系统性红斑狼疮患者外周血单一核细胞中热休克蛋白70表达
作者：陈翔 文海泉 张其亮
单位：410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院皮肤科
关键词：
系统性红斑狼疮患者外周血单一核细胞中 热休克蛋白70表达 陈翔 文海泉 张其亮
国外研究发现狼疮模型小鼠多脏器中有热休克蛋白70(HSP70)表达增高[1]，SLE患者皮损区细胞及外周血单一核细胞(PBMC)中均有HSP70表达增高[2，3]，我们通过检测SLE患者PBMC中HSP70表达水平，旨在探讨HSP70在SLE发病中的作用及其与疾病活动的相关性。
一、病例和方法
1.病例：我院门诊和住院SLE患者29例，均符合1982年ARA诊断标准，男6例，女23例，平均年龄33.0±9.4岁，采集标本时体温均低于38℃。其中活动期21例，平均年龄31.9±9.9岁，非活动期8例，平均年龄36.0±7.8岁。对照组为健康献血员及实验室人员20例，男4例，女16例，平均年龄31.7±8.5岁。
, http://www.100md.com
2.标本采集：无菌抽取抗凝静脉血4ml，并同时检测SLE患者抗dsDNA抗体和尿蛋白水平。
3.PBMC分离、裂解：用Ficoll-Hypaque离心法分离PBMC，计算PBMC总数，加入25μl/106个PBMC的悬浮缓冲液[0.1mol/L NaCl，0.01mol/LTris·Cl(pH7.6)，0.001mol/L EDTA，100μg/ml PMSF]，再加入等体积的加样缓冲液[0.1mol/L Tris·Cl(pH6.8)，0.2mol/L DTT，4% SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油]，置沸水浴10分钟，4000r/min离心10分钟，置上清液于-20℃备用。
4.免疫印迹分析：每样本取50μl经SDS-PAGE以分离蛋白质，电转膜(4℃、100mA、14h)后将硝酸纤维膜剪成条带并封闭，加入1∶1000鼠抗HSP70单抗(Sigma)，24小时后用PBS洗膜再加入1∶2000碱性磷酸酶标记二抗(Sigma)，2小时后PBS洗膜再加入生色底物显色后中止反应。
, 百拇医药
5.统计分析：用成组设计两样本比较秩和检验进行SLE组和对照组PBMC中HSP70表达比较分析。用多样本两两比较秩和检验进行活动期SLE、非活动期SLE、对照组PBMC中HSP70表达水平两两间比较分析。SLE组PBMC中HSP70表达与其抗dsDNA抗体、尿蛋白水平之间用等级相关分析。
二、结果
1.分级判断各样本膜上HSP70表达水平：强阳性(++)：显现极明显蛋白带；阳性(+)：显现较明显蛋白带；弱阳性(±)：显现不明显蛋白带；阴性(-)：未显现蛋白带。其判断结果见附表。
经统计分析发现SLE组PBMC中附表 SLE患者及对照组外周血单一核细胞中热休克蛋白70表达水平
分 组
例数
, 百拇医药
表 达 分 级
++
+
±
-
SLE组
29
5
8
12
4
对照组
20
0
, 百拇医药
0
11
9
HSP70表达水平较对照组有显著升高(Uc=3.517，P<0.01)。
2.统计结果显示：活动期SLE患者PBMC中HSP70表达与对照组比较显著升高(P<0.01)；非活动期SLE患者与对照组比较也显著升高(P<0.05)；但活动期与非活动期患者PBMC中HSP70表达水平比较无显著性差异(P>0.05)。
3.SLE患者dsDNA抗体、尿蛋白检测结果发现活动期SLE组PBMC中HSP70表达水平与其抗dsDNA抗体、尿蛋白水平均无相关性(r分别为-0.03和0.253，P均>0.05)。非活动期组亦然(r分别为0.296和0.503，P均>0.05)。
, 百拇医药 三、讨论
Dhillon等[3]报道SLE患者PBMC中HSP70表达增高。SLE患者皮损区[2]及狼疮小鼠多脏器中[1]均有HSP70表达增加。本研究发现SLE患者PBMC中HSP70表达水平较对照组确有升高(P?.01)，且同时出现于活动期和非活动期SLE患者中。结合SLE患者体内HSP70基因转录水平[4]和狼疮小鼠HSP70自身抗体[5]升高的报道，应考虑到增高表达的HSP70可能作为一种自身抗原参与SLE发病。HSP70可参与免疫球蛋白合成和抗原递呈，因此HSP70可能伴随SLE患者体内自身抗体合成和自身抗原递呈而表达增加。部分SLE患者PBMC中并无HSP70高表达(见附表)，因此认为SLE患者发病机理是多因素的，并非全与HSP70增高表达有关。本研究还显示活动期与非活动期SLE患者PBMC中HSP70表达水平之间无显著性差异，且表达水平与其抗dsDNA抗体、尿蛋白水平比较无显著性相关，而抗dsDNA抗体阳性和尿蛋白高水平通常出现于活动期SLE患者，是判断SLE患者病情活动性的重要实验室指标。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Faulds GB, Isenberg DA, Latchman DS, et al. The tissue specific elevation in synthesisof 90kD HSP precedes the onset of disease in lupus prone MRL/lpr mice. J Rheumatol,1994,21∶234-238.
2 Ghoreishi M, Katayama I, Yokozeki H, et al. Analysis of 70kD heat shock protein(HSP70) expression in the lesional skin of LE and LE related diseases. J Dermatol,1993,20∶400-405.
3 Dhillon VB, Mccallum S, Norton P, et al. Differential heat shock protein over-expression and its clinical relevance in SLE. Ann Rheum Dis, 1993,52∶436-442.
, http://www.100md.com
4 Deguchi Y, Kishimoto S. Enhanced expression of heat shock protein gene in peripheral blood mononuclear cells of patients with active SLE. Ann Rheum Dis, 1990,49∶893-895.
5 Faulds G, Conroy S, Madalo M, et al. Increased levels of antibodies to heat shock proteins with increasing age in MRL/lpr mice. Br J Rheumatol, 1995,34∶610-615.
(收稿：1997-07-25 修回：1997-10-21), 百拇医药
单位：410011 长沙，湖南医科大学附属第二医院皮肤科
关键词：
系统性红斑狼疮患者外周血单一核细胞中 热休克蛋白70表达 陈翔 文海泉 张其亮
国外研究发现狼疮模型小鼠多脏器中有热休克蛋白70(HSP70)表达增高[1]，SLE患者皮损区细胞及外周血单一核细胞(PBMC)中均有HSP70表达增高[2，3]，我们通过检测SLE患者PBMC中HSP70表达水平，旨在探讨HSP70在SLE发病中的作用及其与疾病活动的相关性。
一、病例和方法
1.病例：我院门诊和住院SLE患者29例，均符合1982年ARA诊断标准，男6例，女23例，平均年龄33.0±9.4岁，采集标本时体温均低于38℃。其中活动期21例，平均年龄31.9±9.9岁，非活动期8例，平均年龄36.0±7.8岁。对照组为健康献血员及实验室人员20例，男4例，女16例，平均年龄31.7±8.5岁。
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2.标本采集：无菌抽取抗凝静脉血4ml，并同时检测SLE患者抗dsDNA抗体和尿蛋白水平。
3.PBMC分离、裂解：用Ficoll-Hypaque离心法分离PBMC，计算PBMC总数，加入25μl/106个PBMC的悬浮缓冲液[0.1mol/L NaCl，0.01mol/LTris·Cl(pH7.6)，0.001mol/L EDTA，100μg/ml PMSF]，再加入等体积的加样缓冲液[0.1mol/L Tris·Cl(pH6.8)，0.2mol/L DTT，4% SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油]，置沸水浴10分钟，4000r/min离心10分钟，置上清液于-20℃备用。
4.免疫印迹分析：每样本取50μl经SDS-PAGE以分离蛋白质，电转膜(4℃、100mA、14h)后将硝酸纤维膜剪成条带并封闭，加入1∶1000鼠抗HSP70单抗(Sigma)，24小时后用PBS洗膜再加入1∶2000碱性磷酸酶标记二抗(Sigma)，2小时后PBS洗膜再加入生色底物显色后中止反应。
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5.统计分析：用成组设计两样本比较秩和检验进行SLE组和对照组PBMC中HSP70表达比较分析。用多样本两两比较秩和检验进行活动期SLE、非活动期SLE、对照组PBMC中HSP70表达水平两两间比较分析。SLE组PBMC中HSP70表达与其抗dsDNA抗体、尿蛋白水平之间用等级相关分析。
二、结果
1.分级判断各样本膜上HSP70表达水平：强阳性(++)：显现极明显蛋白带；阳性(+)：显现较明显蛋白带；弱阳性(±)：显现不明显蛋白带；阴性(-)：未显现蛋白带。其判断结果见附表。
经统计分析发现SLE组PBMC中附表 SLE患者及对照组外周血单一核细胞中热休克蛋白70表达水平
分 组
例数
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表 达 分 级
++
+
±
-
SLE组
29
5
8
12
4
对照组
20
0
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0
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HSP70表达水平较对照组有显著升高(Uc=3.517，P<0.01)。
2.统计结果显示：活动期SLE患者PBMC中HSP70表达与对照组比较显著升高(P<0.01)；非活动期SLE患者与对照组比较也显著升高(P<0.05)；但活动期与非活动期患者PBMC中HSP70表达水平比较无显著性差异(P>0.05)。
3.SLE患者dsDNA抗体、尿蛋白检测结果发现活动期SLE组PBMC中HSP70表达水平与其抗dsDNA抗体、尿蛋白水平均无相关性(r分别为-0.03和0.253，P均>0.05)。非活动期组亦然(r分别为0.296和0.503，P均>0.05)。
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Dhillon等[3]报道SLE患者PBMC中HSP70表达增高。SLE患者皮损区[2]及狼疮小鼠多脏器中[1]均有HSP70表达增加。本研究发现SLE患者PBMC中HSP70表达水平较对照组确有升高(P?.01)，且同时出现于活动期和非活动期SLE患者中。结合SLE患者体内HSP70基因转录水平[4]和狼疮小鼠HSP70自身抗体[5]升高的报道，应考虑到增高表达的HSP70可能作为一种自身抗原参与SLE发病。HSP70可参与免疫球蛋白合成和抗原递呈，因此HSP70可能伴随SLE患者体内自身抗体合成和自身抗原递呈而表达增加。部分SLE患者PBMC中并无HSP70高表达(见附表)，因此认为SLE患者发病机理是多因素的，并非全与HSP70增高表达有关。本研究还显示活动期与非活动期SLE患者PBMC中HSP70表达水平之间无显著性差异，且表达水平与其抗dsDNA抗体、尿蛋白水平比较无显著性相关，而抗dsDNA抗体阳性和尿蛋白高水平通常出现于活动期SLE患者，是判断SLE患者病情活动性的重要实验室指标。
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参 考 文 献
1 Faulds GB, Isenberg DA, Latchman DS, et al. The tissue specific elevation in synthesisof 90kD HSP precedes the onset of disease in lupus prone MRL/lpr mice. J Rheumatol,1994,21∶234-238.
2 Ghoreishi M, Katayama I, Yokozeki H, et al. Analysis of 70kD heat shock protein(HSP70) expression in the lesional skin of LE and LE related diseases. J Dermatol,1993,20∶400-405.
3 Dhillon VB, Mccallum S, Norton P, et al. Differential heat shock protein over-expression and its clinical relevance in SLE. Ann Rheum Dis, 1993,52∶436-442.
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4 Deguchi Y, Kishimoto S. Enhanced expression of heat shock protein gene in peripheral blood mononuclear cells of patients with active SLE. Ann Rheum Dis, 1990,49∶893-895.
5 Faulds G, Conroy S, Madalo M, et al. Increased levels of antibodies to heat shock proteins with increasing age in MRL/lpr mice. Br J Rheumatol, 1995,34∶610-615.
(收稿：1997-07-25 修回：1997-10-21), 百拇医药