黄芩甙对白三烯B4引起的银屑病患者中性粒细胞趋化反应的影响
作者：秦小卫 郑茂荣 牟贤龙 孙君红
单位：510515 广州，第一军医大学附属南方医院(秦小卫)；第二军医大学附属长海医院(郑茂荣 牟贤龙 孙君红)
关键词：
中华皮肤科杂志980230.htm
中草药黄芩为清热燥湿药，其主要成分为黄芩甙。现代研究表明：黄芩甙有广谱抗菌、抗炎与抗变态反应作用。我们应用琼脂糖玻片法证实：黄芩甙对白三烯B4(LTB4)引起的银屑病患者中性粒细胞(PMN)趋化反应有抑制作用，从而为黄芩甙治疗银屑病提供了理论依据。
一、材料和方法
(一)病例：寻常型银屑病患者20例，男11例，女9例；年龄17～55岁，平均33岁；总病期7天至15年，平均5年。现病期(复发或新发疹时间)7天至3个月。健康对照组20例，男10例，女10例；年龄20～45岁，平均30岁。所有受试对象在实验前2周内未用任何其它药物。
, http://www.100md.com
(二)主要试剂及设备：人淋巴细胞分离液(LSM)：上海试剂二厂。Dextran T500：瑞士Pharmacia公司产品。琼脂糖(agarose)：日本进口，上海化学试剂采购供应站分装厂。DMEM培养基：法国Life Technologies公司产品。LTB4标准品(5ng/ml)：美国Sigma公司产品。血小板活化因子(PAF)标准品(10-7mol/L)：法
表1 不同浓度黄芩甙对LTB4引起的PMN趋化反应(抑制率%)的影响(
±s) 组 别
例数
黄 芩 甙 浓 度
5μg/ml
, 百拇医药 10μg/ml
15μg/ml
20μg/ml
银屑病组
20
26.8±1.429
44.3±1.412
64.6±1.540
77.9±1.624
健康对照组
20
25.6±1.455
, 百拇医药
45.0±1.420
63.8±1.524
78.0±1.690
t值
-
0.8999
0.4317
0.7866
0.7240
P值
-
>0.05
>0.05
, 百拇医药
>0.05
>0.05
注：孵育时间为2小时表2 黄芩甙对不同趋化因子引起的PMN趋化反应(抑制率%)的影响(±s) 趋化因子
黄 芩 甙 浓 度
5μg/ml
10μg/ml
15μg/ml
20μg/ml
LTB4
26.8±1.429
, 百拇医药
44.3±1.412
64.9±1.545
77.9±1.624
PAF
2.58±0.02
2.56±0.05
2.56±0.05
2.57±0.03
t值
82.794
68.637
78.560
, 百拇医药
84.284
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
注：孵育时间为2小时表3 不同孵育时间黄芩甙对LTB4引起的PMN趋化反应(抑制率%)的影响(±s) 组 别
例数
孵 育 时 间
30分钟
, http://www.100md.com
1小时
2小时
18小时
银屑病组
20
15.3±1.365
28.3±1.380
44.3±1.402
62.5±1.526
健康对照组
20
14.6±1.347
, http://www.100md.com
26.9±1.365
45.0±1.420
62.6±1.580
t值
-
0.6240
0.8264
0.4317
0.7625
P值
-
>0.05
>0.05
, 百拇医药
>0.05
>0.05
注：黄芩甙浓度为20μg/ml国巴黎大学Benvenist教授赠送。黄芩甙粉剂：第二军医大学植化教研室廖时萱教授制备及赠送。不锈钢打孔器：自制，孔径为2.4mm。
(三)方法：
1.PMN的分离与制备：分离后制成的细胞悬液，计数为2.5×105细胞/ml。
2.琼脂糖凝胶板的制备：将琼脂糖液均匀平铺于76mm×26mm的灭菌载玻片上，水平放置，用孔径为2.4mm不锈钢打孔器，打孔6列，每列为一组，每组又分为外、中、内3孔。
3.PMN移行的测定方法：①实验组4列的中孔中分别向每毫升白细胞悬浮液中添加5μg、10μg、15μg、20μg黄芩甙，对照组2列的中孔中为不加任何药物的白细胞悬浮液。②6列的外孔中均加LTB4或PAF溶液作为趋化因子，内孔均加DMEM培养液作为对照。③将加入上述药物的玻片放入37℃孵箱中分别培养0.5小时、1小时、2小时、18小时。④取出玻片，待孔中液体干燥后，先后在玻片上加纯甲醇和37%缓冲福尔马林液各3ml，30分钟以中断细胞移行，完整地去除琼脂糖胶，待玻片细胞干燥后，用wright染色在显微镜下用显微测微尺测量玻片上PMN趋化移行和随机移行的距离。⑤依下式计算趋化移行和随机移行的抑制率：
, http://www.100md.com
抑制率=(实验组距离-对照组距离)/(对照组距离)×100%
4.统计学方法：采用两样本均数的t检验。
二、结果
不同浓度的黄芩甙分别与PMN孵育2小时，能明显抑制LTB4对PMN的趋化反应，与黄芩甙的浓度呈剂量依赖关系(表1)。黄芩甙对DAF引起的PMN趋化反应则无明显影响(表2)。
黄芩甙(20μg/ml)分别与PMN孵育30分钟、1小时、2小时、18小时后对LTB4引起的PMN趋化反应的抑制作用逐渐增加，24小时后抑制作用不再增加(表3)。
黄芩甙对银屑病组及正常人对照组PMN对LTB4的趋化反应的影响无显著性差异(表1、3)。实验也证实了银屑病患者及正常人PMN对LTB4的趋化反应无显著性差异。单纯PMN悬浮液孵育不同时间对PMN趋化反应无影响；黄芩甙对PMN的随机移行无明显抑制作用。
, 百拇医药
黄芩甙对银屑病患者不同病期及不同皮损面积时PMN对LTB4的趋化反应的影响无显著性差异。
三、讨论
研究发现：LTB4是一种强有力的趋化因子[1]，银屑病患者皮损内LTB4的含量明显高于正常人[2]，因此推测：银屑病患者皮损内异常增高的LTB4吸引真皮血管内的PMN聚集、趋化，致银屑病皮损表皮内形成微脓肿等典型的银屑病病理改变。Kreisle等发现：LTB4是通过与PMN膜表面的LTB4受体结合而发挥作用的[3，4]。鉴于以上分析，我们推测：如果某种药物能够抑制LTB4引起的PMN趋化反应，可望治疗银屑病。
我们应用琼脂糖玻片法证实黄芩甙能够抑制LTB4引起的PMN趋化反应，因此推测黄芩甙是通过阻断LTB4与PMN膜特异性受体结合而发挥其拮抗作用的。本实验结果表明黄芩甙对LTB4引起的银屑病患者及正常人PMN趋化反应的抑制作用无显著性差异。有资料表明：银屑病患者PMN与正常人PMN差别在于两者活化程度不同，而不同活化程度的PMN膜LTB4受体与LTB4结合能力相差不明显[5]。因此推测银屑病患者与正常人PMN膜LTB4受体与黄芩甙结合能力相差不明显。实验表明黄芩甙对LTB4引起的银屑病患者静止期或进展期PMN趋化反应的抑制作用无显著性差异，对不同皮损面积的PMN趋化反应的抑制作用也无显著性差异。临床实践证实黄芩甙对病期不同、皮损面积不同的银屑病患者均有较好的疗效。另外，实验表明：黄芩甙对其它趋化因子如PAF引起的PMN趋化反应无明显抑制作用，说明了黄芩甙对PMN趋化反应的抑制作用是特异的，即只抑制LTB4引起的PMN趋化反应，进一步说明了黄芩甙可能是作为LTB4受体拮抗剂发挥作用的。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Bray MA. The pharmacology and pathophysiology of LTB4. Br Med Bucl, 1988,39∶249-254.
2 Fogh K, Herlin T, Kragballe K. Eicosanoids in acute and chronic psoriasis lesions: leukotriene B4, but not 12-hydroxy-eicosatetraenoic acid, is present in biologically active amounts in acute guttate lesions. J Invest Dermatol, 1989,92∶837-841.
3 Kreisle R, Parker CW. Specific binding of LTB4 to a receptor on human polymorphonuclear leukocyte. J Exp Med, 1983,157∶622-641.
4 Lin A, Patrilia L, et al. LTB4 binding to human neutrophils. Prostaglandins, 1984,28∶837-849.
5 Khler S, Christophers E, Schrder JM. Plasma lactoferrin reflects neutrophil activation in psoriasis. Br J Dermatol, 1988,119∶289-293.
(收稿：1997-04-29 修回：1997-08-01), 百拇医药
单位：510515 广州，第一军医大学附属南方医院(秦小卫)；第二军医大学附属长海医院(郑茂荣 牟贤龙 孙君红)
关键词：
中华皮肤科杂志980230.htm
中草药黄芩为清热燥湿药，其主要成分为黄芩甙。现代研究表明：黄芩甙有广谱抗菌、抗炎与抗变态反应作用。我们应用琼脂糖玻片法证实：黄芩甙对白三烯B4(LTB4)引起的银屑病患者中性粒细胞(PMN)趋化反应有抑制作用，从而为黄芩甙治疗银屑病提供了理论依据。
一、材料和方法
(一)病例：寻常型银屑病患者20例，男11例，女9例；年龄17～55岁，平均33岁；总病期7天至15年，平均5年。现病期(复发或新发疹时间)7天至3个月。健康对照组20例，男10例，女10例；年龄20～45岁，平均30岁。所有受试对象在实验前2周内未用任何其它药物。
, http://www.100md.com
(二)主要试剂及设备：人淋巴细胞分离液(LSM)：上海试剂二厂。Dextran T500：瑞士Pharmacia公司产品。琼脂糖(agarose)：日本进口，上海化学试剂采购供应站分装厂。DMEM培养基：法国Life Technologies公司产品。LTB4标准品(5ng/ml)：美国Sigma公司产品。血小板活化因子(PAF)标准品(10-7mol/L)：法
表1 不同浓度黄芩甙对LTB4引起的PMN趋化反应(抑制率%)的影响(
±s) 组 别例数
黄 芩 甙 浓 度
5μg/ml
, 百拇医药 10μg/ml
15μg/ml
20μg/ml
银屑病组
20
26.8±1.429
44.3±1.412
64.6±1.540
77.9±1.624
健康对照组
20
25.6±1.455
, 百拇医药
45.0±1.420
63.8±1.524
78.0±1.690
t值
-
0.8999
0.4317
0.7866
0.7240
P值
-
>0.05
>0.05
, 百拇医药
>0.05
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注：孵育时间为2小时表2 黄芩甙对不同趋化因子引起的PMN趋化反应(抑制率%)的影响(
±s) 趋化因子黄 芩 甙 浓 度
5μg/ml
10μg/ml
15μg/ml
20μg/ml
LTB4
26.8±1.429
, 百拇医药
44.3±1.412
64.9±1.545
77.9±1.624
PAF
2.58±0.02
2.56±0.05
2.56±0.05
2.57±0.03
t值
82.794
68.637
78.560
, 百拇医药
84.284
P值
<0.01
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注：孵育时间为2小时表3 不同孵育时间黄芩甙对LTB4引起的PMN趋化反应(抑制率%)的影响(
±s) 组 别例数
孵 育 时 间
30分钟
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1小时
2小时
18小时
银屑病组
20
15.3±1.365
28.3±1.380
44.3±1.402
62.5±1.526
健康对照组
20
14.6±1.347
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26.9±1.365
45.0±1.420
62.6±1.580
t值
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0.4317
0.7625
P值
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>0.05
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注：黄芩甙浓度为20μg/ml国巴黎大学Benvenist教授赠送。黄芩甙粉剂：第二军医大学植化教研室廖时萱教授制备及赠送。不锈钢打孔器：自制，孔径为2.4mm。
(三)方法：
1.PMN的分离与制备：分离后制成的细胞悬液，计数为2.5×105细胞/ml。
2.琼脂糖凝胶板的制备：将琼脂糖液均匀平铺于76mm×26mm的灭菌载玻片上，水平放置，用孔径为2.4mm不锈钢打孔器，打孔6列，每列为一组，每组又分为外、中、内3孔。
3.PMN移行的测定方法：①实验组4列的中孔中分别向每毫升白细胞悬浮液中添加5μg、10μg、15μg、20μg黄芩甙，对照组2列的中孔中为不加任何药物的白细胞悬浮液。②6列的外孔中均加LTB4或PAF溶液作为趋化因子，内孔均加DMEM培养液作为对照。③将加入上述药物的玻片放入37℃孵箱中分别培养0.5小时、1小时、2小时、18小时。④取出玻片，待孔中液体干燥后，先后在玻片上加纯甲醇和37%缓冲福尔马林液各3ml，30分钟以中断细胞移行，完整地去除琼脂糖胶，待玻片细胞干燥后，用wright染色在显微镜下用显微测微尺测量玻片上PMN趋化移行和随机移行的距离。⑤依下式计算趋化移行和随机移行的抑制率：
, http://www.100md.com
抑制率=(实验组距离-对照组距离)/(对照组距离)×100%
4.统计学方法：采用两样本均数的t检验。
二、结果
不同浓度的黄芩甙分别与PMN孵育2小时，能明显抑制LTB4对PMN的趋化反应，与黄芩甙的浓度呈剂量依赖关系(表1)。黄芩甙对DAF引起的PMN趋化反应则无明显影响(表2)。
黄芩甙(20μg/ml)分别与PMN孵育30分钟、1小时、2小时、18小时后对LTB4引起的PMN趋化反应的抑制作用逐渐增加，24小时后抑制作用不再增加(表3)。
黄芩甙对银屑病组及正常人对照组PMN对LTB4的趋化反应的影响无显著性差异(表1、3)。实验也证实了银屑病患者及正常人PMN对LTB4的趋化反应无显著性差异。单纯PMN悬浮液孵育不同时间对PMN趋化反应无影响；黄芩甙对PMN的随机移行无明显抑制作用。
, 百拇医药
黄芩甙对银屑病患者不同病期及不同皮损面积时PMN对LTB4的趋化反应的影响无显著性差异。
三、讨论
研究发现：LTB4是一种强有力的趋化因子[1]，银屑病患者皮损内LTB4的含量明显高于正常人[2]，因此推测：银屑病患者皮损内异常增高的LTB4吸引真皮血管内的PMN聚集、趋化，致银屑病皮损表皮内形成微脓肿等典型的银屑病病理改变。Kreisle等发现：LTB4是通过与PMN膜表面的LTB4受体结合而发挥作用的[3，4]。鉴于以上分析，我们推测：如果某种药物能够抑制LTB4引起的PMN趋化反应，可望治疗银屑病。
我们应用琼脂糖玻片法证实黄芩甙能够抑制LTB4引起的PMN趋化反应，因此推测黄芩甙是通过阻断LTB4与PMN膜特异性受体结合而发挥其拮抗作用的。本实验结果表明黄芩甙对LTB4引起的银屑病患者及正常人PMN趋化反应的抑制作用无显著性差异。有资料表明：银屑病患者PMN与正常人PMN差别在于两者活化程度不同，而不同活化程度的PMN膜LTB4受体与LTB4结合能力相差不明显[5]。因此推测银屑病患者与正常人PMN膜LTB4受体与黄芩甙结合能力相差不明显。实验表明黄芩甙对LTB4引起的银屑病患者静止期或进展期PMN趋化反应的抑制作用无显著性差异，对不同皮损面积的PMN趋化反应的抑制作用也无显著性差异。临床实践证实黄芩甙对病期不同、皮损面积不同的银屑病患者均有较好的疗效。另外，实验表明：黄芩甙对其它趋化因子如PAF引起的PMN趋化反应无明显抑制作用，说明了黄芩甙对PMN趋化反应的抑制作用是特异的，即只抑制LTB4引起的PMN趋化反应，进一步说明了黄芩甙可能是作为LTB4受体拮抗剂发挥作用的。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Bray MA. The pharmacology and pathophysiology of LTB4. Br Med Bucl, 1988,39∶249-254.
2 Fogh K, Herlin T, Kragballe K. Eicosanoids in acute and chronic psoriasis lesions: leukotriene B4, but not 12-hydroxy-eicosatetraenoic acid, is present in biologically active amounts in acute guttate lesions. J Invest Dermatol, 1989,92∶837-841.
3 Kreisle R, Parker CW. Specific binding of LTB4 to a receptor on human polymorphonuclear leukocyte. J Exp Med, 1983,157∶622-641.
4 Lin A, Patrilia L, et al. LTB4 binding to human neutrophils. Prostaglandins, 1984,28∶837-849.
5 Khler S, Christophers E, Schrder JM. Plasma lactoferrin reflects neutrophil activation in psoriasis. Br J Dermatol, 1988,119∶289-293.
(收稿：1997-04-29 修回：1997-08-01), 百拇医药