流式细胞分析梅毒患者外周血T淋巴细胞的免疫表型
作者：钱黎华 王侠生 杨蜀嵋 徐金华 闫永宁 徐明
单位：200040 上海医科大学华山医院皮肤科
关键词：梅毒；淋巴细胞免疫表型；流式细胞计数
中国皮肤科杂志980314 【摘要】 目的 研究人类对梅毒螺旋体的细胞免疫反应特征，分析进入血液后的梅毒螺旋体对机体外周血中各淋巴细胞亚群及自然杀伤细胞(NK) 的影响情况。方法 通过流式细胞仪，运用标有异硫氰酸荧光素( FITC)或藻红素(PE)的CD单抗，分析了24例未经驱梅治疗过的早期梅毒患者(含泛发型皮疹、 掌跖型皮疹及无皮疹型各8例)外周血中各T淋巴细胞免疫表型的特点。结果 24例梅毒患者的外周血中总T、TH、NK细胞及TH/Ts的比值均明显低于正常人对照组(P<0.01)，而Ts的比例则显著高于正常人对照组(P<0.01)；另外皮疹呈泛发型、掌跖型、无皮疹型三组患者在上述免疫表型的比例方面 相互比较，无统计学差异(P0.05)。结论 未经驱梅治疗过的早期梅毒患者存在着明显的细胞免疫抑制，其中皮疹呈泛发型、掌跖型、无皮疹型三者基本上反映了进入血液后的梅毒螺旋体在不同皮肤屏障功能下的表现形式，而与机体外周血中T淋巴细胞亚群的变化之间无明显的相关关系。
, 百拇医药
Analysis of Peripheral Blood Lymphocyte Immunophenotypes in Syph ilitic Pat ients with Flow Cytometry Qian Lihua,Wang Xiasheng,Yang Shumei,et al. Departme nt of Dermatology,Huashan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200040
【Abstract】 Objective To characterize the human cell-mediated immune response to Treponema pallidum(TP), and to determine the effect of TP in fection on the vari ous lymphocyte subpopulations and natural killer cells in the peripheral blood o f the patients. Methods Twenty-four untreated patients with ea rly syphilis were analyzed,including 3 groups of 8 patients with disseminated syphilides,palmoplantar syphilides and latent syphilis each. Monoclonal antibodies of CD labeled with either fluor escein isothiocyanate or phycoerythrin were used on a flow cytometry to detect t he chan ging of pe ripheral blood lymphocyte immunophenotypes. Results The results showed that the percentages of panT,TH,NK cells and the ratio of TH/TS were significant ly lower (P <0.01) and those of TS cells were significantly higher (P[ WTBZ <0.01) than those of normal controls. No statistical difference of t he immunophenotype distribution was found among groups of disseminated lesions, palmoplantar syphilides, and latent syphilis (P0.05). Conclusion It suggests that there is prominent suppression of c ellular immunity in the untreated patients suf fering from early syphilis. Meanwhile, the difference of 3 groups in skin lesion s was due to the different dermatobarrier function against the systemic invasio n o f TP, rather than attributed to the alteration of the lymphocyte immunophenotyp es in the peripheral blood.
, 百拇医药
【Key words】 Syphilis Lymphocyte immunophenotype Flow cy tometry
人T淋巴细胞对梅毒螺旋体(TP)的免疫反应极为重要 [1，2]，但是进入血液后的TP是如何影响机体外周血淋巴细胞亚群及自然杀伤细胞(NK)尚不清楚；临床上所见到的泛发型、掌跖型、无皮疹型的早期梅毒，它们在细胞免疫方面是否存在差异，更鲜为人知。我们运用流式细胞计数方法来分析梅毒患者外周血淋巴细胞亚群及NK的特点，评价进入血液后的TP对其影响的情况，从而探讨人对TP的细胞免疫反应特征，并进一步揭示上述三型早期梅毒与机体淋巴细胞亚群及NK变化之间的关系。
病例和方法
(一)病例：共收集24例未经驱梅治疗过的早期梅毒患者，均来自我院性病门诊，其中男13例，女11例；年龄20～46岁。临床上有皮疹者16例(含泛发型、掌跖型皮疹各8例)，无皮疹的潜伏梅毒8例。实验室检查示血清RPR及TPHA试验均阳性，而HIV初筛试验均阴性。另外以70例健康志愿者为对照组。
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(二)流式细胞仪：采用型号为FACStarPLUS的流式细胞仪(美国Becton Dickinson, BD公司)；其激光工作条件为采用Innova90-5氩离子激光器，功率为200mW，波长为488nm。
(三)试剂：单克隆抗体：Anti-Leu3(CD3)FITC、Anti-Leu4(CD4)FITC、Anti-Leu2a( CD8)PE及Anti-Leu11/19(CD16, 56)PE(美国BD公司产品)，CD3+、CD4+、CD8+、CD1 6,56+分别代表总T、TH、Ts、NK细胞。红细胞溶解液：由KHCO31.0g、NH4Cl8 .3g、EDTA-Na237mg；H2O 1000mg组成(自行配制)。
(四)血液标本：抽取用肝素抗凝的患者外周静脉血2ml；免疫样品制备前在4℃下保存。
, 百拇医药
(五)样品制备：在上述抗凝全血中加入上述单抗各20μl，混合，在4℃下旋转45分钟 ；加入2ml红细胞溶解液放置片刻，破红细胞；离心1500r/min 5分钟，弃上清液；用PBS洗 涤细胞2～3次，再悬浮于0.3ml PBS中，上机。从采标本到上机在12小时内完成。
(六)数据处理：用美国BD公司Lysis软件，运用t检验及方差分析来对数据 进行统计学处理。
结 果
(一)24例梅毒患者的外周血中总T淋巴细胞、TH、NK、TH/Ts的比例 明显低于正常人对照组，并且通过t检验后示差异具有显著性(P<0.01)。 而Ts则显著高于正常人对照组(P<0.01)，详见表1。
(二)12例有皮疹的梅毒患者与8例无皮疹的潜伏梅毒患者在总T、TH、Ts、NK、TH/Ts 的比例方面，经t检验，差异无显著性(P0.05)；而且通过对皮疹呈泛发 型及掌跖型的患者在总T、TH、Ts、NK、TH/Ts的比例方面的相互比较并经方差分析后 ，差异亦无显著性(P0.05)，详见表2。
, 百拇医药
表1 梅毒患者外周 血各淋巴细胞免疫表型的均数范围(
±s，%) 组 别
例数
总T( CD 3+)
TH(CD4+)
Ts(CD8+)
NK(CD16,56+)
TH/Ts(CD4+/ CD8+)
正常人对照组
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70
68.38±7.17
42.66±5.46
24.15±5.05
19.73±6.45
1.75±0.50
梅毒患者
24
62.91±11.39
32.05±5.52
32.15±8.16
14 .38±6.62
, 百拇医药
1.05±0.28
t值
-
2.74
8.19
5.65
3.48
6.50
P值
-
<0.01
<0.01
<0.01
, 百拇医药
<0.01
<0.01
表2 皮疹分布不同 的梅毒患者淋巴细胞免疫表型的均数范围(±s，%) 组别
例数
总T(CD 3+)
TH(CD4+)
Ts(CD8+)
NK(CD16+,56+)
TH/Ts(CD4 +/CD8+)
, http://www.100md.com
有皮疹型
16
63.49±10.44
32.18±5.15
32.97±8.65
13 .55±6.10
1.04±0.30
泛发型
8
66.32±11.42
31.95±5.87
37.00±10.04
, 百拇医药
13 .24±7.68
0.92±0.31
掌跖型
8
60.66±9.20
32.41±4.73
28.95±4.75
13.86 ±4.54
1.15±0.27
t值*
-
1.09
, http://www.100md.com
0.17
2.05
0.13
1.58
P值
-
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
无皮疹型
8
, 百拇医药
61.75±13.81
31.79±6.56
30.50±7.34
1 6.03±7.71
1.07±0.23
t值
-
0.34
0.16
0.69
0.86
0.25
, http://www.100md.com
P值
-
.>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
*指掌跖型与泛发型患者的比较，**指有皮疹与无皮疹患者的比较讨 论
我们发现本组16例Ⅱ期梅毒患者及8例早 期潜伏梅毒患者，其外周血中总的T淋巴细胞比例及TH比例明显低于正常人对照组(P<0.01)，这与Pope等[3]报道的结论一致。显然血液中缺乏了致敏的T淋巴细胞，就不能形成由TH细胞介导的对TP抗原的迟发性变态反应，从而造成二期梅毒与潜伏梅毒的持续存在。 另一方面不容忽视的是，本组24例梅毒患者外周血中Ts的比例明显升高，以致于TH/Ts 的比值显著低于正常人对照组(P<0.01)，说明Ts细胞的异常增殖不仅拮 抗了TH细胞介导的对TP抗原的迟发性变态反应，而且也抑制了TP制动抗体的形成，造成T P的繁殖与扩散。同时本组患者中其外周血中的NK细胞在数量上亦明显减少(P<0.01)。这无疑也促进了TP在血液中的繁殖。另外通过对有皮疹的(泛发型、掌跖型)与无皮疹的两组患者外周血中总T、TH、Ts、NK、 TH/Ts的比例方面的相互比较，发现差异亦无显著性(P0.05)。总之，未经驱梅治疗过的早期梅毒患者，存在着明显的细胞免疫抑制，尽管 局部的免疫功能已能控制硬下疳，但宿主仍不能根除全身的TP感染，以致TP在体内持续存在 而造成疾病的活动性与宿主的传染性。
, 百拇医药
志谢 中国科学院上海细胞生物研究所吴直江、高奇蓉老师
参考文献
1 Baker-Zander SA, Fohn MJ, Lukehart SA. Development of c ellular immunity to individual soluble antigens of Treponema pallidum [ WTBZ during experimental syphilis. J Immunol, 1988,141∶4363-4369.
2 Ware JL, Fold JD, Baseman JB. Modulation of normal lymphocyte stimulati on by se rum from Treponema pallidum-infected rabbits. Cell Immunol, 1980,53∶29-38.
3 Pope V, Sandre AL, Larsen SA, et al. Flow cytometric of peripheral bloo d lympho cyte immunophenotypes in persons infected with Treponema pallidum. Clin Diagn La b Immunol, 1994,1∶121-124., http://www.100md.com
单位：200040 上海医科大学华山医院皮肤科
关键词：梅毒；淋巴细胞免疫表型；流式细胞计数
中国皮肤科杂志980314 【摘要】 目的 研究人类对梅毒螺旋体的细胞免疫反应特征，分析进入血液后的梅毒螺旋体对机体外周血中各淋巴细胞亚群及自然杀伤细胞(NK) 的影响情况。方法 通过流式细胞仪，运用标有异硫氰酸荧光素( FITC)或藻红素(PE)的CD单抗，分析了24例未经驱梅治疗过的早期梅毒患者(含泛发型皮疹、 掌跖型皮疹及无皮疹型各8例)外周血中各T淋巴细胞免疫表型的特点。结果 24例梅毒患者的外周血中总T、TH、NK细胞及TH/Ts的比值均明显低于正常人对照组(P<0.01)，而Ts的比例则显著高于正常人对照组(P<0.01)；另外皮疹呈泛发型、掌跖型、无皮疹型三组患者在上述免疫表型的比例方面 相互比较，无统计学差异(P0.05)。结论 未经驱梅治疗过的早期梅毒患者存在着明显的细胞免疫抑制，其中皮疹呈泛发型、掌跖型、无皮疹型三者基本上反映了进入血液后的梅毒螺旋体在不同皮肤屏障功能下的表现形式，而与机体外周血中T淋巴细胞亚群的变化之间无明显的相关关系。
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Analysis of Peripheral Blood Lymphocyte Immunophenotypes in Syph ilitic Pat ients with Flow Cytometry Qian Lihua,Wang Xiasheng,Yang Shumei,et al. Departme nt of Dermatology,Huashan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200040
【Abstract】 Objective To characterize the human cell-mediated immune response to Treponema pallidum(TP), and to determine the effect of TP in fection on the vari ous lymphocyte subpopulations and natural killer cells in the peripheral blood o f the patients. Methods Twenty-four untreated patients with ea rly syphilis were analyzed,including 3 groups of 8 patients with disseminated syphilides,palmoplantar syphilides and latent syphilis each. Monoclonal antibodies of CD labeled with either fluor escein isothiocyanate or phycoerythrin were used on a flow cytometry to detect t he chan ging of pe ripheral blood lymphocyte immunophenotypes. Results The results showed that the percentages of panT,TH,NK cells and the ratio of TH/TS were significant ly lower (P <0.01) and those of TS cells were significantly higher (P[ WTBZ <0.01) than those of normal controls. No statistical difference of t he immunophenotype distribution was found among groups of disseminated lesions, palmoplantar syphilides, and latent syphilis (P0.05). Conclusion It suggests that there is prominent suppression of c ellular immunity in the untreated patients suf fering from early syphilis. Meanwhile, the difference of 3 groups in skin lesion s was due to the different dermatobarrier function against the systemic invasio n o f TP, rather than attributed to the alteration of the lymphocyte immunophenotyp es in the peripheral blood.
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【Key words】 Syphilis Lymphocyte immunophenotype Flow cy tometry
人T淋巴细胞对梅毒螺旋体(TP)的免疫反应极为重要 [1，2]，但是进入血液后的TP是如何影响机体外周血淋巴细胞亚群及自然杀伤细胞(NK)尚不清楚；临床上所见到的泛发型、掌跖型、无皮疹型的早期梅毒，它们在细胞免疫方面是否存在差异，更鲜为人知。我们运用流式细胞计数方法来分析梅毒患者外周血淋巴细胞亚群及NK的特点，评价进入血液后的TP对其影响的情况，从而探讨人对TP的细胞免疫反应特征，并进一步揭示上述三型早期梅毒与机体淋巴细胞亚群及NK变化之间的关系。
病例和方法
(一)病例：共收集24例未经驱梅治疗过的早期梅毒患者，均来自我院性病门诊，其中男13例，女11例；年龄20～46岁。临床上有皮疹者16例(含泛发型、掌跖型皮疹各8例)，无皮疹的潜伏梅毒8例。实验室检查示血清RPR及TPHA试验均阳性，而HIV初筛试验均阴性。另外以70例健康志愿者为对照组。
, http://www.100md.com
(二)流式细胞仪：采用型号为FACStarPLUS的流式细胞仪(美国Becton Dickinson, BD公司)；其激光工作条件为采用Innova90-5氩离子激光器，功率为200mW，波长为488nm。
(三)试剂：单克隆抗体：Anti-Leu3(CD3)FITC、Anti-Leu4(CD4)FITC、Anti-Leu2a( CD8)PE及Anti-Leu11/19(CD16, 56)PE(美国BD公司产品)，CD3+、CD4+、CD8+、CD1 6,56+分别代表总T、TH、Ts、NK细胞。红细胞溶解液：由KHCO31.0g、NH4Cl8 .3g、EDTA-Na237mg；H2O 1000mg组成(自行配制)。
(四)血液标本：抽取用肝素抗凝的患者外周静脉血2ml；免疫样品制备前在4℃下保存。
, 百拇医药
(五)样品制备：在上述抗凝全血中加入上述单抗各20μl，混合，在4℃下旋转45分钟 ；加入2ml红细胞溶解液放置片刻，破红细胞；离心1500r/min 5分钟，弃上清液；用PBS洗 涤细胞2～3次，再悬浮于0.3ml PBS中，上机。从采标本到上机在12小时内完成。
(六)数据处理：用美国BD公司Lysis软件，运用t检验及方差分析来对数据 进行统计学处理。
结 果
(一)24例梅毒患者的外周血中总T淋巴细胞、TH、NK、TH/Ts的比例 明显低于正常人对照组，并且通过t检验后示差异具有显著性(P<0.01)。 而Ts则显著高于正常人对照组(P<0.01)，详见表1。
(二)12例有皮疹的梅毒患者与8例无皮疹的潜伏梅毒患者在总T、TH、Ts、NK、TH/Ts 的比例方面，经t检验，差异无显著性(P0.05)；而且通过对皮疹呈泛发 型及掌跖型的患者在总T、TH、Ts、NK、TH/Ts的比例方面的相互比较并经方差分析后 ，差异亦无显著性(P0.05)，详见表2。
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表1 梅毒患者外周 血各淋巴细胞免疫表型的均数范围(
±s，%) 组 别例数
总T( CD 3+)
TH(CD4+)
Ts(CD8+)
NK(CD16,56+)
TH/Ts(CD4+/ CD8+)
正常人对照组
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70
68.38±7.17
42.66±5.46
24.15±5.05
19.73±6.45
1.75±0.50
梅毒患者
24
62.91±11.39
32.05±5.52
32.15±8.16
14 .38±6.62
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1.05±0.28
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8.19
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表2 皮疹分布不同 的梅毒患者淋巴细胞免疫表型的均数范围(
±s，%) 组别例数
总T(CD 3+)
TH(CD4+)
Ts(CD8+)
NK(CD16+,56+)
TH/Ts(CD4 +/CD8+)
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有皮疹型
16
63.49±10.44
32.18±5.15
32.97±8.65
13 .55±6.10
1.04±0.30
泛发型
8
66.32±11.42
31.95±5.87
37.00±10.04
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13 .24±7.68
0.92±0.31
掌跖型
8
60.66±9.20
32.41±4.73
28.95±4.75
13.86 ±4.54
1.15±0.27
t值*
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2.05
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无皮疹型
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31.79±6.56
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*指掌跖型与泛发型患者的比较，**指有皮疹与无皮疹患者的比较讨 论
我们发现本组16例Ⅱ期梅毒患者及8例早 期潜伏梅毒患者，其外周血中总的T淋巴细胞比例及TH比例明显低于正常人对照组(P<0.01)，这与Pope等[3]报道的结论一致。显然血液中缺乏了致敏的T淋巴细胞，就不能形成由TH细胞介导的对TP抗原的迟发性变态反应，从而造成二期梅毒与潜伏梅毒的持续存在。 另一方面不容忽视的是，本组24例梅毒患者外周血中Ts的比例明显升高，以致于TH/Ts 的比值显著低于正常人对照组(P<0.01)，说明Ts细胞的异常增殖不仅拮 抗了TH细胞介导的对TP抗原的迟发性变态反应，而且也抑制了TP制动抗体的形成，造成T P的繁殖与扩散。同时本组患者中其外周血中的NK细胞在数量上亦明显减少(P<0.01)。这无疑也促进了TP在血液中的繁殖。另外通过对有皮疹的(泛发型、掌跖型)与无皮疹的两组患者外周血中总T、TH、Ts、NK、 TH/Ts的比例方面的相互比较，发现差异亦无显著性(P0.05)。总之，未经驱梅治疗过的早期梅毒患者，存在着明显的细胞免疫抑制，尽管 局部的免疫功能已能控制硬下疳，但宿主仍不能根除全身的TP感染，以致TP在体内持续存在 而造成疾病的活动性与宿主的传染性。
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志谢 中国科学院上海细胞生物研究所吴直江、高奇蓉老师
参考文献
1 Baker-Zander SA, Fohn MJ, Lukehart SA. Development of c ellular immunity to individual soluble antigens of Treponema pallidum [ WTBZ during experimental syphilis. J Immunol, 1988,141∶4363-4369.
2 Ware JL, Fold JD, Baseman JB. Modulation of normal lymphocyte stimulati on by se rum from Treponema pallidum-infected rabbits. Cell Immunol, 1980,53∶29-38.
3 Pope V, Sandre AL, Larsen SA, et al. Flow cytometric of peripheral bloo d lympho cyte immunophenotypes in persons infected with Treponema pallidum. Clin Diagn La b Immunol, 1994,1∶121-124., http://www.100md.com