高危人群生殖支原体分离培养的初步报告
作者：赵季文 骆丹 王婉云 梁国钧 范宝剑 张献哲 徐萃瑜 孙厚华 汪宁 徐文严
单位：210009 南京，南京铁道医学院流行病学教研室 (赵季文 范宝剑 徐萃瑜 汪宁)；中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所(骆 丹 梁国钧 孙厚华 徐文严)；北京铁路中心卫生防疫站(王婉云 张献哲)
关键词：生殖支原体；分离；培养
中华皮肤科杂志980305
【摘要】目的 用病原学方法了解我国高危人群是否有生殖支原体感染及其频率，为防治工作提供依据。方法 取性病患者及性罪错者泌尿生殖道分泌物，接种在SP-4培养基作分离培养，符合生殖支原体生物学特征的培养物用聚合酶链反应技术加以鉴定。结果 在227例高危人群中培养出8株生殖支原体，总分离率为3.85%。其中性病患者分离率为5.21%，性罪错者为2.29%。两者差异无显著性(P0.05)。结论 从病原学上首次证实，京、沪、宁三地高危人群中存在生殖支原体感染，在性传播疾病防治工作中应予重视。
, 百拇医药
Preliminary Study on the Isolation of Mycoplasma genitalium in the High-Ri sk Populations in China Zhao Jiwen,Luo Dan,Wang Wanyun,et al. Departm ent of Epidemiology,Nanjing Railway Medical College,Nanjing 210009
【Abstract】 Objective The purpose of this study is to underst and whether Myco plasma genitalium infection is present in the high-risk populations in China, and what is its prevalence so as to provide evidence fo r the prevention and treat ment of it. Methods The genitourinary spe cimens collected f rom the STD patients and sexually promiscuous persons were cultured in SP-4 medium for the isolation of M.genitalium. All of the isolates wi th t heir biological characteristics consistent with those of M.genitalium were ident ified by polymerase chain reaction(PCR). Results Eight strai ns of M.geni talium were isolated from 227 genitourinary specimens, the isolation rat e of M.genit alium in the high-risk populations was 3.85%, among them the rates in the STD patien ts and in the promiscuous persons were 5.21% and 2.29% respectively,and the di fference between them was not significant (P0.05). Concl usion M.genitalium infection is present in the high-risk popul ations in B eijing,Shanghai and Nanjing, and is firstly verified by isolation of pathogen.
, 百拇医药
【Key words】 Mycoplasma genitalium Isolation Cultures
生殖支原体(Mycoplasma genitalium, Mg)是Tully等[1][ HT5 于1991年首次从两例非淋菌性尿道炎患者尿道中分离出的支原体。研究表明，它与人 类尿道炎和盆腔炎等疾病有关[2]。因分离培养难度极大，近来新分离Mg报告甚少[3]。为了解我国是否存在Mg感染，我们对京、沪、宁三地区部分高危人群(性病患者和性罪错者)的生殖泌尿道分泌物做了Mg分离培 养，取得初步结果，现报道如下。
材料和方法
(一)标本来源：1995年4月至1996年6月，北京和南京性病门诊患者96例，男 19例，女77例；年龄19～56岁，平均33岁。其中淋病12例、非淋菌性尿道炎22例、尖锐湿疣 24例、梅毒5例、其它33例。北京和上海性罪错者131例，男30例，女101例；年龄16～59岁，平均29岁；性伴数1～11个。否认有性病史，近两周内未用过抗支原体药物。
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(二)取材方法：标本采集时，男性用无菌铝杆棉拭子插入尿道2cm～3cm，女性先拭去宫颈表 面粘液，再用木杆拭子插入宫颈口1cm～2cm，置留2～3秒并旋转后取出，接种于5ml改良的S P-4培基试管中。
(三)培养方法：
1.改良SP-4培基的制备：按Tully等[1]的SP-4配方改进而成。每100ml培养基：牛肉浸液71.5ml，胰蛋白胨1g，蛋白胨0.53g，调pH7.6，105kPa 20分 钟高压灭菌。加添加物：50%葡萄糖1ml，CMRL-1066 5ml，25%新鲜酵母浸液10ml，小牛血清20ml，1%酚红0.2ml，青霉素钠盐(20万U/ml)0.5ml。最终pH为7.4～7.5。
2.培养与鉴定：标本种入液体培养基后，置37℃温箱培养，当培养液颜色由红变黄，清澈透明，视“培养可疑阳性”，用孔径0.45μm滤膜过滤，滤液转种到改良SP-4培养基中 ，置37℃培养。当培养基颜色再度由红变黄，则认为“初代培养阳性”。每批标本培养时，设阳性对照(培养基中加适量Mg标准菌株G-37)和阴性对照(Mg培养基)。每份标本观察 3～4个月仍不变色，认为“培养阴性”。若一周内变色或出现混浊及沉淀视为“非Mg生长” 。初代 培养阳性培养物用PCR法检测并参考其生物学特性来鉴定是否为Mg菌株。
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(四)PCR检测
1.引物设计：参照文献[4]设计的生殖支原体粘附蛋白基因(Mg-Pa, 140 000)引物而合成。序列如下：Mg-1：5′-TGTCTATGACCAGTATGTAC-3′，Mg-2：5′-CTGCTTTGGTCAAGACATCA-3′，预期扩增片段为374bp，由美国Cybersyn公司合成。
2.模板DNA的制备：按文献[5]。
3.PCR反应：方法按文献[5]。
(五)统计学分析：均在SAS软件包上完成。分离率比较用Pearson χ2 检验和Fisher精确概率法。
结 果
(一)性病患者和性罪错者Mg分离结果：见附表。附表显示，北京、南京和上 海三个地区227份临床标本中，分离到8株Mg，分离率为3.52%。其中性病患者分离率为5.2 1%(5/96)，性罪错者为2.29%(3/131)。两者无显著性差异(χ2=0.66，P0.05)。北京地区性病患者Mg分离率(5.56%)与南京地区分离率(4.17%)无显著性差异 (P=1.00)。在性罪错者中，北京分离率为2.38%，上海为2.13%，两地 无显著性差异(P=1.00)。
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(二)不同性别Mg分离率比较：性病患者中，男性Mg分离率为5.26%(1/ 19)，女性为5.19%(4/77)，二者无显著性差异(P=1.00)。性罪错者男女 Mg分离率分别为0和2.97%(3/101)，P=1.00。两种人群合 计男性分离率为2.04%(1/49)，女性为3.93%(7/178)，无显著性差异(χ2=0. 04，P0.05)。
(三)Mg分离株初代生长情况、PCR结果及背景资料：初代生长时间(8株Mg)最短为30天，最长 55天，平均36.5天。8株Mg用选自Mg吸附蛋白基因
附表 北京、南京和上海性病患者及性罪错者
生 殖支原体分离情况 地区
培养例数
初代培养
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可疑数
初代培养
阳性数
PCR
阳性数
确认
菌株数
分离率
(%)
性病患者
96
44
6
, 百拇医药 5
5
5.21
北京
72
37
5
4
4
5.56
南京
24
7
1
, 百拇医药
1
1
4.17
性罪错者
131
69
3
3
3
2.29
北京
84
35
2
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2
2
2.38
上海
47
34
1
1
1
2.13
合 计
227
113
9
, 百拇医药
8
8
3.52
序列的引物均可扩增出374 bp特异性片段。8例Mg分离培养和PCR检测均阳性 的受检者中，5例为性病患者(分别患有淋病、尖锐湿疣、非淋菌性尿道炎)，3例为性罪错者(性伴3～4个)。年龄22～46岁，平均28岁。女7例，男1例 。北京6例，上海和南京各1例。职业为农民、干部、服务员、家庭妇女各1例，个体和待业者各2例。
讨 论
从1995年3月开始，我们率先对高危人群泌尿生殖道分泌物进行培养并获成功。从病原学上首次证实我国京、沪、宁地区高危人群中存在Mg感染。我们从性病患者和性罪错者中分离出8株Mg，其生物特性与Tully[1]所描述的Mg特征相 符合：①仅在SP-4培基上生长；②初代生长时间缓慢(至少1个月)；③能发酵葡萄糖，不分解精氨酸及尿素；④在液体培养基中生长时，培养基呈透明状，无混浊及沉淀产生；⑤对青霉素不敏感；⑥可通过0.45μm微孔滤膜；⑦用PCR技术，根据Mg-Pa特征性引物序列，可扩增出Mg-DNA的特异性片段；⑧培养阳性者的生殖泌尿道分泌物PCR检测均为阳性。所以，从 培养特性(营养要求、培养基、培养条件、初代生长时间、生化反应、可滤过性、抑菌剂)以 及PCR检测阳性等综合判断，确认所分离的8个菌株为Mg的根据是充分的。
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Mg难分离的原因如下：①初代培养时间太长，要耐心观察，工作量大；②长期37℃培养，培 养基挥发、液量减少及自然变色，造成判断困难；③标本中杂菌发酵葡萄糖使培养基变色， 干扰 Mg生长并难鉴别；④初代Mg培养物不稳定，极易死亡，常造成转代失活或菌株丢失而无法进 行菌落形态、血清学及有关试验。为提高分离培养成功率，被检分泌物应及时进行PCR检测 ，对阳性标本倍加注意，这是关键。
志谢 PCR检测得到北京医科大学第一医院孔繁荣大夫大力协助
参考文献
1 Tully JG, Taylor-Robinson D, Cole RM, et al. A newly di scovered mycoplasma in the human urogenital tract. Lancet, 1981,1∶1288-1291.
2 Taylor-Robinson D. The history and role of Mycoplasma genitali um in sexually transmitted diseases. Genitourin Med, 1995,71∶1-8.
, 百拇医药
3 Jensen JS, Hansen HT, Lind K. Isolation of Mycoplasma genitaliu m strains from the male urethra. J Clin Microbiol, 1996,34∶286-291.
4 Palmer HM, Gilroy CB, Furr PM, et al. Development and evaluation of the polymer ase chain reaction to detect Mycoplasma genitalium. FEMS Microbi ol Lett, 1991,77∶199-204.
5 孔繁荣, 朱学骏, 周骏马, 等. 泌尿生殖道人型支原体和生殖支原体的检测. 临床皮肤科杂志, 1996,25∶3-5., 百拇医药
单位：210009 南京，南京铁道医学院流行病学教研室 (赵季文 范宝剑 徐萃瑜 汪宁)；中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所(骆 丹 梁国钧 孙厚华 徐文严)；北京铁路中心卫生防疫站(王婉云 张献哲)
关键词：生殖支原体；分离；培养
中华皮肤科杂志980305
【摘要】目的 用病原学方法了解我国高危人群是否有生殖支原体感染及其频率，为防治工作提供依据。方法 取性病患者及性罪错者泌尿生殖道分泌物，接种在SP-4培养基作分离培养，符合生殖支原体生物学特征的培养物用聚合酶链反应技术加以鉴定。结果 在227例高危人群中培养出8株生殖支原体，总分离率为3.85%。其中性病患者分离率为5.21%，性罪错者为2.29%。两者差异无显著性(P0.05)。结论 从病原学上首次证实，京、沪、宁三地高危人群中存在生殖支原体感染，在性传播疾病防治工作中应予重视。
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Preliminary Study on the Isolation of Mycoplasma genitalium in the High-Ri sk Populations in China Zhao Jiwen,Luo Dan,Wang Wanyun,et al. Departm ent of Epidemiology,Nanjing Railway Medical College,Nanjing 210009
【Abstract】 Objective The purpose of this study is to underst and whether Myco plasma genitalium infection is present in the high-risk populations in China, and what is its prevalence so as to provide evidence fo r the prevention and treat ment of it. Methods The genitourinary spe cimens collected f rom the STD patients and sexually promiscuous persons were cultured in SP-4 medium for the isolation of M.genitalium. All of the isolates wi th t heir biological characteristics consistent with those of M.genitalium were ident ified by polymerase chain reaction(PCR). Results Eight strai ns of M.geni talium were isolated from 227 genitourinary specimens, the isolation rat e of M.genit alium in the high-risk populations was 3.85%, among them the rates in the STD patien ts and in the promiscuous persons were 5.21% and 2.29% respectively,and the di fference between them was not significant (P0.05). Concl usion M.genitalium infection is present in the high-risk popul ations in B eijing,Shanghai and Nanjing, and is firstly verified by isolation of pathogen.
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【Key words】 Mycoplasma genitalium Isolation Cultures
生殖支原体(Mycoplasma genitalium, Mg)是Tully等[1][ HT5 于1991年首次从两例非淋菌性尿道炎患者尿道中分离出的支原体。研究表明，它与人 类尿道炎和盆腔炎等疾病有关[2]。因分离培养难度极大，近来新分离Mg报告甚少[3]。为了解我国是否存在Mg感染，我们对京、沪、宁三地区部分高危人群(性病患者和性罪错者)的生殖泌尿道分泌物做了Mg分离培 养，取得初步结果，现报道如下。
材料和方法
(一)标本来源：1995年4月至1996年6月，北京和南京性病门诊患者96例，男 19例，女77例；年龄19～56岁，平均33岁。其中淋病12例、非淋菌性尿道炎22例、尖锐湿疣 24例、梅毒5例、其它33例。北京和上海性罪错者131例，男30例，女101例；年龄16～59岁，平均29岁；性伴数1～11个。否认有性病史，近两周内未用过抗支原体药物。
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(二)取材方法：标本采集时，男性用无菌铝杆棉拭子插入尿道2cm～3cm，女性先拭去宫颈表 面粘液，再用木杆拭子插入宫颈口1cm～2cm，置留2～3秒并旋转后取出，接种于5ml改良的S P-4培基试管中。
(三)培养方法：
1.改良SP-4培基的制备：按Tully等[1]的SP-4配方改进而成。每100ml培养基：牛肉浸液71.5ml，胰蛋白胨1g，蛋白胨0.53g，调pH7.6，105kPa 20分 钟高压灭菌。加添加物：50%葡萄糖1ml，CMRL-1066 5ml，25%新鲜酵母浸液10ml，小牛血清20ml，1%酚红0.2ml，青霉素钠盐(20万U/ml)0.5ml。最终pH为7.4～7.5。
2.培养与鉴定：标本种入液体培养基后，置37℃温箱培养，当培养液颜色由红变黄，清澈透明，视“培养可疑阳性”，用孔径0.45μm滤膜过滤，滤液转种到改良SP-4培养基中 ，置37℃培养。当培养基颜色再度由红变黄，则认为“初代培养阳性”。每批标本培养时，设阳性对照(培养基中加适量Mg标准菌株G-37)和阴性对照(Mg培养基)。每份标本观察 3～4个月仍不变色，认为“培养阴性”。若一周内变色或出现混浊及沉淀视为“非Mg生长” 。初代 培养阳性培养物用PCR法检测并参考其生物学特性来鉴定是否为Mg菌株。
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(四)PCR检测
1.引物设计：参照文献[4]设计的生殖支原体粘附蛋白基因(Mg-Pa, 140 000)引物而合成。序列如下：Mg-1：5′-TGTCTATGACCAGTATGTAC-3′，Mg-2：5′-CTGCTTTGGTCAAGACATCA-3′，预期扩增片段为374bp，由美国Cybersyn公司合成。
2.模板DNA的制备：按文献[5]。
3.PCR反应：方法按文献[5]。
(五)统计学分析：均在SAS软件包上完成。分离率比较用Pearson χ2 检验和Fisher精确概率法。
结 果
(一)性病患者和性罪错者Mg分离结果：见附表。附表显示，北京、南京和上 海三个地区227份临床标本中，分离到8株Mg，分离率为3.52%。其中性病患者分离率为5.2 1%(5/96)，性罪错者为2.29%(3/131)。两者无显著性差异(χ2=0.66，P0.05)。北京地区性病患者Mg分离率(5.56%)与南京地区分离率(4.17%)无显著性差异 (P=1.00)。在性罪错者中，北京分离率为2.38%，上海为2.13%，两地 无显著性差异(P=1.00)。
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(二)不同性别Mg分离率比较：性病患者中，男性Mg分离率为5.26%(1/ 19)，女性为5.19%(4/77)，二者无显著性差异(P=1.00)。性罪错者男女 Mg分离率分别为0和2.97%(3/101)，P=1.00。两种人群合 计男性分离率为2.04%(1/49)，女性为3.93%(7/178)，无显著性差异(χ2=0. 04，P0.05)。
(三)Mg分离株初代生长情况、PCR结果及背景资料：初代生长时间(8株Mg)最短为30天，最长 55天，平均36.5天。8株Mg用选自Mg吸附蛋白基因
附表 北京、南京和上海性病患者及性罪错者
生 殖支原体分离情况 地区
培养例数
初代培养
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可疑数
初代培养
阳性数
PCR
阳性数
确认
菌株数
分离率
(%)
性病患者
96
44
6
, 百拇医药 5
5
5.21
北京
72
37
5
4
4
5.56
南京
24
7
1
, 百拇医药
1
1
4.17
性罪错者
131
69
3
3
3
2.29
北京
84
35
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2
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2.38
上海
47
34
1
1
1
2.13
合 计
227
113
9
, 百拇医药
8
8
3.52
序列的引物均可扩增出374 bp特异性片段。8例Mg分离培养和PCR检测均阳性 的受检者中，5例为性病患者(分别患有淋病、尖锐湿疣、非淋菌性尿道炎)，3例为性罪错者(性伴3～4个)。年龄22～46岁，平均28岁。女7例，男1例 。北京6例，上海和南京各1例。职业为农民、干部、服务员、家庭妇女各1例，个体和待业者各2例。
讨 论
从1995年3月开始，我们率先对高危人群泌尿生殖道分泌物进行培养并获成功。从病原学上首次证实我国京、沪、宁地区高危人群中存在Mg感染。我们从性病患者和性罪错者中分离出8株Mg，其生物特性与Tully[1]所描述的Mg特征相 符合：①仅在SP-4培基上生长；②初代生长时间缓慢(至少1个月)；③能发酵葡萄糖，不分解精氨酸及尿素；④在液体培养基中生长时，培养基呈透明状，无混浊及沉淀产生；⑤对青霉素不敏感；⑥可通过0.45μm微孔滤膜；⑦用PCR技术，根据Mg-Pa特征性引物序列，可扩增出Mg-DNA的特异性片段；⑧培养阳性者的生殖泌尿道分泌物PCR检测均为阳性。所以，从 培养特性(营养要求、培养基、培养条件、初代生长时间、生化反应、可滤过性、抑菌剂)以 及PCR检测阳性等综合判断，确认所分离的8个菌株为Mg的根据是充分的。
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Mg难分离的原因如下：①初代培养时间太长，要耐心观察，工作量大；②长期37℃培养，培 养基挥发、液量减少及自然变色，造成判断困难；③标本中杂菌发酵葡萄糖使培养基变色， 干扰 Mg生长并难鉴别；④初代Mg培养物不稳定，极易死亡，常造成转代失活或菌株丢失而无法进 行菌落形态、血清学及有关试验。为提高分离培养成功率，被检分泌物应及时进行PCR检测 ，对阳性标本倍加注意，这是关键。
志谢 PCR检测得到北京医科大学第一医院孔繁荣大夫大力协助
参考文献
1 Tully JG, Taylor-Robinson D, Cole RM, et al. A newly di scovered mycoplasma in the human urogenital tract. Lancet, 1981,1∶1288-1291.
2 Taylor-Robinson D. The history and role of Mycoplasma genitali um in sexually transmitted diseases. Genitourin Med, 1995,71∶1-8.
, 百拇医药
3 Jensen JS, Hansen HT, Lind K. Isolation of Mycoplasma genitaliu m strains from the male urethra. J Clin Microbiol, 1996,34∶286-291.
4 Palmer HM, Gilroy CB, Furr PM, et al. Development and evaluation of the polymer ase chain reaction to detect Mycoplasma genitalium. FEMS Microbi ol Lett, 1991,77∶199-204.
5 孔繁荣, 朱学骏, 周骏马, 等. 泌尿生殖道人型支原体和生殖支原体的检测. 临床皮肤科杂志, 1996,25∶3-5., 百拇医药