抗白介素6单抗诱导系统性红斑狼疮外周血T细胞凋亡的研究
作者：汤宇澄 殷志伟 谢平 毛棣华 王宝涛
单位：215007 苏州医学院病理生理教研室
关键词：
抗白介素6单抗诱导系统性红斑狼疮外周血 T细胞凋亡的研究 汤宇澄 殷志伟 谢平 毛棣华 王宝涛
近年来在细胞凋亡研究中观察到白介素2(IL-2)、IL-6等具有抑制淋巴细胞凋亡的作用。因此IL-2、IL-6分泌异常增高可能与SLE患者淋巴细胞凋亡缺陷有关。针对自身免疫性疾病中的这种细胞异常，人们发展了多种较特异性的疗法以期能保护和诱导淋巴细胞的正常凋亡作用[1]。但抗细胞因子抗体与淋巴细胞凋亡的关系深入研究不多。文献中有抗IL-2单抗诱导T细胞凋亡的作用[2]，但抗IL-6单抗与T细胞凋亡的关系尚未见报道。我们研究了抗IL-6单抗(AH-65)与SLE患者外周血T细胞凋亡的关系，报道如下。
, 百拇医药
一、材料和方法
(一)SLE患者为我院附属第一、第二医院住院或门诊患者，均符合美国风湿病协会1982年修订的诊断标准。活动期或非活动期SLE的判断参照我室陈家福采用的标准[3]。活动期、非活动期各10例，均为女性，年龄20～45岁。正常人10例，自苏州市血站健康人中采取；年龄20～49岁，均为女性。各组年龄、性别基本齐同。
(二)试剂与方法：
1.主要试剂及设备：抗IL-6单抗(AH-65)由法国陆肇阳博士惠赠。流式细胞仪为美国Coulter产品，机型为EpICSRXL。
2.方法：采用尼龙毛棉柱法分离T细胞，CD3间接免疫荧光法检测示该法收集T细胞纯度>90%。参照国外文献及国内唐佩弦等人[5]的方法，将T细胞置96孔板中培养，每孔约1×105个细胞，培养3天，第4天取出用台盼蓝拒染测得活力>95%，加入IL-2 30U/ml培养1天，倒置显微镜下观察，细胞团>50个细胞为一集落。用10μg/ml AH-65诱导活化后的T细胞凋亡1天，对照组为10μg/ml AH-65加入新鲜分离的T细胞一天。凋亡检测采用透射电镜、流式细胞仪、电泳三种方法[2～4]。
, 百拇医药
3.统计学方法：实验组与对照组凋亡百分比均数以±s表示，采用方差分析。
二、结果
(一)活化的T细胞加入AH-65前后生长观察：在倒置显微镜下，未加AH-65的T细胞成团生长，加入AH-65后活化的T细胞呈散在生长。
(二)AH-65诱导活化的T细胞凋亡形态的电镜观察：通过电镜观察可见正常T细胞核染色质不均匀分布，核浆比较大，AH-65作用后，示T细胞膜完整，但核染色质浓缩边聚，并有凋亡小体。
(三)流式细胞仪定量检测：细胞凋亡时，流式细胞仪检测示亚二倍体核型峰，此外PI染色的细胞凋亡出现低于正常的前散射和较高的侧散射而坏死呈现较高的前侧散射，从而将凋亡与坏死区别开来。附表结果示AH-65对静止期T细胞无作用。各组活化与未活化之间比较有显著性差异(F=98.51，P〈0.01)，但各组之间无显著性
, 百拇医药
差异。
(四)AH-65诱导活化的T细胞凋亡的电泳观察：电泳结果示AH-65作用后活化的T细胞出现具有明显凋亡特征的阶
附表 抗白介素6单抗诱导活化的T细胞
凋亡百分比(
±s，%)
组 别
例数
活化的T细胞
未活化的T细胞
正常人对照
, 百拇医药
10
12.22±4.11
0.16±0.05
非活动期SLE
10
7.04±2.34
0.50±0.27
活动期SLE
10
8.56±2.61
0.18±0.04
梯状条带。
, 百拇医药
三、讨论
外来抗原通过TCR/CD3途径不仅活化外周成熟的T细胞，而且诱导已活化的反应性T细胞凋亡。也就是说体内存在一个T细胞对抗原增殖反应的反馈调节，这种调节是细胞自主性的也是内在性的。这种作用也即是活化诱导的细胞死亡(AICD)。AICD能下调机体免疫反应并清除有害的特异性T细胞。有学者发现去细胞因子IL-2能引起T细胞AICD的产生，而细胞因子IL-6则能部分抑制EB病毒感染引起的活化T细胞凋亡。因此研究SLE患者细胞因子与其异常的T细胞凋亡作用，对于选择特异性免疫治疗药物有指导意义。
参 考 文 献
1 杨海平综述. 自身基因、淋巴细胞凋亡与系统性红斑狼疮. 国外医学皮肤性病学分册, 1996,22∶327-330.
2 Hernandez CT, Martinez EM, Sancho D, et al. Interleukine-7 rescues human activated Tlymphocyte from apoptosis induced by glucocorticosteroids and regulates bcl-2 and CD25expression. Hum Immunol, 1995,43∶181-186.
, 百拇医药
3 陈家福, 殷志伟, 冯树一, 等. SLE患者白介素6活性的研究.中华皮肤科杂志,1993,26∶32-34.
4 Wesselborg S, Janssen O, Kabelitz D. Induction of activation-driven death (apoptosis) inactive but not resting peripheral blood T cells. J Immunol, 1993,150∶4338-4345.
5 唐佩弦主编. 造血细胞培养技术. 西安: 陕西科技出版社, 1985.161.
(收稿：1997-07-31 修回：1997-11-03), 百拇医药
单位：215007 苏州医学院病理生理教研室
关键词：
抗白介素6单抗诱导系统性红斑狼疮外周血 T细胞凋亡的研究 汤宇澄 殷志伟 谢平 毛棣华 王宝涛
近年来在细胞凋亡研究中观察到白介素2(IL-2)、IL-6等具有抑制淋巴细胞凋亡的作用。因此IL-2、IL-6分泌异常增高可能与SLE患者淋巴细胞凋亡缺陷有关。针对自身免疫性疾病中的这种细胞异常，人们发展了多种较特异性的疗法以期能保护和诱导淋巴细胞的正常凋亡作用[1]。但抗细胞因子抗体与淋巴细胞凋亡的关系深入研究不多。文献中有抗IL-2单抗诱导T细胞凋亡的作用[2]，但抗IL-6单抗与T细胞凋亡的关系尚未见报道。我们研究了抗IL-6单抗(AH-65)与SLE患者外周血T细胞凋亡的关系，报道如下。
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一、材料和方法
(一)SLE患者为我院附属第一、第二医院住院或门诊患者，均符合美国风湿病协会1982年修订的诊断标准。活动期或非活动期SLE的判断参照我室陈家福采用的标准[3]。活动期、非活动期各10例，均为女性，年龄20～45岁。正常人10例，自苏州市血站健康人中采取；年龄20～49岁，均为女性。各组年龄、性别基本齐同。
(二)试剂与方法：
1.主要试剂及设备：抗IL-6单抗(AH-65)由法国陆肇阳博士惠赠。流式细胞仪为美国Coulter产品，机型为EpICSRXL。
2.方法：采用尼龙毛棉柱法分离T细胞，CD3间接免疫荧光法检测示该法收集T细胞纯度>90%。参照国外文献及国内唐佩弦等人[5]的方法，将T细胞置96孔板中培养，每孔约1×105个细胞，培养3天，第4天取出用台盼蓝拒染测得活力>95%，加入IL-2 30U/ml培养1天，倒置显微镜下观察，细胞团>50个细胞为一集落。用10μg/ml AH-65诱导活化后的T细胞凋亡1天，对照组为10μg/ml AH-65加入新鲜分离的T细胞一天。凋亡检测采用透射电镜、流式细胞仪、电泳三种方法[2～4]。
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3.统计学方法：实验组与对照组凋亡百分比均数以±s表示，采用方差分析。
二、结果
(一)活化的T细胞加入AH-65前后生长观察：在倒置显微镜下，未加AH-65的T细胞成团生长，加入AH-65后活化的T细胞呈散在生长。
(二)AH-65诱导活化的T细胞凋亡形态的电镜观察：通过电镜观察可见正常T细胞核染色质不均匀分布，核浆比较大，AH-65作用后，示T细胞膜完整，但核染色质浓缩边聚，并有凋亡小体。
(三)流式细胞仪定量检测：细胞凋亡时，流式细胞仪检测示亚二倍体核型峰，此外PI染色的细胞凋亡出现低于正常的前散射和较高的侧散射而坏死呈现较高的前侧散射，从而将凋亡与坏死区别开来。附表结果示AH-65对静止期T细胞无作用。各组活化与未活化之间比较有显著性差异(F=98.51，P〈0.01)，但各组之间无显著性
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差异。
(四)AH-65诱导活化的T细胞凋亡的电泳观察：电泳结果示AH-65作用后活化的T细胞出现具有明显凋亡特征的阶
附表 抗白介素6单抗诱导活化的T细胞
凋亡百分比(
±s，%)组 别
例数
活化的T细胞
未活化的T细胞
正常人对照
, 百拇医药
10
12.22±4.11
0.16±0.05
非活动期SLE
10
7.04±2.34
0.50±0.27
活动期SLE
10
8.56±2.61
0.18±0.04
梯状条带。
, 百拇医药
三、讨论
外来抗原通过TCR/CD3途径不仅活化外周成熟的T细胞，而且诱导已活化的反应性T细胞凋亡。也就是说体内存在一个T细胞对抗原增殖反应的反馈调节，这种调节是细胞自主性的也是内在性的。这种作用也即是活化诱导的细胞死亡(AICD)。AICD能下调机体免疫反应并清除有害的特异性T细胞。有学者发现去细胞因子IL-2能引起T细胞AICD的产生，而细胞因子IL-6则能部分抑制EB病毒感染引起的活化T细胞凋亡。因此研究SLE患者细胞因子与其异常的T细胞凋亡作用，对于选择特异性免疫治疗药物有指导意义。
参 考 文 献
1 杨海平综述. 自身基因、淋巴细胞凋亡与系统性红斑狼疮. 国外医学皮肤性病学分册, 1996,22∶327-330.
2 Hernandez CT, Martinez EM, Sancho D, et al. Interleukine-7 rescues human activated Tlymphocyte from apoptosis induced by glucocorticosteroids and regulates bcl-2 and CD25expression. Hum Immunol, 1995,43∶181-186.
, 百拇医药
3 陈家福, 殷志伟, 冯树一, 等. SLE患者白介素6活性的研究.中华皮肤科杂志,1993,26∶32-34.
4 Wesselborg S, Janssen O, Kabelitz D. Induction of activation-driven death (apoptosis) inactive but not resting peripheral blood T cells. J Immunol, 1993,150∶4338-4345.
5 唐佩弦主编. 造血细胞培养技术. 西安: 陕西科技出版社, 1985.161.
(收稿：1997-07-31 修回：1997-11-03), 百拇医药