银屑病皮损中细胞凋亡的原位标记检测与bcl-2的表达
作者：倪晓 孙建方 杨海平 曾学思 桑红桂 李阿梅 高新元 叶干运
单位：210042 南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：银屑病；细胞凋亡；bcl-2
中华皮肤科杂志980210.htm 【摘要】 目的 探讨细胞凋亡与银屑病发病的关系。方法 用末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)介导的d-UTP-生物素缺口末端标记技术(TUNEL)，原位检测了银屑病皮损的凋亡角朊细胞，应用免疫过氧化酶技术研究了正常人皮肤与银屑病皮损的p53蛋白、增殖细胞核抗原(PCNA)和bcl-2的表达。结果
银屑病表皮各层中，大量角朊细胞呈现出细胞凋亡的形态学和生化特征。基底层及表皮中下部各层大量角朊细胞PCNA染色强阳性，基底层中bcl-2阳性细胞明显减少。结论 在银屑病皮损中角朊细胞凋亡增加，推测可能是针对细胞过度增殖的一种稳态机理。
, 百拇医药
Detection of Apoptosis by in Situ Labeling and Study on the Expression of bcl-2 in Lesions of Patients with Psoriasis Ni Xiao, Sun Jianfang, Yang Haiping, et al. Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Nanjing 210042
【Abstract】 Objective To investigate the involvement of apoptosis in the lesions of patients with psoriasis. Methods The apoptosis was detected with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL), and the expression of p53, PCNA and apoptosis-suppressing protein bcl-2 was assessed with immunoperoxidase technique in psoriatic lesions and normal skin. Results A large number of keratinocytes showing biochemical and morphologic features of cells undergoing apoptosis were observed in all the suprabasal layers of the psoriatic epidermis. The plaques from all patients analysed showed marked increase in the number of PCNA positive cells in the middle and basal keratinocytes, and a dramatic reduction in the number of bcl-2 positive cells in the basal cell layer. Conclusion The increased apoptosis of keratinocytes in the lesions of psoriasis might be a homeostatic mechanism to the hyperplasia of cells.
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【Key words】 Psoriasis Apoptosis bcl-2
为了探讨银屑病的发病与细胞凋亡的关系，我们采用末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)介导的d-UTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)技术，分析了银屑病角朊细胞的凋亡情况，并与常规HE染色进行了对比研究，同时检测了银屑病皮损中p53蛋白、增殖细胞核抗原(PCNA)及凋亡抑制蛋白bcl-2的表达。
资料和方法
(一)病例：共18例患者，其中14例寻常型患者，男8例，女6例，均为静止期斑块型，2个月内未接受系统及局部治疗；4例红皮病型银屑病，男女各2例。患者年龄15～50岁(平均33.7岁)；病程1个月至30年(平均6.2年)；PASI评分5.8～60.0(平均30.4分)。对照标本10份，均为外科手术正常皮肤。
(二)实验方法：皮损边缘钻孔取材，10%中性福尔
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马林液固定，石蜡包埋，5μm连续切片，2张行常规HE染色，2张行TUNEL法染色、2张供免疫组化研究。TUNEL法的主要步骤如下：切片常规脱蜡水化；20μg/ml蛋白酶K消化15分钟；0.3% H2O2室温处理20分钟；标记缓冲液(含0.03U/μl TdT和0.04nmol/μl生物素-11-dUTP)湿盒中37℃孵育60分钟；1∶50稀释的亲和素-辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)37℃孵育30分钟；新鲜配置的0.03% H2O2-0.05mg/ml DAB显色液显色10分钟，苏木素复染；封片镜检[1，2]。
免疫组化研究采用标准的ABC过氧化物技术，所用一抗包括p53(Do-7)、PCNA(PC10)和bcl-2(124)单克隆抗体，均为Dako公司产品，抗体稀释度分别为1∶100、1∶100和1∶50，采用Vectastain ABC试验盒进行检测。除PCNA外，染色前标本均行微波抗原修复。
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结 果
(一)HE染色：HE染色切片中的凋亡细胞标准参照Kerr等[3]提出的3个条件：①核染色质沿核膜浓缩呈环状或新月状和(或)核片段化；②细胞皱缩；③胞浆嗜酸性变，具备以上二条者即认定为凋亡细胞。本次观察发现，寻常型14例中有6例(6/14，占42.9%)、红皮病型4例中4例HE染色切片中可见表皮基底层上各层散在分布凋亡细胞，以红皮病型更典型和多见，正常人皮肤中未见或偶见阳性细胞。
(二)TUNEL法：细胞核中有棕黄色颗粒者即为凋亡细胞。8例寻常型(占57.1%)和4例红皮病型银屑病的表皮基底上各层可见较多散在分布阳性细胞，棘层上层及颗粒层阳性细胞密集。红皮病型切片中更典型和多见。正常人皮肤中未见或偶见阳性细胞。
(三)凋亡指数(apoptosis index, AI)的计算：每张阳性切片选取5个阳性细胞最多的高倍视野(×400)，计算500个角朊细胞中阳性细胞所占的百分比。结果发现，寻常型银屑病皮损TUNEL染色的AI[24(18～30)]高于HE染色[14(8～19)]，红皮病型TUNEL染色的AI[49(37～61)]也高于HE染色[38(24～54)]，红皮病型的AI明显高于寻常型。
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(四)免疫组化结果：将染色强度分为阴性(-)、弱(+)、中()和强()四级，将染色频度按阳性细胞的百分比(计算方法同AI的计算)分为四级：阴性(<1%)、低表达(1%～10%)、中表达(10%～50%)和高表达(≥50%)。结果：①bcl-2阳性反应定位于胞浆，正常皮肤表皮基底细胞呈中高表达、中强阳性反应，18例银屑病皮肤中bcl-2的表达均明显减少，仅基底层少数树状突细胞呈弱阳性反应；②p53阳性反应定位于细胞核，所有银屑病标本中不见或偶见基底上层少数角朊细胞呈弱阳性反应；③PCNA阳性反应定位于细胞核，银屑病表皮中PCNA均呈中高表达，平均表达率达52.3%，染色强度以中强为主，阳性细胞分布在基底层及棘层中下部。正常对照表皮呈PCNA低表达，平均表达率6.5%，染色强度以弱、中居多，偶见强阳性反应，阳性细胞集中在基底细胞层中。
讨 论
细胞凋亡开始时，细胞内核酸内切酶被激活，并在核小体间切割DNA链，使DNA降解为以核小体(180～200bp)为单位的片段，也产生了与DNA片段数目相同的3′羟基末端，TUNEL技术正是基于对细胞凋亡分子机理的充分认识，用TdT将生物素化的dUTP标记至3′羟基末端。该方法结合了组织化学的方法，定位准确，可发现早中期凋亡细胞。本实验发现，镜下有的细胞核质聚集于核膜下，提示早期的染色质浓缩；一些细胞核内染色质均匀一致，表明DNA片段化分布于整个细胞核，凋亡已进一步发展。因此，与HE染色的形态学标准相比较，TUNEL法可发现更多的凋亡细胞，AI也相对增高，可更准确地反应凋亡发生的程度。
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bcl-2是一种凋亡抑制基因，其编码的蛋白能抑制细胞发生凋亡，延长细胞的存活时间。我们的实验表明，在银屑病皮损中，bcl-2在基底细胞中的表达较正常人明显下降，这与Bianchi等的观察一致[4]。这一结果提示，银屑病角朊细胞凋亡的增加起源于基底细胞，推测由于基底细胞中bcl-2的表达下降，使原先处于G0期的基底细胞提前进入细胞增殖周期，这些细胞在树状突细胞和免疫细胞产生的各种因子作用下发生凋亡[4，5]。
我们还观察到，同一皮损中既有PCNA阳性细胞的增加，又有大量凋亡细胞的存在；PCNA阳性细胞以表皮中下层多，凋亡细胞则分布于表皮中上层，进一步证明角朊细胞的过度增殖与凋亡增加同时伴随着银屑病的发病，因果关系还不十分清楚，推测凋亡增加是针对过度增殖而发生，是机体维持细胞动力学稳态的一种保护机理。我们的实验还表明，具凋亡促进作用的野生型p53在银屑病皮损中的表达并无增加，提示野生型p53在银屑病的发病中可能未起重要作用。我们的初步观察还表明，红皮病型银屑病皮损中角朊细胞凋亡较寻常型中更常见，是否细胞凋亡在该型的发病中起着更为重要的作用，因观察病例太少，还不足以下此结论，有待进一步研究。
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参 考 文 献
1 Gold R, Schmied M, Rothe G, et al. Detection of DNA fragmentation in apoptosis: application of in situ nick translation to cell culture systems and tissue sections. J Histochem Cytochem, 1993,41∶1023-1030.
2 Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA, et al. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992,119∶493-501.
3 Kerr JFR, Winterford CM, Harman BV. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 1994,73∶2013-2026.
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4 Bianchi L, Farrace MG, Nili G, et al. Abnormal bcl-2 and “tissue” transglutaminase expression in psoriatic skin. J Invest Dermatol, 1994,103∶829-833.
5 Mountz JD, Wu J, Chen J, et al. Autoimmune disease-A problem of detective apoptosis. Arthritis Rheumat, 1994,37∶1415-1420.
(收稿：1997-09-05 修回：1997-12-23), http://www.100md.com
单位：210042 南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：银屑病；细胞凋亡；bcl-2
中华皮肤科杂志980210.htm 【摘要】 目的 探讨细胞凋亡与银屑病发病的关系。方法 用末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)介导的d-UTP-生物素缺口末端标记技术(TUNEL)，原位检测了银屑病皮损的凋亡角朊细胞，应用免疫过氧化酶技术研究了正常人皮肤与银屑病皮损的p53蛋白、增殖细胞核抗原(PCNA)和bcl-2的表达。结果
银屑病表皮各层中，大量角朊细胞呈现出细胞凋亡的形态学和生化特征。基底层及表皮中下部各层大量角朊细胞PCNA染色强阳性，基底层中bcl-2阳性细胞明显减少。结论 在银屑病皮损中角朊细胞凋亡增加，推测可能是针对细胞过度增殖的一种稳态机理。
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Detection of Apoptosis by in Situ Labeling and Study on the Expression of bcl-2 in Lesions of Patients with Psoriasis Ni Xiao, Sun Jianfang, Yang Haiping, et al. Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Nanjing 210042
【Abstract】 Objective To investigate the involvement of apoptosis in the lesions of patients with psoriasis. Methods The apoptosis was detected with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL), and the expression of p53, PCNA and apoptosis-suppressing protein bcl-2 was assessed with immunoperoxidase technique in psoriatic lesions and normal skin. Results A large number of keratinocytes showing biochemical and morphologic features of cells undergoing apoptosis were observed in all the suprabasal layers of the psoriatic epidermis. The plaques from all patients analysed showed marked increase in the number of PCNA positive cells in the middle and basal keratinocytes, and a dramatic reduction in the number of bcl-2 positive cells in the basal cell layer. Conclusion The increased apoptosis of keratinocytes in the lesions of psoriasis might be a homeostatic mechanism to the hyperplasia of cells.
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【Key words】 Psoriasis Apoptosis bcl-2
为了探讨银屑病的发病与细胞凋亡的关系，我们采用末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)介导的d-UTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)技术，分析了银屑病角朊细胞的凋亡情况，并与常规HE染色进行了对比研究，同时检测了银屑病皮损中p53蛋白、增殖细胞核抗原(PCNA)及凋亡抑制蛋白bcl-2的表达。
资料和方法
(一)病例：共18例患者，其中14例寻常型患者，男8例，女6例，均为静止期斑块型，2个月内未接受系统及局部治疗；4例红皮病型银屑病，男女各2例。患者年龄15～50岁(平均33.7岁)；病程1个月至30年(平均6.2年)；PASI评分5.8～60.0(平均30.4分)。对照标本10份，均为外科手术正常皮肤。
(二)实验方法：皮损边缘钻孔取材，10%中性福尔
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马林液固定，石蜡包埋，5μm连续切片，2张行常规HE染色，2张行TUNEL法染色、2张供免疫组化研究。TUNEL法的主要步骤如下：切片常规脱蜡水化；20μg/ml蛋白酶K消化15分钟；0.3% H2O2室温处理20分钟；标记缓冲液(含0.03U/μl TdT和0.04nmol/μl生物素-11-dUTP)湿盒中37℃孵育60分钟；1∶50稀释的亲和素-辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)37℃孵育30分钟；新鲜配置的0.03% H2O2-0.05mg/ml DAB显色液显色10分钟，苏木素复染；封片镜检[1，2]。
免疫组化研究采用标准的ABC过氧化物技术，所用一抗包括p53(Do-7)、PCNA(PC10)和bcl-2(124)单克隆抗体，均为Dako公司产品，抗体稀释度分别为1∶100、1∶100和1∶50，采用Vectastain ABC试验盒进行检测。除PCNA外，染色前标本均行微波抗原修复。
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结 果
(一)HE染色：HE染色切片中的凋亡细胞标准参照Kerr等[3]提出的3个条件：①核染色质沿核膜浓缩呈环状或新月状和(或)核片段化；②细胞皱缩；③胞浆嗜酸性变，具备以上二条者即认定为凋亡细胞。本次观察发现，寻常型14例中有6例(6/14，占42.9%)、红皮病型4例中4例HE染色切片中可见表皮基底层上各层散在分布凋亡细胞，以红皮病型更典型和多见，正常人皮肤中未见或偶见阳性细胞。
(二)TUNEL法：细胞核中有棕黄色颗粒者即为凋亡细胞。8例寻常型(占57.1%)和4例红皮病型银屑病的表皮基底上各层可见较多散在分布阳性细胞，棘层上层及颗粒层阳性细胞密集。红皮病型切片中更典型和多见。正常人皮肤中未见或偶见阳性细胞。
(三)凋亡指数(apoptosis index, AI)的计算：每张阳性切片选取5个阳性细胞最多的高倍视野(×400)，计算500个角朊细胞中阳性细胞所占的百分比。结果发现，寻常型银屑病皮损TUNEL染色的AI[24(18～30)]高于HE染色[14(8～19)]，红皮病型TUNEL染色的AI[49(37～61)]也高于HE染色[38(24～54)]，红皮病型的AI明显高于寻常型。
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(四)免疫组化结果：将染色强度分为阴性(-)、弱(+)、中()和强()四级，将染色频度按阳性细胞的百分比(计算方法同AI的计算)分为四级：阴性(<1%)、低表达(1%～10%)、中表达(10%～50%)和高表达(≥50%)。结果：①bcl-2阳性反应定位于胞浆，正常皮肤表皮基底细胞呈中高表达、中强阳性反应，18例银屑病皮肤中bcl-2的表达均明显减少，仅基底层少数树状突细胞呈弱阳性反应；②p53阳性反应定位于细胞核，所有银屑病标本中不见或偶见基底上层少数角朊细胞呈弱阳性反应；③PCNA阳性反应定位于细胞核，银屑病表皮中PCNA均呈中高表达，平均表达率达52.3%，染色强度以中强为主，阳性细胞分布在基底层及棘层中下部。正常对照表皮呈PCNA低表达，平均表达率6.5%，染色强度以弱、中居多，偶见强阳性反应，阳性细胞集中在基底细胞层中。
讨 论
细胞凋亡开始时，细胞内核酸内切酶被激活，并在核小体间切割DNA链，使DNA降解为以核小体(180～200bp)为单位的片段，也产生了与DNA片段数目相同的3′羟基末端，TUNEL技术正是基于对细胞凋亡分子机理的充分认识，用TdT将生物素化的dUTP标记至3′羟基末端。该方法结合了组织化学的方法，定位准确，可发现早中期凋亡细胞。本实验发现，镜下有的细胞核质聚集于核膜下，提示早期的染色质浓缩；一些细胞核内染色质均匀一致，表明DNA片段化分布于整个细胞核，凋亡已进一步发展。因此，与HE染色的形态学标准相比较，TUNEL法可发现更多的凋亡细胞，AI也相对增高，可更准确地反应凋亡发生的程度。
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bcl-2是一种凋亡抑制基因，其编码的蛋白能抑制细胞发生凋亡，延长细胞的存活时间。我们的实验表明，在银屑病皮损中，bcl-2在基底细胞中的表达较正常人明显下降，这与Bianchi等的观察一致[4]。这一结果提示，银屑病角朊细胞凋亡的增加起源于基底细胞，推测由于基底细胞中bcl-2的表达下降，使原先处于G0期的基底细胞提前进入细胞增殖周期，这些细胞在树状突细胞和免疫细胞产生的各种因子作用下发生凋亡[4，5]。
我们还观察到，同一皮损中既有PCNA阳性细胞的增加，又有大量凋亡细胞的存在；PCNA阳性细胞以表皮中下层多，凋亡细胞则分布于表皮中上层，进一步证明角朊细胞的过度增殖与凋亡增加同时伴随着银屑病的发病，因果关系还不十分清楚，推测凋亡增加是针对过度增殖而发生，是机体维持细胞动力学稳态的一种保护机理。我们的实验还表明，具凋亡促进作用的野生型p53在银屑病皮损中的表达并无增加，提示野生型p53在银屑病的发病中可能未起重要作用。我们的初步观察还表明，红皮病型银屑病皮损中角朊细胞凋亡较寻常型中更常见，是否细胞凋亡在该型的发病中起着更为重要的作用，因观察病例太少，还不足以下此结论，有待进一步研究。
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参 考 文 献
1 Gold R, Schmied M, Rothe G, et al. Detection of DNA fragmentation in apoptosis: application of in situ nick translation to cell culture systems and tissue sections. J Histochem Cytochem, 1993,41∶1023-1030.
2 Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA, et al. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992,119∶493-501.
3 Kerr JFR, Winterford CM, Harman BV. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 1994,73∶2013-2026.
, 百拇医药
4 Bianchi L, Farrace MG, Nili G, et al. Abnormal bcl-2 and “tissue” transglutaminase expression in psoriatic skin. J Invest Dermatol, 1994,103∶829-833.
5 Mountz JD, Wu J, Chen J, et al. Autoimmune disease-A problem of detective apoptosis. Arthritis Rheumat, 1994,37∶1415-1420.
(收稿：1997-09-05 修回：1997-12-23), http://www.100md.com