血小板衍生生长因子受体在硬皮病皮损的表达
作者：郑学毅 马圣清 张建中 李翠贞 蔡小燕
单位：510180 广州市第一人民医院内科(郑学毅 李翠贞 蔡小燕)；北京医科大学人民医院(张建中)；北京医科大学第一医院(马圣清)
关键词：硬皮病；成纤维细胞；血小板衍生生长因子
中华皮肤科杂志980113
【摘要】 目的 探讨血小板衍生生长因子( PDGF)在硬皮病发病中的作用。方法 选用特异性多克隆抗体以免疫组化方法检测了8例硬皮病患者和9例正常皮肤标本PDGF受体的表达。结果 研究发现PDGF受体α和β亚单位在8例硬皮病患者皮损表达均明显增高，而9例正常皮肤中仅少数标本呈微弱表达，此差异经统计学检验显示有显著性意义(P〈0.05)。结论 PDGF受体α和β亚单位表达的增高可能与硬皮病纤维化的形成相关。
, 百拇医药
The Expression of Platelet-derived Growth Factor Receptor in Scleroderma Lesion Zheng Xueyi,Ma Shengqing,Zhang Jianzhong,et al.The First Municipal People′s Hospital Guangzhou,Guangzhou 510000
【Abstract】 Objective To investigate the role of platelet-derived growth factor (PDGF) receptor in the development of scleroderma fibrosis. Methods The expression of PDGF receptor was detected in skin biopsy specimens of 8 scleroderma patients and 9 healthy individuals by immunohistochemical staining using specific polyclonal antibodies. Results PDGF receptor subunits α and β expression was markedly increased in all of the scleroderma lesions, whereas PDGF receptor was weakly expressed in a few normal skin specimens,the difference was significant (P〈0.05). Conclusion The increased expression of PDGF receptor subunits may be related to the development of fibrosis of scleroderma.
, http://www.100md.com
【Key words】 Scleroderma Fibroblasts Platelet-derived growth factor
硬皮病发病机理尚不清楚。近年研究结果表明：硬皮病存在着胶原合成异常和免疫异常。血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)是结缔组织来源细胞的主要有丝分裂原，可调控成纤维细胞的分化增殖；具有诱导胶原和其它细胞外基质成分合成的功能；还通过调控白介素的生成参与免疫[1，2]。国外研究已表明PDGF是参与硬皮病纤维化的主要生长因子[3]。
我们采用免疫组化方法检测了硬皮病皮损中PDGF受体α和β亚单位的表达，以探讨PDGF在硬皮病发病中的可能作用。
材料和方法
研究对象：北京医科大学第一医院和本院门诊或住院确诊的8例硬皮病患者，诊断符合美国风湿病协会标准，局限性硬皮病5例，系统性硬皮病3例，年龄25～65岁，病程0.5～25年。局限性硬皮病标本取自皮损边缘，系统性硬皮病取自前臂曲侧。取材前2个月内未接受皮质类固醇激素(激素)及免疫抑制剂等药物治疗，且不伴有肿瘤或其它内科严重疾患。对照组为外科成形手术正常人皮肤。
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主要试剂：多克隆PDGF受体α、β亚单位抗体，购自Santa Cruz BiotechnologyInc，美国。过氧化物酶标记链霉亲和素(streptanvidin/peroxidase)免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒购自中山生物技术有限公司。
免疫组化染色方法：载玻片以APES处理，冰冻切片经丙酮固定，水化后以1%H2O2及10%正常羊血清孵育，再依次加入Ⅰ抗(PDGFα、β亚单位抗体，1∶100稀释)，Ⅱ抗(IgG/Bio，1∶100，1% BSA-PBS稀释)及Ⅲ抗(SP/HRP，1∶100)，以上每一步骤前均以0.1mol/L PBS充分浸洗标本，最后DAB显色，苏木精复染，封片。
分析方法：免疫组化染色结果的分析综合阳性细胞半定量和染色强度两方面进行。每张切片在高倍镜下(400×)选择5个视野，计数每100个细胞中阳性细胞个数，取其平均值作为该标本的PDGF受体染色阳性率。PDGF受体细胞阳性率以半定量(-)、(+)、(++)、(+++)4个等级表示，(-)为未见阳性细胞，(+)为阳性率<40%，(++)为阳性率40%～60%，(+++)为阳性率>60%。染色强度根据以下方法分为4级：(-)为阴性，(+)为染色弱但明显高于阴性对照，(++)为染色清晰，(+++)为染色强。结果采用秩和检验分析。
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结 果
免疫组化染色显示，PDGF受体α、β亚单位的染色模式基本相同。9例正常人皮肤中PDGF受体α亚单位2例阳性，β亚单位3例阳性，阳性染色可见于极少数成纤维细胞和血管内皮细胞。在8例硬皮病皮损中，PDGF受体α、β亚单位均阳性染色，阳性染色强度和阳性率明显高于对照组，详细结果见附表(表1～4)。硬皮病标本阳性染色强度明显强于正常人皮肤；阳性染色细胞亦显著增多，主要为真皮层成纤维细胞、炎症浸润细胞(部分炎症浸润细胞为淋巴细胞)和小血管内皮细胞。同时本试验还发现在组织学炎症浸润细胞较多处，PDGF受体阳性成纤维细胞较多，染色亦较深。经秩和检验，PDGF受体α、β亚单位染色结果在硬皮病组和对照组之间有显著性差异(P〈0.05)。
表1 硬皮病皮损血小板衍生生长因子受体α亚单位染色阳性细胞
组 别
例数
, http://www.100md.com
-
+
++
+++
阳性率
硬皮病组
8
0
2
3
3
100%
正常人对照组
9
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7
1
1
0
22.2%
表2 硬皮病皮损血小板衍生生长因子受体β亚单位染色阳性细胞
组 别
例数
-
+
++
+++
阳性率
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硬皮病组
8
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2
2
4
100%
正常人对照组
9
6
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1
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33.3%
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表3 硬皮病皮损血小板衍生生长因子受体α亚单位染色强度结果
组 别
例数
-
+
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阳性率
硬皮病组
8
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0
2
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6
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正常人对照组
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表4 硬皮病皮损血小板衍生生长因子受体β亚单位染色强度结果
组 别
例数
-
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+
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阳性率
硬皮病组
8
0
0
1
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正常人对照组
9
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3
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0
33.3%
讨 论
本研究发现PDGF受体α、β亚单位在正常人皮肤仅部分标本呈微弱表达，与Krane[4]报道的一致。8例硬皮病皮损PDGF受体α、β亚单位的表达均高于正常人对照组，经统计学分析表明有显著性差异。Klareskog[5]等报道系统性硬皮病皮损PDGF受体β亚单位表达明显增高，这一结果与我们的结果是一致的。关于PDGF受体α亚单位在硬皮病皮损表达的研究目前尚未见公开报道。本研究结果表明硬皮病皮损PDGF受体α亚单位表达亦增高，提示PDGF受体α、β亚单位均参与了硬皮病纤维化的形成。
Pandofi[6]等研究发现，用硬皮病患者的血浆或血清刺激3T3成纤维细胞，可显著提高其增殖率；如将该血浆和血清与多克隆PDGF抗体预先孵育，则此血浆和血清失去刺激3T3细胞分裂的能力。说明硬皮病血清血浆中可能有PDGF存在。此结果后来又得到其他研究者的证实。Gay[7]等研究发现硬皮病皮损处PDGF的表达高于正常人对照组，结合本实验结果，硬皮病皮损处成纤维细胞PDGF受体α、β亚单位表达增高，说明PDGF-PDGF受体信号途径可能参与硬皮病皮损局部成纤维细胞的分化增殖和细胞外基质的异常合成。
, 百拇医药
Daynes[2]等报道PDGF可调控T淋巴细胞的功能，增加其IL-2的生成，同时降低IL-4、IL-5和INF-γ的生成，以上作用以PDGF-BB最强，PDGF-AB次之，PDGF-AA作用微弱。因此，Daynes提出PDGF是T细胞的功能调节因子，并参与免疫过程。本实验中，我们发现硬皮病皮损处炎症浸润细胞PDGF受体α、β亚单位呈阳性表达，部分细胞从组织形态学上可以判定为淋巴细胞，这一发现支持了Daynes的观点，提示PDGF可能通过调控T淋巴细胞的功能，参与硬皮病免疫异常的发生。
参 考 文 献
1 Ross R. Peptide regulatory factors: platelet-derived growth factor. Lancet,1989,Ⅰ(8648)∶1179-1182.
2 Daynes RA, Dowell T, Araneo BA, et al. Platelet-derived growth factor is apotent biologic response modifier of T cells. J Exp Med,1991,174∶1323-1333.
, http://www.100md.com
3 LeRoy EC. The control of fibrosis in systemic sclerosis: a strategy involving extracelluler matrix, cytokines, and growth factors. J Dermatol, 1994,21∶1-4.
4 Krane JF, Murphy DP, Gottlieb AB, et al. Increased dermal expression of platelet-derived growth factor receptors in growth-activited skin wounds and psoriasis. J Invest Dermatol, 1991,96∶983-986.
5 Klareskog L, Gustafsson R, Scheynius A, et al. Increased expression of platelet- derived growth factor type B receptors in the skin of patients with systemic sclerosis. Arthritis Rheum, 1990,33∶1534-1541.
, http://www.100md.com
6 Pandofi A, Florita M, Altomare G, et al. Increased plasma levels of platelet-derived growth factor activity in patients with progressive systemic sclerosis. Proc Soc Exp Biol Med, 1989,191∶1-4.
7 Gay S, Jones RE, Huang GQ, et al. Immunohistologic demonstration of platelet-derived growth factor(PDGF) and cis-oncogene expression in scleroderma. J InvestDermatol, 1989,92∶301-304.
(收稿：1997-04-21 修回：1997-09-04), http://www.100md.com
单位：510180 广州市第一人民医院内科(郑学毅 李翠贞 蔡小燕)；北京医科大学人民医院(张建中)；北京医科大学第一医院(马圣清)
关键词：硬皮病；成纤维细胞；血小板衍生生长因子
中华皮肤科杂志980113
【摘要】 目的 探讨血小板衍生生长因子( PDGF)在硬皮病发病中的作用。方法 选用特异性多克隆抗体以免疫组化方法检测了8例硬皮病患者和9例正常皮肤标本PDGF受体的表达。结果 研究发现PDGF受体α和β亚单位在8例硬皮病患者皮损表达均明显增高，而9例正常皮肤中仅少数标本呈微弱表达，此差异经统计学检验显示有显著性意义(P〈0.05)。结论 PDGF受体α和β亚单位表达的增高可能与硬皮病纤维化的形成相关。
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The Expression of Platelet-derived Growth Factor Receptor in Scleroderma Lesion Zheng Xueyi,Ma Shengqing,Zhang Jianzhong,et al.The First Municipal People′s Hospital Guangzhou,Guangzhou 510000
【Abstract】 Objective To investigate the role of platelet-derived growth factor (PDGF) receptor in the development of scleroderma fibrosis. Methods The expression of PDGF receptor was detected in skin biopsy specimens of 8 scleroderma patients and 9 healthy individuals by immunohistochemical staining using specific polyclonal antibodies. Results PDGF receptor subunits α and β expression was markedly increased in all of the scleroderma lesions, whereas PDGF receptor was weakly expressed in a few normal skin specimens,the difference was significant (P〈0.05). Conclusion The increased expression of PDGF receptor subunits may be related to the development of fibrosis of scleroderma.
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【Key words】 Scleroderma Fibroblasts Platelet-derived growth factor
硬皮病发病机理尚不清楚。近年研究结果表明：硬皮病存在着胶原合成异常和免疫异常。血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)是结缔组织来源细胞的主要有丝分裂原，可调控成纤维细胞的分化增殖；具有诱导胶原和其它细胞外基质成分合成的功能；还通过调控白介素的生成参与免疫[1，2]。国外研究已表明PDGF是参与硬皮病纤维化的主要生长因子[3]。
我们采用免疫组化方法检测了硬皮病皮损中PDGF受体α和β亚单位的表达，以探讨PDGF在硬皮病发病中的可能作用。
材料和方法
研究对象：北京医科大学第一医院和本院门诊或住院确诊的8例硬皮病患者，诊断符合美国风湿病协会标准，局限性硬皮病5例，系统性硬皮病3例，年龄25～65岁，病程0.5～25年。局限性硬皮病标本取自皮损边缘，系统性硬皮病取自前臂曲侧。取材前2个月内未接受皮质类固醇激素(激素)及免疫抑制剂等药物治疗，且不伴有肿瘤或其它内科严重疾患。对照组为外科成形手术正常人皮肤。
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主要试剂：多克隆PDGF受体α、β亚单位抗体，购自Santa Cruz BiotechnologyInc，美国。过氧化物酶标记链霉亲和素(streptanvidin/peroxidase)免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒购自中山生物技术有限公司。
免疫组化染色方法：载玻片以APES处理，冰冻切片经丙酮固定，水化后以1%H2O2及10%正常羊血清孵育，再依次加入Ⅰ抗(PDGFα、β亚单位抗体，1∶100稀释)，Ⅱ抗(IgG/Bio，1∶100，1% BSA-PBS稀释)及Ⅲ抗(SP/HRP，1∶100)，以上每一步骤前均以0.1mol/L PBS充分浸洗标本，最后DAB显色，苏木精复染，封片。
分析方法：免疫组化染色结果的分析综合阳性细胞半定量和染色强度两方面进行。每张切片在高倍镜下(400×)选择5个视野，计数每100个细胞中阳性细胞个数，取其平均值作为该标本的PDGF受体染色阳性率。PDGF受体细胞阳性率以半定量(-)、(+)、(++)、(+++)4个等级表示，(-)为未见阳性细胞，(+)为阳性率<40%，(++)为阳性率40%～60%，(+++)为阳性率>60%。染色强度根据以下方法分为4级：(-)为阴性，(+)为染色弱但明显高于阴性对照，(++)为染色清晰，(+++)为染色强。结果采用秩和检验分析。
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结 果
免疫组化染色显示，PDGF受体α、β亚单位的染色模式基本相同。9例正常人皮肤中PDGF受体α亚单位2例阳性，β亚单位3例阳性，阳性染色可见于极少数成纤维细胞和血管内皮细胞。在8例硬皮病皮损中，PDGF受体α、β亚单位均阳性染色，阳性染色强度和阳性率明显高于对照组，详细结果见附表(表1～4)。硬皮病标本阳性染色强度明显强于正常人皮肤；阳性染色细胞亦显著增多，主要为真皮层成纤维细胞、炎症浸润细胞(部分炎症浸润细胞为淋巴细胞)和小血管内皮细胞。同时本试验还发现在组织学炎症浸润细胞较多处，PDGF受体阳性成纤维细胞较多，染色亦较深。经秩和检验，PDGF受体α、β亚单位染色结果在硬皮病组和对照组之间有显著性差异(P〈0.05)。
表1 硬皮病皮损血小板衍生生长因子受体α亚单位染色阳性细胞
组 别
例数
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阳性率
硬皮病组
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表2 硬皮病皮损血小板衍生生长因子受体β亚单位染色阳性细胞
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硬皮病组
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表3 硬皮病皮损血小板衍生生长因子受体α亚单位染色强度结果
组 别
例数
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硬皮病组
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表4 硬皮病皮损血小板衍生生长因子受体β亚单位染色强度结果
组 别
例数
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阳性率
硬皮病组
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正常人对照组
9
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讨 论
本研究发现PDGF受体α、β亚单位在正常人皮肤仅部分标本呈微弱表达，与Krane[4]报道的一致。8例硬皮病皮损PDGF受体α、β亚单位的表达均高于正常人对照组，经统计学分析表明有显著性差异。Klareskog[5]等报道系统性硬皮病皮损PDGF受体β亚单位表达明显增高，这一结果与我们的结果是一致的。关于PDGF受体α亚单位在硬皮病皮损表达的研究目前尚未见公开报道。本研究结果表明硬皮病皮损PDGF受体α亚单位表达亦增高，提示PDGF受体α、β亚单位均参与了硬皮病纤维化的形成。
Pandofi[6]等研究发现，用硬皮病患者的血浆或血清刺激3T3成纤维细胞，可显著提高其增殖率；如将该血浆和血清与多克隆PDGF抗体预先孵育，则此血浆和血清失去刺激3T3细胞分裂的能力。说明硬皮病血清血浆中可能有PDGF存在。此结果后来又得到其他研究者的证实。Gay[7]等研究发现硬皮病皮损处PDGF的表达高于正常人对照组，结合本实验结果，硬皮病皮损处成纤维细胞PDGF受体α、β亚单位表达增高，说明PDGF-PDGF受体信号途径可能参与硬皮病皮损局部成纤维细胞的分化增殖和细胞外基质的异常合成。
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Daynes[2]等报道PDGF可调控T淋巴细胞的功能，增加其IL-2的生成，同时降低IL-4、IL-5和INF-γ的生成，以上作用以PDGF-BB最强，PDGF-AB次之，PDGF-AA作用微弱。因此，Daynes提出PDGF是T细胞的功能调节因子，并参与免疫过程。本实验中，我们发现硬皮病皮损处炎症浸润细胞PDGF受体α、β亚单位呈阳性表达，部分细胞从组织形态学上可以判定为淋巴细胞，这一发现支持了Daynes的观点，提示PDGF可能通过调控T淋巴细胞的功能，参与硬皮病免疫异常的发生。
参 考 文 献
1 Ross R. Peptide regulatory factors: platelet-derived growth factor. Lancet,1989,Ⅰ(8648)∶1179-1182.
2 Daynes RA, Dowell T, Araneo BA, et al. Platelet-derived growth factor is apotent biologic response modifier of T cells. J Exp Med,1991,174∶1323-1333.
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3 LeRoy EC. The control of fibrosis in systemic sclerosis: a strategy involving extracelluler matrix, cytokines, and growth factors. J Dermatol, 1994,21∶1-4.
4 Krane JF, Murphy DP, Gottlieb AB, et al. Increased dermal expression of platelet-derived growth factor receptors in growth-activited skin wounds and psoriasis. J Invest Dermatol, 1991,96∶983-986.
5 Klareskog L, Gustafsson R, Scheynius A, et al. Increased expression of platelet- derived growth factor type B receptors in the skin of patients with systemic sclerosis. Arthritis Rheum, 1990,33∶1534-1541.
, http://www.100md.com
6 Pandofi A, Florita M, Altomare G, et al. Increased plasma levels of platelet-derived growth factor activity in patients with progressive systemic sclerosis. Proc Soc Exp Biol Med, 1989,191∶1-4.
7 Gay S, Jones RE, Huang GQ, et al. Immunohistologic demonstration of platelet-derived growth factor(PDGF) and cis-oncogene expression in scleroderma. J InvestDermatol, 1989,92∶301-304.
(收稿：1997-04-21 修回：1997-09-04), http://www.100md.com