Fibroblasts Collagen type Ⅲ Proliferation inhibition
作者观察了γ-干扰素(IFN-γ)和地塞米松(Dexamathasone,Dexa)对IL-1促成纤维细胞增生的抑制作用，旨在从细胞因子角度为抗纤维化有效措施的制定提供依据。
材料和方法
1.成纤维细胞培养：用无血清和10%FCS+DMEM体系对NIH/3T3成纤维细胞进行体外培养。
2.实验分组：分为IFN-γ+正常、Dexa+正常、IFN-γ+IL-1和Dexa+IL-1 4个组。rhIFN-γ和rhIL-1均为北京四环医学生物高技术中心生产，Dexa购自上海东风制药厂。
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3.照射：60Co γ源一次照射(吸收剂量30 Gy)，照射量率5.01×10-2 C.kg-1.min-1，源距2.5 m。
4.细胞计数和离心涂片制备：在成纤维细胞指数生长期，将其接种于96孔板，细胞浓度为2.5×104/孔。同时加入不同浓度的IL-1、IFN-γ和Dexa，培养后第3、5天进行细胞计数；其余样品离心后涂片、固定，进行各种组织学和免疫细胞化学染色。
5.MTT比色[1]：加入不同浓度的IL-1、250×103 U/L浓度的IFN-γ和100 μg/L浓度的Dexa于培养后第3天，每孔加1%浓度的MTT(二甲基二苯乙基溴化四唑，中山公司)15 μl继续培养4小时，用BIO-550型酶标仪在570 nm波长下测量A(OD)值。
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6.AgNORs银染法[2]：将新鲜配制的1份2%明胶和2份50%硝酸银溶液均匀混合，滴加在细胞涂片上，室温避光染色15分钟，经冲洗、脱水、透明后，树脂封片。每个样品计数300个细胞，计算每个细胞平均AgNORs颗粒数。
7.Ⅲ型胶原染色：Ⅲ型胶原单抗购自中山公司，ABC试剂盒为Vector产品。用ABC免疫组化法染色。每个样品计数300个细胞，计算阳性细胞百分比。
8.统计学处理：正文表中数据均为3次实验的平均值，用t检验进行统计学处理。数据表中：*示P<0.05；**示P<0.01(均与对照组比较)。
结果
1.IFN-γ和Dexa对正常成纤维细胞生长的影响
加入250×103 U/L浓度的IFN-γ和100 μg/L的Dexa培养后第3、5天，均可观察到对正常成纤维细胞生长的抑制作用，Dexa的抑制作用似乎更强一些，在培养第3、5天分别为对照值的33%和38%(见表1)。
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表1 IFN-γ和Dexa对正常成纤维细胞生长的影响(
±s)培养天数(天)
样本数
成纤维细胞计数(×108/L)
对照
IFN-γ
Dexa
3
9
15.8±3.2
6.8±0.7**
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5.2±0.7**
5
9
25.6±4.9
15.1±1.4**
9.7±3.7**
2.IFN-γ对IL-1促成纤维细胞增殖的影响
以往实验发现，(50～200)×103 U/L浓度的IL-1对成纤维细胞的生长显示出较强的促进作用，因而本实验选用上述浓度的IL-1作为刺激成纤维细胞生长的最适条件，观察IFN-γ对成纤维细胞生长的影响。结果显示，250×103 U/L的IFN-γ对3种浓度IL-1刺激的成纤维细胞生长均显示出不同程度的抑制作用，培养第3天成纤维细胞计数分别为对照值的58%、67%和69%(见表2)，然而未发现有统计学上的差异。
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表2 IFN-γ对IL-1刺激的成纤维 细胞生长的影响(
±s)IL-1(×103 U/L)
样本数
成纤维细胞计数(×108/L)
IL-1
IFN-γ+IL-1
50
9
11.0±7.4
6.4±3.7
, 百拇医药
100
9
13.8±8.1
9.2±4.3
200
9
12.2±6.1
8.4±3.4
3.IFN-γ和Dexa对IL-1刺激的正常和受照射成纤维细胞增殖的影响
用MTT比色法进一步观察加入250×103 U/L浓度的IFN-γ对IL-1刺激的成纤维细胞增殖的影响，结果指出，IFN-γ对不同浓度IL-1刺激的成纤维细胞增殖均显示出一定程度的抑制作用。在正常组，当IL-1浓度为100、200和400×103 U/L时，其A值分别为对照值的81%、82%和83%；在照射组，三者分别为对照值的87%、86%和86%，然而未发现有统计学上的差异(见表3)。
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表3 IFN-γ对IL-1刺激的正常和受照射成纤维细胞增殖的影响(
±s)IL-1(×103 U/L)
样本数
MTT(A值)
IFN-γ+正常
IFN-γ+照射
0
9
0.153±0.010
0.126±0.034
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50
9
0.134±0.004**
0.136±0.028
100
9
0.124±0.012**
0.110±0.008
200
9
0.125±0.006**
0.109±0.018
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400
9
0.127±0.009**
0.108±0.024
1 000
9
0.145±0.013
0.107±0.004
Dexa的抑制作用：随着IL-1浓度的增加，Dexa的抑制作用有增强的趋势，当其浓度为100、200和400×103 U/L时，在正常组，A值分别为对照值的88%、84%和65%；在照射组，三者分别为对照值的87%、89%和79%，然而当IL-1增至1 000×103 U/L时，Dexa未显示有统计学上的差异(见表4)。
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表4 Dexa对IL-1刺激的正常和受照射成纤维细胞增殖的影响(
±s)IL-1(×103 U/L)
样本数
MTT(A值)
Dexa+正常
Dexa+照射
0
9
0.153±0.010
0.142±0.034
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50
9
0.134±0.012**
0.134±0.046
100
9
0.134±0.014**
0.123±0.025
200
9
0.129±0.015**
0.126±0.009
, 百拇医药
400
9
0.100±00.056*
0.112±0.018*
1 000
9
0.168±0.024
0.134±0.046
4.IFN-γ和Dexa对正常和IL-1刺激的成纤维细胞AgNORs的影响
3种浓度的IFN-γ对正常和IL-1刺激的成纤维细胞AgNORs合成，均显示出明显的抑制作用，其中以250和500×103 U/L的IFN-γ显示出较强的抑制作用。在正常组，AgNORs颗粒数分别为对照值的46%和62%；在IL-1组，二者分别为对照值的63%和54%。而Dexa的抑制作用与其浓度有关，在正常组，150 μg/L的Dexa显示出明显的抑制作用。在IL-1组，100和150 μg/L的Dexa均显示有统计学上的差异(P<0.01)，AgNORs颗粒数分别为对照值的58%和67%(见表5)。
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表5 IFN-γ和Dexa对正常和IL-1刺激的成纤维细胞AgNORs的影响(
±s)抑制剂
样本数
AgNORs颗粒数(个/细胞)
正常
IL-1
IFN-γ(×103 U/L)
0
9
5.2±0.7
, http://www.100md.com 5.2±0.7
250
9
2.4±0.2**
3.3±0.2**
500
9
3.2±0.4**
2.8±0.1**
750
9
3.4±0.1**
4.2±0.3*
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Dexa(μg/L)
0
9
5.2±0.7
5.2±0.7
50
9
3.6±1.9
4.3±0.2
100
9
4.1±1.2
3.0±0.3**
, 百拇医药
150
9
3.4±0.4**
3.5±0.2**
5.IFN-γ和Dexa对成纤维细胞Ⅲ型胶原的影响
在所用3种浓度范围内，只有250×103 U/L的IFN-γ对正常和IL-1刺激的成纤维细胞Ⅲ型胶原合成显示出明显的抑制作用，Ⅲ型胶原阳性细胞数分别为对照值的79%和50%。而所用3种浓度的Dexa对正常成纤维细胞均显示明显的抑制作用，Ⅲ型胶原阳性细胞数分别为对照值的71%、57%和59%；在IL-1组只有100 μg/L的Dexa显示出明显的抑制作用(P<0.05，见表6)。
表6 IFN-γ和Dexa对正常和IL-1刺激的成纤维细胞Ⅲ型胶原的影响(
±s), 百拇医药
抑制剂
样本数
Ⅲ型胶原阳性细胞数(%)
正常
IL-1
IFN-γ(×103 U/L)
0
9
58.00±5.85
58.00±5.85
250
9
46.00±4.00*
, 百拇医药
29.00±7.77**
500
9
50.00±17.00
—
750
9
56.00±7.57
63.00±4.36
Dexa(μg/L)
0
9
58.00±5.85
, 百拇医药
58.00±5.85
50
9
41.00±9.64*
54.00±6.81
100
9
33.00±6.11**
43.00±10.10*
150
9
34.00±6.11**
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50.00±7.37
讨论
整体和离体实验资料均表明，由各种因素(如电离辐射、化学药物)引起的器官纤维化的发生，除了多种细胞成分参与外，某些细胞因子单独的或协同的效应也起着不可低估的作用。因而目前认为，在抗纤维化作用的研究中，最有效的措施应放在阻止细胞因子作用于靶细胞上。有学者报道，IL-1是肥大细胞分泌的在器官纤维化中可能起着重要作用的细胞因子之一[3]；本实验室最近研究也发现，(100～200)×103 U/L浓度的IL-1对成纤维细胞的生长、增殖活性、DNA合成及Ⅲ型胶原的表达均显示出明显的促进作用。据此，作者观察了IFN-γ和Dexa对IL-1刺激成纤维细胞增殖的影响。现就两种抑制剂可能的作用机理讨论如下。
1.IFN-γ：近期研究表明，IFN除了具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性外，IFN-γ在抗纤维化方面也具有重要作用，甚至有学者认为，IFN-γ可能是终止纤维化反应的生理调节因子[4]。因而本文作者系统观察了IFN-γ对离体培养的成纤维细胞增殖的影响。证实：IFN-γ能明显抑制正常和IL-1刺激的成纤维细胞的增殖；相同浓度的IFN-γ也能有效抑制IL-1刺激的正常和受照射成纤维细胞的增殖；所用3种浓度的IFN-γ均能抑制正常和IL-1刺激的成纤维细胞AgNORs合成；对正常和IL-1刺激的成纤维细胞Ⅲ型胶原的合成也显示出有效的拮抗作用。分析其抑制增殖的机理，Raines等人[5]认为，IL-1与成纤维细胞表面受体作用，能促使其分泌PDGF A链同源二聚体(PDGF-AA)，后者可直接刺激成纤维细胞增殖，而IFN-γ能明显减少PDGF对成纤维细胞的丝裂活性，从而抑制成纤维细胞增殖；此外他们还发现IFN-γ能明显抑制成纤维细胞Ⅲ型胶原的合成[5]。Okata等人的研究也发现，IFN-γ抑制肺纤维化作用的机理：一是能抑制胶原合成；二是抑制成纤维细胞增殖[6]。最近Bird等人观察IFN-γ和Dexa对体外培养的人成纤维细胞的抑制作用，发现375×103 U/L浓度的IFN-γ能达到最大的抑制率(相当于对照值的55%)[7]，与本实验获得的最大抑制率浓度250×103 U/L很接近。
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2.Dexa：Dexa作为免疫抑制剂治疗各种自身免疫性疾病已经应用于临床。然而，有关其抗纤维化作用的研究仅见个别治疗全身硬化症的报道[8]。本实验观察到Dexa对成纤维细胞生长、增殖和Ⅲ型胶原合成也显示出较强的抑制作用；对AgNORs合成的抑制作用虽然不如IFN-γ明显，但其AgNORs颗粒数仍明显低于对照组。分析Dexa抑制成纤维细胞增殖的机理，本实验结果可能是通过抑制成纤维细胞AgNORs合成进而抑制成纤维增殖。已知AgNORs与细胞核DNA合成及与转录有关的蛋白质合成有密切关系，因而AgNORs合成的减少必然会影响DNA复制和成纤维细胞增殖；此外最近有资料表明，Dexa还能通过胶原基因启动和转录机制影响胶原基因mRNA合成，进而抑制胶原合成；并通过降低成纤维细胞胶原合成酶水平而影响胶原生成[9]。
上述实验结果，为针对肥大细胞分泌的细胞因子参与器官纤维化，特别是放射性器官纤维化采取相应的防治措施，尤其是为今后将上述抗纤维化因子进一步应用于整体实验动物治疗提供了有价值的参考资料。作者认为随着对上述抑制剂抑制成纤维细胞增殖分子机制的进一步认识，有可能通过研究抑制成纤维细胞增殖和胶原合成的因子，从阻止细胞因子对靶细胞作用的环节上，寻找出最合适、最有效的治疗措施。
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本课题受总后“九五”指令性基金资助(项目号：9105020)
参考文献
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(收稿:1998-10-27 修回：1999-01-09), 百拇医药