mRNA-cDNA高敏感性原位分子杂交技术
作者：段小娴 罗丹 苏建家
单位：广西肿瘤防治研究所 南宁 530021
关键词：mRNA-cDNA；原位杂交组织化学；c-myc；N-ras
广西医科大学学报9904113
摘要 目的：探讨效果更加满意的核酸分子杂交技术的方法。方法：采用原位分子杂交技术结合免疫组化SP法，在人肝癌组织石蜡切片上显示c-myc和N-ras基因的mRNA。结果：c-myc mRNA和N-ras mRNA杂交信号呈红色，清晰可见于细胞浆内，背景浅淡，效果满意。结论：此方法与以往的原位杂交方法相比，能明显放大杂交信号，提高检测的敏感性和稳定性。
中国图书资料分类法分类号 R730.43
HYBRIDIZATION OF THE INSITU HIGHLY SENSIBLE TO mRNA-cDNA
, 百拇医药
Duan Xiaoxian,Luo Dan,Su Jianjia
(Guangxi Cancer Institute,Nanning,530021)
Abstract Objective:To find out a better method for nucleic acid hybridization.Method:The mRNAs of c-myc gene and N-ras gene was revealed on paraffin section of human liver cancer tissues through the combination of the insitu hybridization and immune histochemistry SP.Result:The signal of the c-mRNA and N-ras mRNA hybridization which was in red color was seen clearly in cell sap in light colored background.Conclusion:This method can significantly amplify hybridization signals and increase the sensitivity and stability of the test.
, 百拇医药
Key words mRNA-cDNA;isitu hybridization hitochemistry;c-myc;N-ras
以往，人们欲知某种癌组织有何特异性表达基因，一般是采用免疫组织化学方法，在组织切片上显示癌基因的表达蛋白，或者是用一般的核酸分子杂交技术来显示其RNA或DNA。我们借鉴过去的方法将核酸分子杂交技术与当前使用的最敏感、省时的免疫组织化学SP法结合起来，在组织细胞原位显示人肝癌组织c-myc mRNA和N-ras mRNA。现将此方法介绍如下
1 原 理
原位杂交组织化学(Insitu hybridization histochemistry,ISH)是将重组核酸分子杂交技术与免疫组织化学技术结合起来，在组织细胞原位显示某种特定基因或mRNA的一种新兴技术，它吸收了一般分子杂交技术特异性强，灵敏度高的优点，兼备组织化学染色的可见性，特异性地研究组织细胞内特定基因和mRNA 的表达，进行定位和定量检测[1]。
, 百拇医药
2 材 料
2.1 杂交液，生物素标记N-ras cDNA探针(北京中山生物技术公司)；生物素标记c-myc cDNA探针(美国ENZO公司和北京中山生物技术公司)；鼠抗生物素，生物素化羊抗鼠，SP-HRP，AEC(福州市迈新生物技术公司)。
2.2 人肝癌组织经质量分数为10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm 切片。
3 方 法
3.1 切片置 60℃烤箱30～60 min。
3.2 切片经二甲苯脱蜡→水洗→去离子水洗2次，每次3 min。
3.3 质量分数为0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)浸泡5 min。
, 百拇医药 3.4 0.2 mol/L HCl浸泡20 min。
3.5 pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，每次2 min。
3.6 滴加洋地黄液5 min。
3.7 PBS洗2次，每次2 min。
3.8 滴加蛋白酶K(40 mg/L)，放37℃孵育15 min。
3.9 PBS洗2次，每次2 min。
3.10 质量分数为4%多聚甲醛浸泡10 min。
3.11 PBS洗 2次，每次2 min。
3.12 质量分数为1%H2O2-甲醛浸泡10 min→去离子水洗3 min→体积分数为70%酒精3 min→体积分数为90%酒精3 min→体积分数为100%酒精3 min→干片。
, 百拇医药
3.13 质量分数为70%甲酰胺-2×SSC缓冲液浸泡10 min。
3.14 滴加预杂交液，放42℃温箱孵育2～4 h。
3.15 cDNA探针(生物素标记N-ras cDNA探针或生物素标记c-myc cDNA探针)加杂交液，90℃5 min变性后，滴加于切片上，加盖玻片盖好，然后放42℃温箱36 h，用PBS去盖玻片(盖玻片与组织之间粘贴太紧，因此用 PBS较易去盖玻片)。
3.16 2×SSC缓冲液浸洗10 min→1×SSC缓冲液浸洗10 min→0.5×SSC浸洗5 min→0.1×SSC缓冲液浸洗5 min→PBS浸洗5 min。
3.17 滴加鼠抗生物素37℃温箱孵育20 min。
3.18 PBS浸洗5 min。
, 百拇医药
3.19 生物素化羊抗鼠37℃温箱孵育20 min。
3.20 PBS浸洗5 min。
3.21 滴加SP-HRP(链菌素亲生物蛋白——过氧化酶)，置37℃温箱孵育30 min。
3.22 PBS洗3次，每次1 min。
3.23 室温下AEC显色20 min→水洗→苏木素复染→AEC封片剂封片。
4 结 果
N-ras mRNA和c-myc mRNA杂交信号呈红色，清晰可见于细胞浆内，背景浅淡，效果满意(图1，2)。
, 百拇医药
图1 人肝癌组织，胞浆内红色即为N-ras mRNA ×200
图2 人肝癌组织，胞浆内红色即为c-myc mRNA ×400
5 讨 论
我们经过多次摸索，总结出在使用蛋白酶K消化之前，先使用0.2 mol/L HCl 20 min及洋地黄液5min，可增强细胞的通透性，利于探针进入细胞。杂交后，在显示生物素标记杂交信号前，加鼠抗生物素和生物素化羊抗鼠二步，利用抗生物素抗体的亲和力和特异性，结合更多的杂交信号标记物，使杂交信号进一步放大，提高检测的敏感性。在本实验中，我们之所以使用SP法而非ABC法或PAP法，主要是因为链菌素亲生物素含四个亚基，每个亚基都能与一个生物素分子结合，其亲和键非常强，而且其蛋白等电点接近中性，几乎不与组织中的内源性凝集素等样物质发生非特异性结合，有低背景，高放大的效果，与ABC法或PAP法比较，具有染色时间短(30～60 min)，灵敏度高，特异性强，背景更清晰等特点[2]。因此，此染色方法与以往的原位分子杂交方法相比，具有较高的敏感性，稳定性。
, http://www.100md.com
操作注意事项：①组织载玻片清洗及高温处理后用多聚赖氨酸涂片，烤干使用，可有效地减少组织由于杂交时间长，而脱片；②由于RNA酶广泛存在于人体及周围环境里，为预防RNA酶消化切片的靶RNA，杂交前使用的试剂及器皿均需经高温处理，并均需带手套操作；③杂交时探针需变性，切片不变性；④杂交时间要充分，标本加盖玻片后，四周用指甲油封好，可防止杂交液蒸发或稀释。
参考文献
1 倪灿荣.免疫组织化学实验新技术及应用.北京：北京科学技术出版社，1993.252～270
2 施作榕.链霉素亲合物蛋白——生物素酶标免疫组化染色法的初步研究.中华免疫学杂志，1986，2(3)：169
收稿日期：1998-02-20, 百拇医药
单位：广西肿瘤防治研究所 南宁 530021
关键词：mRNA-cDNA；原位杂交组织化学；c-myc；N-ras
广西医科大学学报9904113
摘要 目的：探讨效果更加满意的核酸分子杂交技术的方法。方法：采用原位分子杂交技术结合免疫组化SP法，在人肝癌组织石蜡切片上显示c-myc和N-ras基因的mRNA。结果：c-myc mRNA和N-ras mRNA杂交信号呈红色，清晰可见于细胞浆内，背景浅淡，效果满意。结论：此方法与以往的原位杂交方法相比，能明显放大杂交信号，提高检测的敏感性和稳定性。
中国图书资料分类法分类号 R730.43
HYBRIDIZATION OF THE INSITU HIGHLY SENSIBLE TO mRNA-cDNA
, 百拇医药
Duan Xiaoxian,Luo Dan,Su Jianjia
(Guangxi Cancer Institute,Nanning,530021)
Abstract Objective:To find out a better method for nucleic acid hybridization.Method:The mRNAs of c-myc gene and N-ras gene was revealed on paraffin section of human liver cancer tissues through the combination of the insitu hybridization and immune histochemistry SP.Result:The signal of the c-mRNA and N-ras mRNA hybridization which was in red color was seen clearly in cell sap in light colored background.Conclusion:This method can significantly amplify hybridization signals and increase the sensitivity and stability of the test.
, 百拇医药
Key words mRNA-cDNA;isitu hybridization hitochemistry;c-myc;N-ras
以往，人们欲知某种癌组织有何特异性表达基因，一般是采用免疫组织化学方法，在组织切片上显示癌基因的表达蛋白，或者是用一般的核酸分子杂交技术来显示其RNA或DNA。我们借鉴过去的方法将核酸分子杂交技术与当前使用的最敏感、省时的免疫组织化学SP法结合起来，在组织细胞原位显示人肝癌组织c-myc mRNA和N-ras mRNA。现将此方法介绍如下
1 原 理
原位杂交组织化学(Insitu hybridization histochemistry,ISH)是将重组核酸分子杂交技术与免疫组织化学技术结合起来，在组织细胞原位显示某种特定基因或mRNA的一种新兴技术，它吸收了一般分子杂交技术特异性强，灵敏度高的优点，兼备组织化学染色的可见性，特异性地研究组织细胞内特定基因和mRNA 的表达，进行定位和定量检测[1]。
, 百拇医药
2 材 料
2.1 杂交液，生物素标记N-ras cDNA探针(北京中山生物技术公司)；生物素标记c-myc cDNA探针(美国ENZO公司和北京中山生物技术公司)；鼠抗生物素，生物素化羊抗鼠，SP-HRP，AEC(福州市迈新生物技术公司)。
2.2 人肝癌组织经质量分数为10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm 切片。
3 方 法
3.1 切片置 60℃烤箱30～60 min。
3.2 切片经二甲苯脱蜡→水洗→去离子水洗2次，每次3 min。
3.3 质量分数为0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)浸泡5 min。
, 百拇医药 3.4 0.2 mol/L HCl浸泡20 min。
3.5 pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，每次2 min。
3.6 滴加洋地黄液5 min。
3.7 PBS洗2次，每次2 min。
3.8 滴加蛋白酶K(40 mg/L)，放37℃孵育15 min。
3.9 PBS洗2次，每次2 min。
3.10 质量分数为4%多聚甲醛浸泡10 min。
3.11 PBS洗 2次，每次2 min。
3.12 质量分数为1%H2O2-甲醛浸泡10 min→去离子水洗3 min→体积分数为70%酒精3 min→体积分数为90%酒精3 min→体积分数为100%酒精3 min→干片。
, 百拇医药
3.13 质量分数为70%甲酰胺-2×SSC缓冲液浸泡10 min。
3.14 滴加预杂交液，放42℃温箱孵育2～4 h。
3.15 cDNA探针(生物素标记N-ras cDNA探针或生物素标记c-myc cDNA探针)加杂交液，90℃5 min变性后，滴加于切片上，加盖玻片盖好，然后放42℃温箱36 h，用PBS去盖玻片(盖玻片与组织之间粘贴太紧，因此用 PBS较易去盖玻片)。
3.16 2×SSC缓冲液浸洗10 min→1×SSC缓冲液浸洗10 min→0.5×SSC浸洗5 min→0.1×SSC缓冲液浸洗5 min→PBS浸洗5 min。
3.17 滴加鼠抗生物素37℃温箱孵育20 min。
3.18 PBS浸洗5 min。
, 百拇医药
3.19 生物素化羊抗鼠37℃温箱孵育20 min。
3.20 PBS浸洗5 min。
3.21 滴加SP-HRP(链菌素亲生物蛋白——过氧化酶)，置37℃温箱孵育30 min。
3.22 PBS洗3次，每次1 min。
3.23 室温下AEC显色20 min→水洗→苏木素复染→AEC封片剂封片。
4 结 果
N-ras mRNA和c-myc mRNA杂交信号呈红色，清晰可见于细胞浆内，背景浅淡，效果满意(图1，2)。
, 百拇医药
图1 人肝癌组织，胞浆内红色即为N-ras mRNA ×200
图2 人肝癌组织，胞浆内红色即为c-myc mRNA ×400
5 讨 论
我们经过多次摸索，总结出在使用蛋白酶K消化之前，先使用0.2 mol/L HCl 20 min及洋地黄液5min，可增强细胞的通透性，利于探针进入细胞。杂交后，在显示生物素标记杂交信号前，加鼠抗生物素和生物素化羊抗鼠二步，利用抗生物素抗体的亲和力和特异性，结合更多的杂交信号标记物，使杂交信号进一步放大，提高检测的敏感性。在本实验中，我们之所以使用SP法而非ABC法或PAP法，主要是因为链菌素亲生物素含四个亚基，每个亚基都能与一个生物素分子结合，其亲和键非常强，而且其蛋白等电点接近中性，几乎不与组织中的内源性凝集素等样物质发生非特异性结合，有低背景，高放大的效果，与ABC法或PAP法比较，具有染色时间短(30～60 min)，灵敏度高，特异性强，背景更清晰等特点[2]。因此，此染色方法与以往的原位分子杂交方法相比，具有较高的敏感性，稳定性。
, http://www.100md.com
操作注意事项：①组织载玻片清洗及高温处理后用多聚赖氨酸涂片，烤干使用，可有效地减少组织由于杂交时间长，而脱片；②由于RNA酶广泛存在于人体及周围环境里，为预防RNA酶消化切片的靶RNA，杂交前使用的试剂及器皿均需经高温处理，并均需带手套操作；③杂交时探针需变性，切片不变性；④杂交时间要充分，标本加盖玻片后，四周用指甲油封好，可防止杂交液蒸发或稀释。
参考文献
1 倪灿荣.免疫组织化学实验新技术及应用.北京：北京科学技术出版社，1993.252～270
2 施作榕.链霉素亲合物蛋白——生物素酶标免疫组化染色法的初步研究.中华免疫学杂志，1986，2(3)：169
收稿日期：1998-02-20, 百拇医药