复合PCR-RFLP技术检测ABO基因型
作者：杨庆恩 朱传红
单位：杨庆恩(430030 武汉，同济医科大学法医学系)；朱传红(武汉市刑事科学技术研究所)
关键词：ABO血型；基因型；聚合酶链反应；限制酶
复合PCR 【摘要】 目的 研究复合聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分型人类ABO基因型。方法 在每一个反应管内同时扩增ABO糖基转移酶基因中2个特异性片段，然后于同一管内进行Kpn Ⅰ和Alu Ⅰ限制酶消化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染，对武汉地区125例汉族无关个体作ABO基因型分型。结果 ABO的6种基因型分型明确，125例汉族人ABO基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。结论 该方法操作简单，分型明确，重复性好，适用于法医学鉴定。
Detection of ABO genotypes by simultaneous PCR-RFLP method
, http://www.100md.com
YANG Qingen*, ZHU Chuanhong.
*Department of Forensic Medicine, Tongji Medical University,Wuhan 430030 P.R. China E-mail:fywz @ tjmu.edu.cn
【Abstract】 Objective To study human ABO genotyping by means of multiplex PCR and restriction fragment length polymorphism. Methods Two specific fragments of ABO gene were simultaneously amplified in a single tube, and then the double restriction digestion with RE Kpn Ⅰ and Alu Ⅰ was performed in the same tube. The amplified products were analyzed by PAGE and silver staining. 125 Han unrelated individuals living in Wuhan were genotyped. Results Six genotypes of ABO were detected and the distribution was in good agreement with Hardy-Weinberg equilibrium.Conclusion The results demonstrate that PCR-RFLP based approach is convenient, reliable and should be of value in forensic application.
, 百拇医药
【Key words】 ABO blood group Genotype Polymerase chain reaction Restriction fragment polymorphism
ABO血型是发现最早、应用最广泛的人类血型，ABO血型物质广泛地分布在人体组织和体液中。1990年，Yamamoto等[1]报道了ABO系统的糖基转移酶基因碱基序列分析结果，提出了应用PCR扩增和等位基因特异性限制酶消化检测ABO基因型的方法。随后Lee等[2]、Crouse等[3]、Ladd等[4]、Akane等[5]、Herrin等[6]相继报道了ABO基因型测定方法。经过比较，我们选择Herrin方法，采用2对引物复合扩增ABO糖基转移酶基因中的2个区段，限制酶Kpn Ⅰ和Alu Ⅰ同时消化扩增产物，PAGE和银染，获得ABO系统的6种基因型图谱。对125例汉族无关个体ABO基因型进行调查，基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，现报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 样本 从武汉市同济医院血库随机收集125例健康成人EDTA抗凝血，经血清学方法测定，其中A型43例、B型32例、O型41例和AB型9例。全血样用细胞裂解/蛋白酶 K 法提取 DNA，-30℃ 保存备用。
1.2 引物由Bio-Tech公司合成，引物序列为：引物1：5′-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3′；引物2：5′-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3′；引物3：5′-GTG-GAGATCCTGACTCCGCTG-3′；引物4：5′-CACCG-ACCCCCCGAAGAA-3′。
1.3 PCR扩增 反应体积25μl，其中含1.5mmol/L MgCl2，1×缓冲液，200μmol/L dNTP，200μg BSA，1.25U Taq DNA 聚合酶，引物1、2各125pmol/L，引物3、4各62.5pmol/L，模板DNA 8μl。扩增热循环参数：95℃ 2分钟；95℃ 30秒，60℃ 10秒，72℃ 45秒，共30个循环；72℃延伸10分钟。
, 百拇医药
1.4 酶切消化 扩增产物中直接加入Kpn Ⅰ和AluⅠ各2.5U，置37℃孵化30分钟。
1.5 垂直PAGE分离和银染 电泳用T6%，C5%聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel, PAG)内含尿素4mol/L、0.5×TBE，电泳条件恒压550伏，40分钟。设置pBR322/MspⅠ分子量标准作对照。银染按余纯应等[7]方法。
1.6 统计学分析 125例血样分型并记录基因型，对基因型频率分布作χ2检验。
2 结果
2.1 6种基因型谱带清晰分型明确。6种基因型的复合扩增产物均由200(199)bp和159bp两条带组成。但经酶切消化后共出现4种特异型片段长度：片段1为200(199)bp、片段2为171bp、片段3为159bp、片段4为118bp。6种基因型判定：片段1+3为AA型，片段1+2+3为AO型，片段1+3+4为AB型，片段1+4为BB型，片段1+2+3+4为BO型，片段2+3为OO型(图1)。
, 百拇医药
图1 ABO基因型谱型 1～6：未作限制酶消化前扩增产物；7～12：限制酶Kpn Ⅰ、Alu Ⅰ消化后
Fig 1 Patterns of ABO genotypes by PCR-RFLP 1-6: Amplification products before RE digestion;Lanes 7-12:After RE digestion; M:pBR322/MspⅠ; 1,7:AB; 2,8:OO; 3,9:BB; 4,10:BO; 5,11:AA; 6,12:AO
2.2 武汉地区125例汉族无关个体基因型分布及基因频率见表1。
表1 汉族人群ABO基因型分布
Tab 1 Genotype distribution of ABO in Han population
, 百拇医药
Genotype
(基因型)
No. obs.
(观察值)(%)
No.exp.
(期望值)
χ2
Gene frequency
(基因频率)
AB
9(7.20)
10.74
, http://www.100md.com
0.2819
A=0.214
B=0.176
O=0.580
OO
41(32.80)
42.05
0.0262
BB
3(2.40)
3.87
0.1956
, http://www.100md.com BO
29(23.20)
25.52
0.4745
AA
9(7.20)
7.44
0.3271
AO
34(27.20)
35.38
0.0538
Total
, 百拇医药
(合计)
125(100.00)
125.00
1.3591
df=3,P>0.50
3 讨论
Yamamato等[1，8]从不同ABO型别的结肠癌患者的细胞株SW948、SW48、COLO205和SW1417中提取poly(A)-RNA，与λgt10构建4个cDNA文库。经过筛选、测序后发现A基因和B基因之间有7个单碱基替换：A294G、C523G、C654T、G700A、C793A、G800C和G927A。而O基因在靠近N端出现258G单碱基缺失，形成移码变异，编码出无糖基转移酶活性的蛋白质。其后作者又研究了14例具不同ABO型个体的血样和细胞株，确定A、B基因之间的3个单碱基替换以及O基因258G缺失形成的等位基因特异性限制酶识别位点。
, http://www.100md.com
我们选择的2个特异性限制酶识别点为G700A和258G缺失。引物1和2扩增片段200(199)bp，包含258位碱基。A、B基因扩增片段200bp，O基因扩增片段199bp，因O基因258G缺失构成Kpn Ⅰ识别点，酶切后为171bp和28bp，故171bp片段出现则说明有O基因。引物3和4扩增片段159bp，包含700位碱基，A、O基因均为700G，仅B基因为700A，构成Alu Ⅰ识别点，酶切后产生118bp和41bp，所以118bp片段出现说明有B基因(图2、表2)。我们选择方法的特点是在同一反应管里复合扩增2条特异性片段，扩增产物同时用2种限制酶消化，操作比较简单，且能节约模板DNA量。125例血样基因型检测与血清学检测结果全部吻合，证实本法分型稳定，重复性良好。电泳分离改用PAGE，经银染显示结果，提高了检测灵敏度，分型结果可长期保存。
表2 ABO基因型谱带
Tab 2 Interpretation of ABO genotype by RFLP
, 百拇医药
Genotype
(基因型)
Amplication with primers 1 and 2,digestion with Kpn Ⅰ
(引物1+2扩增，Kpn Ⅰ消化)
Amplication with primers 3 and 4,digestion with Alu Ⅰ
(引物3+4扩增，Alu Ⅰ消化)
Digestion pattern
(消化形式)
Visible bands
, 百拇医药
(可见片段)(bp)
Digestion pattern
(消化形式)
Visible bands
(可见片段)(bp)
AB
No digestion
200
1/2 digestion
159,118
OO
Com.digestion
, 百拇医药
171
No digestion
159
BB
No digestion
200
Com.digestion
118
BO
1/2 digestion
200,171
1/2 digestion
, 百拇医药
159,118
AA
No digestion
200
No digestion
159
AO
1/2 digestion
200,171
No digestion
159
* No digestion：无消化, 1/2 digestion：半消化, Com. digestion：全消化；Products of 28bp and 41bp digested by RE KpnⅠ and AluⅠ ran off the gel：KpnⅠ 消化产物28bp以及Alu Ⅰ消化产物41bp已泳出凝胶
, 百拇医药
图2 A、B、O基因特异性限制酶识别点
Fig 2 Partial sequence of the ABO locus and cleavable site by RE AluⅠ and KpnⅠ
125例汉族无关个体ABO基因型分布见表1。基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.50)。A、B和O基因型频率分别为0.244、0.176和0.580，与湖北地区血清学分型36 932例的调查结果相吻合(P>0.05)[9]。
基因型测定能够鉴别BB和BO型，AA和AO型，因此法医学个体识别能力应高于血清学检测，依本次调查结果计算，Dp值为0.7536，略高于常规血型测定。基因型分型检测材料是基因组DNA，法医学个体识别应用范围广泛，如ABO非分泌型的体液斑痕，提取其中体细胞DNA，则可鉴定其ABO基因型。复合PCR-RFLP技术为法医学ABO型鉴定提供一新的方法。分型测定中，限制酶液宜新鲜配制，低温保存备用。研究中我们发现反复冻融可使限制酶活性下降，使酶消化不完全，OO型出现未消化完的199bp片段而误判为AO型；BB型出现159bp被误判为AB型。因此在实际应用时建议设置已知O型和BB型血样作对照，可避免因酶活性下降造成的误判。其次，限制酶工作液应低温保存，使用时间不超过1周为好。
, 百拇医药
参考文献
[1] Yamamoto F, Clausen H, White T, et al, Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system. Nature, 1990, 345(17)∶229-233.
[2] Lee JCI, Chang JG. ABO genotyping by polymerase chain reaction. J Forensic Sci，1992，37(5)∶1269-1275.
[3] Crouse C, Vincek V. Identification of ABO alleles on forensic-type specimens using rapid-ABO genotyping. Bio Techniques, 1995, 18(3)∶478-483.
, 百拇医药
[4] Ladd C, Bourke MT, Scherczinger CA, et al. A PCR-based strategy for ABO genotype determination. J Forensic Sci, 1996, 41(1)∶134-137.
[5] Akane A, Yoshimura S, Yoshida M, et al. ABO genotyping following a single PCR amplification. J Forensic Sci, 1996, 41(2)∶272-274.
[6] Herrin G. A simplified amplification procedure for two regions of the glycosyl transferase (ABO blood group) gene. J Forensic Sci, 1996, 41(1)∶138-141.
[7] 余纯应，杨庆恩，朱传红，等.汉族人群五个STR基因座的多态性调查.中国法医学杂志，1997，2(12)∶69-73.
[8] 李荣华.ABO血型的生化遗传与基因型测定.中华医学遗传学杂志，1994，6(11)∶341-344.
[9] 赵桐茂.人类血型遗传学.第1版.北京：科学出版社，1987.50-53.
(收稿：1998-04-16 修回：1998-11-02), 百拇医药
单位：杨庆恩(430030 武汉，同济医科大学法医学系)；朱传红(武汉市刑事科学技术研究所)
关键词：ABO血型；基因型；聚合酶链反应；限制酶
复合PCR 【摘要】 目的 研究复合聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分型人类ABO基因型。方法 在每一个反应管内同时扩增ABO糖基转移酶基因中2个特异性片段，然后于同一管内进行Kpn Ⅰ和Alu Ⅰ限制酶消化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染，对武汉地区125例汉族无关个体作ABO基因型分型。结果 ABO的6种基因型分型明确，125例汉族人ABO基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。结论 该方法操作简单，分型明确，重复性好，适用于法医学鉴定。
Detection of ABO genotypes by simultaneous PCR-RFLP method
, http://www.100md.com
YANG Qingen*, ZHU Chuanhong.
*Department of Forensic Medicine, Tongji Medical University,Wuhan 430030 P.R. China E-mail:fywz @ tjmu.edu.cn
【Abstract】 Objective To study human ABO genotyping by means of multiplex PCR and restriction fragment length polymorphism. Methods Two specific fragments of ABO gene were simultaneously amplified in a single tube, and then the double restriction digestion with RE Kpn Ⅰ and Alu Ⅰ was performed in the same tube. The amplified products were analyzed by PAGE and silver staining. 125 Han unrelated individuals living in Wuhan were genotyped. Results Six genotypes of ABO were detected and the distribution was in good agreement with Hardy-Weinberg equilibrium.Conclusion The results demonstrate that PCR-RFLP based approach is convenient, reliable and should be of value in forensic application.
, 百拇医药
【Key words】 ABO blood group Genotype Polymerase chain reaction Restriction fragment polymorphism
ABO血型是发现最早、应用最广泛的人类血型，ABO血型物质广泛地分布在人体组织和体液中。1990年，Yamamoto等[1]报道了ABO系统的糖基转移酶基因碱基序列分析结果，提出了应用PCR扩增和等位基因特异性限制酶消化检测ABO基因型的方法。随后Lee等[2]、Crouse等[3]、Ladd等[4]、Akane等[5]、Herrin等[6]相继报道了ABO基因型测定方法。经过比较，我们选择Herrin方法，采用2对引物复合扩增ABO糖基转移酶基因中的2个区段，限制酶Kpn Ⅰ和Alu Ⅰ同时消化扩增产物，PAGE和银染，获得ABO系统的6种基因型图谱。对125例汉族无关个体ABO基因型进行调查，基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，现报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 样本 从武汉市同济医院血库随机收集125例健康成人EDTA抗凝血，经血清学方法测定，其中A型43例、B型32例、O型41例和AB型9例。全血样用细胞裂解/蛋白酶 K 法提取 DNA，-30℃ 保存备用。
1.2 引物由Bio-Tech公司合成，引物序列为：引物1：5′-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3′；引物2：5′-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3′；引物3：5′-GTG-GAGATCCTGACTCCGCTG-3′；引物4：5′-CACCG-ACCCCCCGAAGAA-3′。
1.3 PCR扩增 反应体积25μl，其中含1.5mmol/L MgCl2，1×缓冲液，200μmol/L dNTP，200μg BSA，1.25U Taq DNA 聚合酶，引物1、2各125pmol/L，引物3、4各62.5pmol/L，模板DNA 8μl。扩增热循环参数：95℃ 2分钟；95℃ 30秒，60℃ 10秒，72℃ 45秒，共30个循环；72℃延伸10分钟。
, 百拇医药
1.4 酶切消化 扩增产物中直接加入Kpn Ⅰ和AluⅠ各2.5U，置37℃孵化30分钟。
1.5 垂直PAGE分离和银染 电泳用T6%，C5%聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel, PAG)内含尿素4mol/L、0.5×TBE，电泳条件恒压550伏，40分钟。设置pBR322/MspⅠ分子量标准作对照。银染按余纯应等[7]方法。
1.6 统计学分析 125例血样分型并记录基因型，对基因型频率分布作χ2检验。
2 结果
2.1 6种基因型谱带清晰分型明确。6种基因型的复合扩增产物均由200(199)bp和159bp两条带组成。但经酶切消化后共出现4种特异型片段长度：片段1为200(199)bp、片段2为171bp、片段3为159bp、片段4为118bp。6种基因型判定：片段1+3为AA型，片段1+2+3为AO型，片段1+3+4为AB型，片段1+4为BB型，片段1+2+3+4为BO型，片段2+3为OO型(图1)。
, 百拇医药
图1 ABO基因型谱型 1～6：未作限制酶消化前扩增产物；7～12：限制酶Kpn Ⅰ、Alu Ⅰ消化后
Fig 1 Patterns of ABO genotypes by PCR-RFLP 1-6: Amplification products before RE digestion;Lanes 7-12:After RE digestion; M:pBR322/MspⅠ; 1,7:AB; 2,8:OO; 3,9:BB; 4,10:BO; 5,11:AA; 6,12:AO
2.2 武汉地区125例汉族无关个体基因型分布及基因频率见表1。
表1 汉族人群ABO基因型分布
Tab 1 Genotype distribution of ABO in Han population
, 百拇医药
Genotype
(基因型)
No. obs.
(观察值)(%)
No.exp.
(期望值)
χ2
Gene frequency
(基因频率)
AB
9(7.20)
10.74
, http://www.100md.com
0.2819
A=0.214
B=0.176
O=0.580
OO
41(32.80)
42.05
0.0262
BB
3(2.40)
3.87
0.1956
, http://www.100md.com BO
29(23.20)
25.52
0.4745
AA
9(7.20)
7.44
0.3271
AO
34(27.20)
35.38
0.0538
Total
, 百拇医药
(合计)
125(100.00)
125.00
1.3591
df=3,P>0.50
3 讨论
Yamamato等[1，8]从不同ABO型别的结肠癌患者的细胞株SW948、SW48、COLO205和SW1417中提取poly(A)-RNA，与λgt10构建4个cDNA文库。经过筛选、测序后发现A基因和B基因之间有7个单碱基替换：A294G、C523G、C654T、G700A、C793A、G800C和G927A。而O基因在靠近N端出现258G单碱基缺失，形成移码变异，编码出无糖基转移酶活性的蛋白质。其后作者又研究了14例具不同ABO型个体的血样和细胞株，确定A、B基因之间的3个单碱基替换以及O基因258G缺失形成的等位基因特异性限制酶识别位点。
, http://www.100md.com
我们选择的2个特异性限制酶识别点为G700A和258G缺失。引物1和2扩增片段200(199)bp，包含258位碱基。A、B基因扩增片段200bp，O基因扩增片段199bp，因O基因258G缺失构成Kpn Ⅰ识别点，酶切后为171bp和28bp，故171bp片段出现则说明有O基因。引物3和4扩增片段159bp，包含700位碱基，A、O基因均为700G，仅B基因为700A，构成Alu Ⅰ识别点，酶切后产生118bp和41bp，所以118bp片段出现说明有B基因(图2、表2)。我们选择方法的特点是在同一反应管里复合扩增2条特异性片段，扩增产物同时用2种限制酶消化，操作比较简单，且能节约模板DNA量。125例血样基因型检测与血清学检测结果全部吻合，证实本法分型稳定，重复性良好。电泳分离改用PAGE，经银染显示结果，提高了检测灵敏度，分型结果可长期保存。
表2 ABO基因型谱带
Tab 2 Interpretation of ABO genotype by RFLP
, 百拇医药
Genotype
(基因型)
Amplication with primers 1 and 2,digestion with Kpn Ⅰ
(引物1+2扩增，Kpn Ⅰ消化)
Amplication with primers 3 and 4,digestion with Alu Ⅰ
(引物3+4扩增，Alu Ⅰ消化)
Digestion pattern
(消化形式)
Visible bands
, 百拇医药
(可见片段)(bp)
Digestion pattern
(消化形式)
Visible bands
(可见片段)(bp)
AB
No digestion
200
1/2 digestion
159,118
OO
Com.digestion
, 百拇医药
171
No digestion
159
BB
No digestion
200
Com.digestion
118
BO
1/2 digestion
200,171
1/2 digestion
, 百拇医药
159,118
AA
No digestion
200
No digestion
159
AO
1/2 digestion
200,171
No digestion
159
* No digestion：无消化, 1/2 digestion：半消化, Com. digestion：全消化；Products of 28bp and 41bp digested by RE KpnⅠ and AluⅠ ran off the gel：KpnⅠ 消化产物28bp以及Alu Ⅰ消化产物41bp已泳出凝胶
, 百拇医药
图2 A、B、O基因特异性限制酶识别点
Fig 2 Partial sequence of the ABO locus and cleavable site by RE AluⅠ and KpnⅠ
125例汉族无关个体ABO基因型分布见表1。基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.50)。A、B和O基因型频率分别为0.244、0.176和0.580，与湖北地区血清学分型36 932例的调查结果相吻合(P>0.05)[9]。
基因型测定能够鉴别BB和BO型，AA和AO型，因此法医学个体识别能力应高于血清学检测，依本次调查结果计算，Dp值为0.7536，略高于常规血型测定。基因型分型检测材料是基因组DNA，法医学个体识别应用范围广泛，如ABO非分泌型的体液斑痕，提取其中体细胞DNA，则可鉴定其ABO基因型。复合PCR-RFLP技术为法医学ABO型鉴定提供一新的方法。分型测定中，限制酶液宜新鲜配制，低温保存备用。研究中我们发现反复冻融可使限制酶活性下降，使酶消化不完全，OO型出现未消化完的199bp片段而误判为AO型；BB型出现159bp被误判为AB型。因此在实际应用时建议设置已知O型和BB型血样作对照，可避免因酶活性下降造成的误判。其次，限制酶工作液应低温保存，使用时间不超过1周为好。
, 百拇医药
参考文献
[1] Yamamoto F, Clausen H, White T, et al, Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system. Nature, 1990, 345(17)∶229-233.
[2] Lee JCI, Chang JG. ABO genotyping by polymerase chain reaction. J Forensic Sci，1992，37(5)∶1269-1275.
[3] Crouse C, Vincek V. Identification of ABO alleles on forensic-type specimens using rapid-ABO genotyping. Bio Techniques, 1995, 18(3)∶478-483.
, 百拇医药
[4] Ladd C, Bourke MT, Scherczinger CA, et al. A PCR-based strategy for ABO genotype determination. J Forensic Sci, 1996, 41(1)∶134-137.
[5] Akane A, Yoshimura S, Yoshida M, et al. ABO genotyping following a single PCR amplification. J Forensic Sci, 1996, 41(2)∶272-274.
[6] Herrin G. A simplified amplification procedure for two regions of the glycosyl transferase (ABO blood group) gene. J Forensic Sci, 1996, 41(1)∶138-141.
[7] 余纯应，杨庆恩，朱传红，等.汉族人群五个STR基因座的多态性调查.中国法医学杂志，1997，2(12)∶69-73.
[8] 李荣华.ABO血型的生化遗传与基因型测定.中华医学遗传学杂志，1994，6(11)∶341-344.
[9] 赵桐茂.人类血型遗传学.第1版.北京：科学出版社，1987.50-53.
(收稿：1998-04-16 修回：1998-11-02), 百拇医药