沙眼衣原体的基因分型及其临床意义
作者：王千秋 叶顺章 钟铭英 张树文
单位：210042 南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所[王千秋 叶顺章(指导者) 钟铭英 张树文]
关键词：沙眼衣原体；聚合酶链反应；基因型
中国皮肤科杂志980308 【摘要】目的 探讨对沙眼衣原体更为简便的分型方法及基因分型的临床意义。方法 利用聚合酶链反应(PCR)扩增沙眼衣原体外膜蛋白基因(omp1)片段，以核酸内切酶作酶切，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染色后观察带型分布。结果 扩增15种血清型omp1基因，产物为871bp 的DNA片段。用AluⅠ酶切此片段，观察到15种血清型呈现具有特征性的带型分布，但C组带 型 较难区别。再用HpaⅡ、HinfⅠ及EcoRⅠ三重酶切，则可将C组各型完全区分开来。对74株沙眼衣原体临床株进行分型，发现E,F,G,D在本观察人群中占优势，偶尔，也见到B,H,J等型别。还观察到1例F/D混合型。沙眼衣原体的型别与临床表现之间未见有明显的关联，但发现D型 感染者常为抗沙眼衣原体抗体高滴度者。结论 omp1基因分型技术可以作为流行病学调查中的有用的研究工具。
, 百拇医药
Genotyping of Chlamydia trachomatis Isolates and Its Clinical Si gnificance Wang Qianqiu, Ye Shunzhang, Zhong Mingying, et al. Instit ute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medic al College, Nanjing 210042
Abstract Objectives To test a simple method for genotyping of C.trachomatis isolates and to investigate the clinical signi ficance of the genotypes. Methods A part of the chlamydial genome enco ding the majo r outer membrane protein(omp1) was amplified by polymerase chain reaction (P CR). The products were digested by endonucleases to see the characteristic pa tterns, after silver staining on 10% polyacrylamide gels. Result s The omp1 genes of 15 serovars of C. trachomatis were am pl ified by PCR,which generated an 871 base pair gene fragment. AluⅠ digestion of the product gave characteristic patterns for the 15 serovars,but group C presented closely similar patterns. A triple digestion with HpaⅡ, foll owed b y HinfⅠ and EcoRⅠ, would allow the differentiation of serovars in group C. Ana lysis of 74 clinical isolates revealed serovars E, F, D, G as the most prevalen t gen ital serovars in the studied populations. Serovars B, H, J were occasionally
, 百拇医药
id entified. A mixed infection with serovars F and D was seen in a clinical samp le. No significant relationship was observed between clinical manifestations of urogenital chlamydial infections and serovars,however,serovar D was more often associated with high-titer of anti-chlamydial antibody than other serovars. Conclusion The omp1 genotyping technique seems to be promising for epidemiological studies.
Key words Chlamydia trachomatis PCR Genotyping
, 百拇医药
沙眼衣原体至少可以分为15个血清型，即B组的B、Ba、D、E、L1、L2型；C 组的A、C、H、I、 J、K、L3型和中间组F、G型。引起泌尿生殖道感染的主要为D～K型。对沙眼衣原体的分离株 进行分型研究，将有助于监测特定型别的流行动态，也有助于临床上判定治疗失败与再感染。随着PCR技术的发展，有可能通过扩增沙眼衣原体主要外膜蛋白(omp1)基因，扩增产物用限制性内切酶处理，作限制性片段长度多态性分析(restriction fragment len gth polymorphism, RFLP)，从而区分不同型别。
材料和方法
一、材料
15种血清型的沙眼衣原体标准株包括：A/HAR-13、B-51、Ba、K/CDC、C/TW-3、E/S51、I /C8 88、J/B-24、D/13028Cx、F/N13754、L1，L2/440、L3/CDC87，由美国疾病控制与预防中心Mor se博士赠送。G、H为我室保存株。临床标本取自本所及江苏省计划生育研究所门诊部，时间 为1994年6月至1996年7月。女性标本取自宫颈管内1～2cm处，男性取自尿道内2～3cm 处。取材后的拭子放入装有衣原体运送培养基的试管，封盖后，置于-70℃保存。需作检测或细胞培养时，在37℃水浴箱中迅速化开，旋涡震荡30秒后，弃去拭子，取适量运送液检测。
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二、方法
(一) 沙眼衣原体细胞培养：采用以McCoy细胞为宿主细胞的96孔微量板培养法。
(二) omp1分型：引物系根据沙眼衣原体L2株的omp1序列而设计[1]，由中 国科学院上海细胞生物研究所合成：正链TGACTTTGTTTTCGACCGTGTTTT(309 →333)；反链TTTTCTAGATTTCATCTTGTTCAAT/CTG(1179→1153)。取临床标本或组织培养物200μl，以15 000r/min离心15分钟，弃上清液。加标本裂解液[50mmol/L Tris *Cl(pH8 .0)，0.5%吐温20，0.5% NP-40，0.01% SDS]50μl，混悬沉淀物，95℃加热10分钟 ，再以15 000r/min离心5分钟，取上清液作为PCR反应的模板。反应总体积50μl，包括：Taq DNA 聚合酶1U，10×反应缓冲液5μl，MgCl2(25mmol/L)5μl， dNTPs 0.2mmol/L，引物0.2 μ mol/L，模板25μl，三蒸水加至50μl。反应条件为94℃，1分钟；60℃，1分钟；72℃，2分钟；共40个循环。反应完毕，取4μl产物，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。在紫外灯下，若见到预期的871bp阳性产物，则进一步酶切分析。
, 百拇医药
取PCR产物8μl，加AluⅠ2.5U，10×酶切缓冲液1μl，三蒸水补足至10μl，在37℃作用4小时后待分析。另取PCR产物10μl，加EcoRⅠ、HinfⅠ各4U，10×酶切缓冲液1.6 μl，三蒸水加至16μl，在37℃作用4小时。然后，以酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，最后用8μ l TE缓冲液溶解沉淀。 再加入HpaⅡ2.5U，10×酶切缓冲液1μl，补水至10μl，在37 ℃作用4小时后待分析。将上述酶切产物在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染色观察。
(三)血清抗体的检测：采用简化的L2抗原免疫荧光试验(MIF)[2] 。
结 果
一、临床资料
检测对象共计300例，临床拟诊为非淋菌性尿道炎或盆腔炎。男125例，女175例。年龄 19～50岁，平均31.65±6.68岁。沙眼衣原体培养阳性75例， 占总检测人数的25.0%。对这75例沙眼衣原体培养阳性者(1株标本丢失， 实际结果为74株)及1 5株标准株进了omp1基因分型。
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二、omp1分型
(一)标准株的omp1分型： 利用omp1分型引物，15个血清型的标准株均扩增出预期的871bp的DNA片段。采用2种酶 切方法。一是以AluⅠ酶切，可以区分B组及中间组(F/G)的8个血清型：B、Ba、D、E、F、G 、L1、L2，但B和Ba的带型特点极为相似。C组各血清型的带型相似，不易区分。二是以Hpa Ⅱ/EcoRⅠ/HinfⅠ酶切，可将C组各型全部区别开来(图1～2)。
M：pGEM-7zf(+)HaeⅢ markers
图1 沙眼衣原体标准株AluⅠ酶切图谱
M：pGEM-7zf(+)HaeⅢmarkers
, 百拇医药
图2 沙眼衣原体标准株HpaⅡ/ EcoRⅠ/HinfⅠ酶切图谱(C组)
(二)临床分离株的omp1分型：在74株沙眼衣原体阳性标本中，E型最多，共41株，占55.4%；其次是F型，14株占18.9%；D型10株，占13.5%；G型6株，占8.1%；B、H、J型各1株，各占1.4%。这些临床株的RFLP类型与相应型别的标准株基本一致。部分临床标本的omp1分型结果见图3。
三、临床表现及血清反应性与omp1型别的关系
在分析临床表现与omp1的关系时，为消除合并其它感染对结果的影响，故剔去女患者中合并淋球菌、霉菌及滴虫感染者5例，为E型4例、F型1例，只分析31例。剔去男患者中合并霉菌及滴虫感染者2例(为E型2例)，只分析36例。而在分析血清反应性与omp1型的关系时不剔去任何病例。在男女性，出现各种临床症状和体征的机会在B组和F/G组并无显著差异(附表)。在10例D型感染者中，MIF滴度(倒数)≥160者9例(90%)；而其它型别(如E、F、G)感染者中MIF高滴度者所占比例为16.7%～30.7%左右，另有1例F/D型也为 高滴度。
, 百拇医药
M：pGEM-7zf(+)Ha eⅢmarkers；1、2、7、11：F型；
3～6、8、10：E型；9：D型
图3 部分临床标本的omp1分型结果
表1 泌尿生殖道沙 眼衣原体感染者临床表现
与omp1型别的关系* 临床表现
例 数
omp1型别
χ2**
P
B组
C组
, 百拇医药
F/G组
F/D
男性
尿痛
21
16(70)
0
5(42)
0
2.56
>0.05
尿道分泌物
25
, 百拇医药
18(78)
1
6(50)
0
2.92
>0.05
尿道拭子 WBC10/HP
29
20(87)
1
8(67)
0
2.03
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>0.05
女性
阴道分泌
物异常
21
15(65)
1
4(67)
1
0.17
>0.05
下腹痛
12
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9(39)
0
3(50)
0
0.23
>0.05
宫颈粘液
脓性分泌物
15
10(43)
1
3(50)
1
, 百拇医药
0.08
>0.05
宫颈拭子
WBC10/HP
28
21(91)
1
5(83)
1
0.33
>0.05
* 表中数字为出现阳性症状的病例数；括号中为占该组总数的百分比。男性患者B组总数为23例，F/G组为12例；女性患者B组为23例，F/G组为6例。 **由于C组和F/D型菌株数太少，故统计显著性差异时只计B组和F/G组。
, 百拇医药
讨 论
本研究采用omp1-RFLP分型技术，成功地扩增出15个标准血清型菌株和74 株临床分离株的omp1基因。我们所用的引物只覆盖沙眼衣原体的omp1基因的4个高可变区，与其它文献报道所用的引物不同[3，4]，后者所扩增的产物均在1kb以上。产物片段较小，以限制性内切酶酶切后产生的带型不十分复杂，便于分析。与以往国内外报道的泌尿生殖道沙眼衣原体的型别相似，我们在泌尿生殖道标本中发现E、F、G、D型占优势。另一方面，主要引起沙眼的A～C型很少在泌尿生殖道中发现。在美国西雅图的1756株中，无1株为A～C型[5]；瑞典的1040株中1.5%为C型[6]；而加拿大的435株中Ba为20株，C为8株[7]。我们的74株样本中见到1株B型。造成血清型分布上的 不平衡与多种因素有关，如宿主的免疫能力、性行为方式及菌株的毒力等。
PCR-RFLP具有极高的分辨率，因此能鉴定不同血清型的混合感染或新的血清型。我们发现1例F/D混合感染，占1.4%。一项研究在352例生殖道分离株中发现2%为混合感染[8]。有人发现的混合感染率则更高(5/50例，10%)[1]。推测混合感染的发生与多个性伴有关系。鉴于许多新的血清型不断被发现(如Da、Dˉ、Ia、Iˉ、L2ˉ、L2a等)，对其序列变异亦已进行研究，因此提出一些混合感染可能就是沙眼衣原体新的型别。
, 百拇医药
沙眼衣原体的不同型别与临床表现及血清学反应的关系，可能在很大程度上取决于各型别的内在毒力。在男性，F型及G型感染者症状常轻于B组及C组感染者[9，10 ]。 在女性，血清型与临床的关系则有不同看法。有发现女性宫颈炎沙眼衣原体感染的型别与临床表现无明显相关[9]。也有发现女性F和G型感染引起的体征(宫颈粘液脓性分泌物)显著轻于其它型别(如E型)[10] 。我们在本研究中，发现男女性患者的临床症状和体征与omp1型别之间并无关联。这个结果可能反映了本地沙眼衣原 体株的流行特点，但也有可能是样本量相对较少未足以反映这些因素之间的差异。我们发现，感染D型的患者较常出现高滴度，1例F/D混合型也为高滴度。在小鼠模型中，D型的 致病性强于H型[11]。在人泌尿生殖道感染中，同性恋男性的直肠感染常为D型，而 在异性恋的宫颈炎感染中D型则相对少见。D型的omp1基因变 异较其它型别如E和F型更为常见。这说明D型基因变异水平决定其较强的毒力。
参考文献
, 百拇医药
1 Gaydos CH, Bobo L, Welsh L, et al. Gene typing o f Chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction and rest riction endonuclease digestion. Sex Transm Dis, 1992,19∶303-308.
2 van Dyck E, Piot P, Meheus A. Bench-level laboratory manual fo r sexually transmitted diseases. WHO/VDT/89.443,1989∶25-31.
3 Rodriguez P, de Barbeyrac B, Persson K, et al. Evaluation of mo lecular typin g for epidemiology study of Chlamydia trachomatis genital infec tion.J Clin Microbiol, 1993,31∶2238-2240.
, 百拇医药
4 Frost EH, Deslandes S, Veilleux S, et al.Typing Chlamyd ia trachomatis[ WTBZ by detection of restriction fragment length polymorphism in the gene enco ding the major outer membrane protein. J Infect Dis,1991,163∶1103-1107.
5 Suchland RJ, Stamm WE. Simplified microtiter cell culture met hod for rapid i mmunotyping of Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol,1991,29 ∶1333-1338.
6 Poole E, Lamont I. Chlamydia trachomatis serova r differentiatio n by direct sequence analysis of the variable segment 4 region of the major oute r membrane protein gene.Infect Immun, 1992, 60∶1089-1094.
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7 Frost EH, Deslander S, Bourgaux-Ramoisy D. Chlamydia trachomatis serovars in 435 urogenital specimens typed by restriction endonuclease ana lysis of amplified DNA. J Infect Dis, 1993, 168∶497-501.
8 Barnes RC, Suchland RJ, Wang SP, et al. Detection of multiple s erovar of Chlamydia trachomatis in genital infection. J Infect Dis,1985,152∶98 5-989.
9 van der Lear MJW, Lan J, van Duynhoven YTHP, et al. Differences in clinical ma nifestations of genital chlamydial infections related to serovars. Genitourin Me d,1996,72∶261-265.
, http://www.100md.com
10 Stamm WE, Stevens CE, Suchland RJ, et al.Association of infecting se ro var with clinical manifestations in Chlamydia trachomatis genital infect ions in women.In: Bowie WR, Caldwell HD, Jones RB, et al. Chlamydial infection s. Cambridge∶ Cambridge University Press 1990∶303-306.
11 Ito JI, Lyons JM, Airo-Brown LP. Variation in virulence among oculo- genital serovars of Chlamydia trachomatis in experimental genita l tract infection.Infect Immun, 1990, 58∶2021-2023.
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单位：210042 南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所[王千秋 叶顺章(指导者) 钟铭英 张树文]
关键词：沙眼衣原体；聚合酶链反应；基因型
中国皮肤科杂志980308 【摘要】目的 探讨对沙眼衣原体更为简便的分型方法及基因分型的临床意义。方法 利用聚合酶链反应(PCR)扩增沙眼衣原体外膜蛋白基因(omp1)片段，以核酸内切酶作酶切，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染色后观察带型分布。结果 扩增15种血清型omp1基因，产物为871bp 的DNA片段。用AluⅠ酶切此片段，观察到15种血清型呈现具有特征性的带型分布，但C组带 型 较难区别。再用HpaⅡ、HinfⅠ及EcoRⅠ三重酶切，则可将C组各型完全区分开来。对74株沙眼衣原体临床株进行分型，发现E,F,G,D在本观察人群中占优势，偶尔，也见到B,H,J等型别。还观察到1例F/D混合型。沙眼衣原体的型别与临床表现之间未见有明显的关联，但发现D型 感染者常为抗沙眼衣原体抗体高滴度者。结论 omp1基因分型技术可以作为流行病学调查中的有用的研究工具。
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Genotyping of Chlamydia trachomatis Isolates and Its Clinical Si gnificance Wang Qianqiu, Ye Shunzhang, Zhong Mingying, et al. Instit ute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medic al College, Nanjing 210042
Abstract Objectives To test a simple method for genotyping of C.trachomatis isolates and to investigate the clinical signi ficance of the genotypes. Methods A part of the chlamydial genome enco ding the majo r outer membrane protein(omp1) was amplified by polymerase chain reaction (P CR). The products were digested by endonucleases to see the characteristic pa tterns, after silver staining on 10% polyacrylamide gels. Result s The omp1 genes of 15 serovars of C. trachomatis were am pl ified by PCR,which generated an 871 base pair gene fragment. AluⅠ digestion of the product gave characteristic patterns for the 15 serovars,but group C presented closely similar patterns. A triple digestion with HpaⅡ, foll owed b y HinfⅠ and EcoRⅠ, would allow the differentiation of serovars in group C. Ana lysis of 74 clinical isolates revealed serovars E, F, D, G as the most prevalen t gen ital serovars in the studied populations. Serovars B, H, J were occasionally
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id entified. A mixed infection with serovars F and D was seen in a clinical samp le. No significant relationship was observed between clinical manifestations of urogenital chlamydial infections and serovars,however,serovar D was more often associated with high-titer of anti-chlamydial antibody than other serovars. Conclusion The omp1 genotyping technique seems to be promising for epidemiological studies.
Key words Chlamydia trachomatis PCR Genotyping
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沙眼衣原体至少可以分为15个血清型，即B组的B、Ba、D、E、L1、L2型；C 组的A、C、H、I、 J、K、L3型和中间组F、G型。引起泌尿生殖道感染的主要为D～K型。对沙眼衣原体的分离株 进行分型研究，将有助于监测特定型别的流行动态，也有助于临床上判定治疗失败与再感染。随着PCR技术的发展，有可能通过扩增沙眼衣原体主要外膜蛋白(omp1)基因，扩增产物用限制性内切酶处理，作限制性片段长度多态性分析(restriction fragment len gth polymorphism, RFLP)，从而区分不同型别。
材料和方法
一、材料
15种血清型的沙眼衣原体标准株包括：A/HAR-13、B-51、Ba、K/CDC、C/TW-3、E/S51、I /C8 88、J/B-24、D/13028Cx、F/N13754、L1，L2/440、L3/CDC87，由美国疾病控制与预防中心Mor se博士赠送。G、H为我室保存株。临床标本取自本所及江苏省计划生育研究所门诊部，时间 为1994年6月至1996年7月。女性标本取自宫颈管内1～2cm处，男性取自尿道内2～3cm 处。取材后的拭子放入装有衣原体运送培养基的试管，封盖后，置于-70℃保存。需作检测或细胞培养时，在37℃水浴箱中迅速化开，旋涡震荡30秒后，弃去拭子，取适量运送液检测。
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二、方法
(一) 沙眼衣原体细胞培养：采用以McCoy细胞为宿主细胞的96孔微量板培养法。
(二) omp1分型：引物系根据沙眼衣原体L2株的omp1序列而设计[1]，由中 国科学院上海细胞生物研究所合成：正链TGACTTTGTTTTCGACCGTGTTTT(309 →333)；反链TTTTCTAGATTTCATCTTGTTCAAT/CTG(1179→1153)。取临床标本或组织培养物200μl，以15 000r/min离心15分钟，弃上清液。加标本裂解液[50mmol/L Tris *Cl(pH8 .0)，0.5%吐温20，0.5% NP-40，0.01% SDS]50μl，混悬沉淀物，95℃加热10分钟 ，再以15 000r/min离心5分钟，取上清液作为PCR反应的模板。反应总体积50μl，包括：Taq DNA 聚合酶1U，10×反应缓冲液5μl，MgCl2(25mmol/L)5μl， dNTPs 0.2mmol/L，引物0.2 μ mol/L，模板25μl，三蒸水加至50μl。反应条件为94℃，1分钟；60℃，1分钟；72℃，2分钟；共40个循环。反应完毕，取4μl产物，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。在紫外灯下，若见到预期的871bp阳性产物，则进一步酶切分析。
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取PCR产物8μl，加AluⅠ2.5U，10×酶切缓冲液1μl，三蒸水补足至10μl，在37℃作用4小时后待分析。另取PCR产物10μl，加EcoRⅠ、HinfⅠ各4U，10×酶切缓冲液1.6 μl，三蒸水加至16μl，在37℃作用4小时。然后，以酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，最后用8μ l TE缓冲液溶解沉淀。 再加入HpaⅡ2.5U，10×酶切缓冲液1μl，补水至10μl，在37 ℃作用4小时后待分析。将上述酶切产物在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染色观察。
(三)血清抗体的检测：采用简化的L2抗原免疫荧光试验(MIF)[2] 。
结 果
一、临床资料
检测对象共计300例，临床拟诊为非淋菌性尿道炎或盆腔炎。男125例，女175例。年龄 19～50岁，平均31.65±6.68岁。沙眼衣原体培养阳性75例， 占总检测人数的25.0%。对这75例沙眼衣原体培养阳性者(1株标本丢失， 实际结果为74株)及1 5株标准株进了omp1基因分型。
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二、omp1分型
(一)标准株的omp1分型： 利用omp1分型引物，15个血清型的标准株均扩增出预期的871bp的DNA片段。采用2种酶 切方法。一是以AluⅠ酶切，可以区分B组及中间组(F/G)的8个血清型：B、Ba、D、E、F、G 、L1、L2，但B和Ba的带型特点极为相似。C组各血清型的带型相似，不易区分。二是以Hpa Ⅱ/EcoRⅠ/HinfⅠ酶切，可将C组各型全部区别开来(图1～2)。
M：pGEM-7zf(+)HaeⅢ markers
图1 沙眼衣原体标准株AluⅠ酶切图谱
M：pGEM-7zf(+)HaeⅢmarkers
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图2 沙眼衣原体标准株HpaⅡ/ EcoRⅠ/HinfⅠ酶切图谱(C组)
(二)临床分离株的omp1分型：在74株沙眼衣原体阳性标本中，E型最多，共41株，占55.4%；其次是F型，14株占18.9%；D型10株，占13.5%；G型6株，占8.1%；B、H、J型各1株，各占1.4%。这些临床株的RFLP类型与相应型别的标准株基本一致。部分临床标本的omp1分型结果见图3。
三、临床表现及血清反应性与omp1型别的关系
在分析临床表现与omp1的关系时，为消除合并其它感染对结果的影响，故剔去女患者中合并淋球菌、霉菌及滴虫感染者5例，为E型4例、F型1例，只分析31例。剔去男患者中合并霉菌及滴虫感染者2例(为E型2例)，只分析36例。而在分析血清反应性与omp1型的关系时不剔去任何病例。在男女性，出现各种临床症状和体征的机会在B组和F/G组并无显著差异(附表)。在10例D型感染者中，MIF滴度(倒数)≥160者9例(90%)；而其它型别(如E、F、G)感染者中MIF高滴度者所占比例为16.7%～30.7%左右，另有1例F/D型也为 高滴度。
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M：pGEM-7zf(+)Ha eⅢmarkers；1、2、7、11：F型；
3～6、8、10：E型；9：D型
图3 部分临床标本的omp1分型结果
表1 泌尿生殖道沙 眼衣原体感染者临床表现
与omp1型别的关系* 临床表现
例 数
omp1型别
χ2**
P
B组
C组
, 百拇医药
F/G组
F/D
男性
尿痛
21
16(70)
0
5(42)
0
2.56
>0.05
尿道分泌物
25
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18(78)
1
6(50)
0
2.92
>0.05
尿道拭子 WBC10/HP
29
20(87)
1
8(67)
0
2.03
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女性
阴道分泌
物异常
21
15(65)
1
4(67)
1
0.17
>0.05
下腹痛
12
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9(39)
0
3(50)
0
0.23
>0.05
宫颈粘液
脓性分泌物
15
10(43)
1
3(50)
1
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0.08
>0.05
宫颈拭子
WBC10/HP
28
21(91)
1
5(83)
1
0.33
>0.05
* 表中数字为出现阳性症状的病例数；括号中为占该组总数的百分比。男性患者B组总数为23例，F/G组为12例；女性患者B组为23例，F/G组为6例。 **由于C组和F/D型菌株数太少，故统计显著性差异时只计B组和F/G组。
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讨 论
本研究采用omp1-RFLP分型技术，成功地扩增出15个标准血清型菌株和74 株临床分离株的omp1基因。我们所用的引物只覆盖沙眼衣原体的omp1基因的4个高可变区，与其它文献报道所用的引物不同[3，4]，后者所扩增的产物均在1kb以上。产物片段较小，以限制性内切酶酶切后产生的带型不十分复杂，便于分析。与以往国内外报道的泌尿生殖道沙眼衣原体的型别相似，我们在泌尿生殖道标本中发现E、F、G、D型占优势。另一方面，主要引起沙眼的A～C型很少在泌尿生殖道中发现。在美国西雅图的1756株中，无1株为A～C型[5]；瑞典的1040株中1.5%为C型[6]；而加拿大的435株中Ba为20株，C为8株[7]。我们的74株样本中见到1株B型。造成血清型分布上的 不平衡与多种因素有关，如宿主的免疫能力、性行为方式及菌株的毒力等。
PCR-RFLP具有极高的分辨率，因此能鉴定不同血清型的混合感染或新的血清型。我们发现1例F/D混合感染，占1.4%。一项研究在352例生殖道分离株中发现2%为混合感染[8]。有人发现的混合感染率则更高(5/50例，10%)[1]。推测混合感染的发生与多个性伴有关系。鉴于许多新的血清型不断被发现(如Da、Dˉ、Ia、Iˉ、L2ˉ、L2a等)，对其序列变异亦已进行研究，因此提出一些混合感染可能就是沙眼衣原体新的型别。
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沙眼衣原体的不同型别与临床表现及血清学反应的关系，可能在很大程度上取决于各型别的内在毒力。在男性，F型及G型感染者症状常轻于B组及C组感染者[9，10 ]。 在女性，血清型与临床的关系则有不同看法。有发现女性宫颈炎沙眼衣原体感染的型别与临床表现无明显相关[9]。也有发现女性F和G型感染引起的体征(宫颈粘液脓性分泌物)显著轻于其它型别(如E型)[10] 。我们在本研究中，发现男女性患者的临床症状和体征与omp1型别之间并无关联。这个结果可能反映了本地沙眼衣原 体株的流行特点，但也有可能是样本量相对较少未足以反映这些因素之间的差异。我们发现，感染D型的患者较常出现高滴度，1例F/D混合型也为高滴度。在小鼠模型中，D型的 致病性强于H型[11]。在人泌尿生殖道感染中，同性恋男性的直肠感染常为D型，而 在异性恋的宫颈炎感染中D型则相对少见。D型的omp1基因变 异较其它型别如E和F型更为常见。这说明D型基因变异水平决定其较强的毒力。
参考文献
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