人乳头瘤病毒18型E6E7反义RNA表达重组体的构建
作者：郭庆 曾凡钦 吕凌 王斌
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院皮 肤科(郭庆 曾凡钦)；分子医学研究中心[吕凌(指导者) 王斌(指导者)]
关键词：HPV18E6E7；逆转录病毒载体；反义RNA
中国皮肤科杂志980304 【摘要】 目的 为了探讨人乳头瘤病毒(HPV)的致 病机理和寻找由HPV所致疾病的治疗途径，研究了HPV18型E6E7反义RNA表达重组体的构建。 方法 以HPV18型全基因质粒为模板，聚合酶链反应扩增出HPV18 型E6E7区816bp片段，以逆转录病毒pLNSX为载体，构建HPV18型E6E7逆转录病毒重组体，并 以限制性内切酶酶切和Southern杂交分别鉴定插入方向和特异性检测。 结果和结论 筛选出可表达HPV18型E6E7逆转录病毒重组体。该反义RNA表达重组体的构建为进一步研究E6E7基因的作用，以及探索是否能通过反义技术调控E6E7基因的表达打下基础。
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Construction of Human Papillomavirus Type 18 E6E7 Antisens e RNA Expres sing Recombinants Guo Qing,Zeng Fanqin,Lu Ling,et al. Depart ment of Dermatology,Memori al Hospital of Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510120
【Abstract】 Objective In order to study the pathogenesis of h uman papillomavi rus(HPV) and seek for a therapeutic approach of the diseases caused by HPV, th e construction of HPV18 E6E7 antisense RNA expressing recombinants was studied. Meth ods We amplified the HPV18 E6E7 816bp by PCR with HPV18 plasmid DNA as the temp late. pLNSX retroviruses were used as vectors,the HPV18 E6E7 retrovirus recombi n ants were constructed. And then the recombinants were cleaved with restriction e ndonuclease and hybridized with Southern blot for identifying the inserting dire ction and speci al check respectively. Results and conclusion The HPV18 E6E7 an tisense RNA-retrovirus expres sing recombinants were screened and obtained,which had laid the foundation of st udying the function of E6E7 genes further and explore whether the antisense te chnique can adjust and control the expression of E6E7 genes.
, 百拇医药
【Key words】 HPV18E6E7 Retrovirus vector Antisense RNA[ HJ
人乳头瘤病毒(HPV)是与性传播疾病和生殖器肿瘤密切相关的小DNA病毒。由H PV引起的肛周、生殖器疣的发病率近年来急剧上升，且治疗困难，复发率高；现已证明某些类型的HPV与生殖器肿瘤关系密切[1]。因此，如何控制HPV感染是 当今研究的热点之一。近几年以反义技术研究和调控基因的表达[2，3]，已开辟了基因治疗的新领域，并已取得一些进展[4]。 本实验利用聚合酶链反应(PCR)技术，扩增了HPV18型E6E7基因，并成功地构建了可表达HPV1 8型E6E7反义RNA逆转录病毒重组体，现报道如下。
材料和方法
(一)菌种和试剂：HPV18全基因重组质粒和逆转录病毒载体pLNSX自行构建和备用，宿主菌JM109，PCR试剂盒，限制性内切酶，琼脂酶，Klenow酶，T4 DNA连接酶，DIG -DNA探针标记试剂盒均购自德国Beohringer Mamheim公司(BM公司)。
, 百拇医药
(二)引物设计：以基因库中的A06324号序列为蓝本设计引物。A06324号序列为HPV E1、E6/E7基因序列。上游引物：5′-CCACAATACTATGGCGCGCTT
TG-3′，为A06324号序列中的108-130nt顺序。下游引物：5′-TGCTTACTGCTGGGATGCACACC-3′，为A06324号序列901-923nt顺序。以DNASIS7.1版本软件设计后以ABI391型全自动寡核苷酸合成仪人工合成。
(三)目的基因扩增：以克隆的HVP18型 DNA为模板，以上述引物进行PCR扩增，得HPV E6E7区 816bp的片段。后者以Klenow酶补齐末端后以低熔点琼脂糖电泳回收。
(四)基因克隆：以逆转录病毒载体pLNSX(基因库中SYNMMLPLN2号序列)为载体，经HindⅢ酶 切后以Klenow酶补齐末端，然后与低熔点琼脂糖回收的HPV E6E7区816bp片段共同沉淀。沉 淀物加T4 DNA连接酶连接，连接物转化感受态E.Coli JM109后涂LBA板培养，以X-gal/IPTG 筛选白色菌落进一步鉴定。
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(五)克隆鉴定：将筛选出的阳性克隆，按常规方法进行限制性内切酶酶切和电泳。pLN-HPV 酶切图谱见图1。
图1 pLN-HPV酶切图谱
(六)杂交鉴定：将回收的816bp目的基因用DIG-DNA探针标记试剂盒进 行随机引物标记以制备探针。将图2电泳模式以尼龙膜作Southern电泳转移，然后与上述探针进行杂交。
图2 pLN-HPV酶切PCR鉴定图
结 果
(一)酶切鉴定插入方向：根据图1目的基因反向插入载体的酶切图谱，将筛选出的阳性克隆进行酶切和电泳，第9泳道为PCR扩增的HPV E6E7片段(目的基因)；第8泳道 为HindⅢ酶切的逆转录病毒载体pLNSX；第7、6、5、4、3泳道为目的基因反向插入逆转录病 毒载体后分别以CLaⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ等酶切，第2泳道为上游和下游引物 对重组体pLN-HPV质粒DNA进行长片段PCR扩增的产物，理论计算应产生附表的酶切片段。
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实际电泳结果见图2，以第1泳道为DNA分子量
附表 克隆的HPV18经部分限制性酶切及PCR产物电泳结果 泳道
内切酶/PCR
酶 切片段大小(bp)
2
长片段PCR扩增
820
3
EcoRⅠ
5356，1613
4
SmaⅠ
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3094，2005，1870
5
XbaⅠ
6399，570
6
BamHⅠ
5831，1138
7
CLaⅠ
6969
8
HindⅢ
6149
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9
PCR扩增
820
标准SppⅠ/EcoRⅠ，其DN A条带大小(bp)如图2所示，将图2右侧的其余泳道跑出条带分别与分子量标准条带比较，可 知其所有片段大小与理论计算值是完全符合的。
(二)杂交鉴定：结果见图3。第9泳道的目的基因杂交阳性；第8泳道的载体阴性；第7泳道的 线性化重组体阳性；第6泳道的1138bp条带阳性而5831bp条带阴性；第5泳道的6399bp条带阳性而570bp条带阴性；第4泳道的1870bp条带阳性而3094bp条带阴性；第3泳道的5356bp条带阳性而1613bp条带阴性；第2泳道的PCR扩增产物杂交阳性。
图3 pLN-HPV Southern杂交鉴定图
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讨 论
HPV至今不能体外培养。HPV16或18型E6E7为目前国内外学者研究最多的一对基因[5，6]。因为，①这2型E6E7能完整地整合入宫颈癌细胞内 ，并能稳定传代；②E6E7的mRNA在宫颈癌中呈高水平表达，其合成的蛋白能与细胞中的肿瘤抑 制基因产物p53蛋白或p105Rb蛋白结合，参与细胞转化和肿瘤发生[7，8] ；③在HPV所致皮肤、粘膜良性病变中，E6E7与维持病毒DNA在染色体外高拷贝数有 关[9]。为进一步证实E6E7的作用，以及探索是否能通过反义技术 调控E6E7 基因的表达，我们首先研究了HPV18型E6E7反义RNA表达重组体的构建。本研究使用PCR技术和基因克隆技术获取了pLN-HPV E6E7重组体，其逆转录病毒载体pLNSX采用的是基因库中的SYNMMLPLN2号序列，基因片段为6149bp，与以往我们使用的载体pzip-neoSV(X)比较[10]，其可供选择的酶切位点增加，基因序列了解更清楚，致肿瘤性减少，因此，是新一代载体；限制性内切酶可精确地识别DNA链上酶切位点，酶切产生若干 大小不同的核酸片段，电泳后进行测定，即可确定插入方向，本文图2的实际酶切结果完全 与理论计算值相符，证实所筛选的重组体就是反义RNA重组体。本研究中Southern核酸杂交 以目的基因片段为探针，进一步证实了重组体中目的基因的存在，图3可见凡含目的基因片 段出现杂交阳性带，与图2比较，不含目的基因片段出现杂交阴性(缺失)。我们使用限制性内切酶鉴定结合Southern核酸杂交法，起到了互为补充、互相证实的作用。
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参 考 文 献
1 Higgines GD, Uzelin DM, Phillips GE, et al. Pres ence and distribution of HPV sense and antisense RNA transcripts in genital canc ers. J Gen Virol, 1991,72∶885-895.
2 Tzant JG, Weintraub H. Constitutive and conditional suppression of exog enous and endogenous genes by anti-sense RNA. Science, 1985,229∶345-352.[ ZK)
3 Wilson JM, Jefferson DM, Chowphury JR, et al. Retrovirus-media ted tran sduction of adult hepatocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85∶3014-3018.
, 百拇医药
4 米庆胜, 周丽综述. 反义技术与病毒性皮肤病. 国外医学皮肤性病学分 册, 1996,22∶26-28.
5 Watanabe S, Kanda T, Yoshiike K. Growth dependence of HPV16 DNA -positive cervi cal cancer cell lines and HPV16-transformed human and rat cells on the viral on coproteins. Int J Cancer, 1993,84∶1043-1049.
6 B
hm S, Wilczymski SP, Pfister H, et al. The predomin ant mRNA class i n HPV16-infected genital neoplasias does not encode the E6 or the E7 protein. I nt J Cancer, 1993,55∶791-798.
, 百拇医药
7 Hu G, Liu W, Hanania EG, et al. Suppression of tumorigenesis by transcription u nits expressing the antisense E6 and E7 mRNA for the transforming proteins of HP V and the sense mRNA for the retinoblastoma gene in cervical carcinoma cells. Ca ncer Gene Ther, 1995,2∶19-32.
8 Munger K, Phelps WC, Bubb V, et al. The E6 and E7 genes of the HPV16 together a re necessary and sufficient for transformation of primary human kerationcytes. J Virol, 1989,10∶4419-4421.
9 侯云德. 分子病毒学. 北京: 学苑出版社, 1990.187-196.
10 王斌, 曹丽萍, 杨斌, 等. 构建人CD23及其反义RNA的逆转录病毒表达重组体. 中山医科大学学报, 1996,17∶91-94.
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单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院皮 肤科(郭庆 曾凡钦)；分子医学研究中心[吕凌(指导者) 王斌(指导者)]
关键词：HPV18E6E7；逆转录病毒载体；反义RNA
中国皮肤科杂志980304 【摘要】 目的 为了探讨人乳头瘤病毒(HPV)的致 病机理和寻找由HPV所致疾病的治疗途径，研究了HPV18型E6E7反义RNA表达重组体的构建。 方法 以HPV18型全基因质粒为模板，聚合酶链反应扩增出HPV18 型E6E7区816bp片段，以逆转录病毒pLNSX为载体，构建HPV18型E6E7逆转录病毒重组体，并 以限制性内切酶酶切和Southern杂交分别鉴定插入方向和特异性检测。 结果和结论 筛选出可表达HPV18型E6E7逆转录病毒重组体。该反义RNA表达重组体的构建为进一步研究E6E7基因的作用，以及探索是否能通过反义技术调控E6E7基因的表达打下基础。
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Construction of Human Papillomavirus Type 18 E6E7 Antisens e RNA Expres sing Recombinants Guo Qing,Zeng Fanqin,Lu Ling,et al. Depart ment of Dermatology,Memori al Hospital of Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510120
【Abstract】 Objective In order to study the pathogenesis of h uman papillomavi rus(HPV) and seek for a therapeutic approach of the diseases caused by HPV, th e construction of HPV18 E6E7 antisense RNA expressing recombinants was studied. Meth ods We amplified the HPV18 E6E7 816bp by PCR with HPV18 plasmid DNA as the temp late. pLNSX retroviruses were used as vectors,the HPV18 E6E7 retrovirus recombi n ants were constructed. And then the recombinants were cleaved with restriction e ndonuclease and hybridized with Southern blot for identifying the inserting dire ction and speci al check respectively. Results and conclusion The HPV18 E6E7 an tisense RNA-retrovirus expres sing recombinants were screened and obtained,which had laid the foundation of st udying the function of E6E7 genes further and explore whether the antisense te chnique can adjust and control the expression of E6E7 genes.
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【Key words】 HPV18E6E7 Retrovirus vector Antisense RNA[ HJ
人乳头瘤病毒(HPV)是与性传播疾病和生殖器肿瘤密切相关的小DNA病毒。由H PV引起的肛周、生殖器疣的发病率近年来急剧上升，且治疗困难，复发率高；现已证明某些类型的HPV与生殖器肿瘤关系密切[1]。因此，如何控制HPV感染是 当今研究的热点之一。近几年以反义技术研究和调控基因的表达[2，3]，已开辟了基因治疗的新领域，并已取得一些进展[4]。 本实验利用聚合酶链反应(PCR)技术，扩增了HPV18型E6E7基因，并成功地构建了可表达HPV1 8型E6E7反义RNA逆转录病毒重组体，现报道如下。
材料和方法
(一)菌种和试剂：HPV18全基因重组质粒和逆转录病毒载体pLNSX自行构建和备用，宿主菌JM109，PCR试剂盒，限制性内切酶，琼脂酶，Klenow酶，T4 DNA连接酶，DIG -DNA探针标记试剂盒均购自德国Beohringer Mamheim公司(BM公司)。
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(二)引物设计：以基因库中的A06324号序列为蓝本设计引物。A06324号序列为HPV E1、E6/E7基因序列。上游引物：5′-CCACAATACTATGGCGCGCTT
TG-3′，为A06324号序列中的108-130nt顺序。下游引物：5′-TGCTTACTGCTGGGATGCACACC-3′，为A06324号序列901-923nt顺序。以DNASIS7.1版本软件设计后以ABI391型全自动寡核苷酸合成仪人工合成。
(三)目的基因扩增：以克隆的HVP18型 DNA为模板，以上述引物进行PCR扩增，得HPV E6E7区 816bp的片段。后者以Klenow酶补齐末端后以低熔点琼脂糖电泳回收。
(四)基因克隆：以逆转录病毒载体pLNSX(基因库中SYNMMLPLN2号序列)为载体，经HindⅢ酶 切后以Klenow酶补齐末端，然后与低熔点琼脂糖回收的HPV E6E7区816bp片段共同沉淀。沉 淀物加T4 DNA连接酶连接，连接物转化感受态E.Coli JM109后涂LBA板培养，以X-gal/IPTG 筛选白色菌落进一步鉴定。
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(五)克隆鉴定：将筛选出的阳性克隆，按常规方法进行限制性内切酶酶切和电泳。pLN-HPV 酶切图谱见图1。
图1 pLN-HPV酶切图谱
(六)杂交鉴定：将回收的816bp目的基因用DIG-DNA探针标记试剂盒进 行随机引物标记以制备探针。将图2电泳模式以尼龙膜作Southern电泳转移，然后与上述探针进行杂交。
图2 pLN-HPV酶切PCR鉴定图
结 果
(一)酶切鉴定插入方向：根据图1目的基因反向插入载体的酶切图谱，将筛选出的阳性克隆进行酶切和电泳，第9泳道为PCR扩增的HPV E6E7片段(目的基因)；第8泳道 为HindⅢ酶切的逆转录病毒载体pLNSX；第7、6、5、4、3泳道为目的基因反向插入逆转录病 毒载体后分别以CLaⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ等酶切，第2泳道为上游和下游引物 对重组体pLN-HPV质粒DNA进行长片段PCR扩增的产物，理论计算应产生附表的酶切片段。
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实际电泳结果见图2，以第1泳道为DNA分子量
附表 克隆的HPV18经部分限制性酶切及PCR产物电泳结果 泳道
内切酶/PCR
酶 切片段大小(bp)
2
长片段PCR扩增
820
3
EcoRⅠ
5356，1613
4
SmaⅠ
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3094，2005，1870
5
XbaⅠ
6399，570
6
BamHⅠ
5831，1138
7
CLaⅠ
6969
8
HindⅢ
6149
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9
PCR扩增
820
标准SppⅠ/EcoRⅠ，其DN A条带大小(bp)如图2所示，将图2右侧的其余泳道跑出条带分别与分子量标准条带比较，可 知其所有片段大小与理论计算值是完全符合的。
(二)杂交鉴定：结果见图3。第9泳道的目的基因杂交阳性；第8泳道的载体阴性；第7泳道的 线性化重组体阳性；第6泳道的1138bp条带阳性而5831bp条带阴性；第5泳道的6399bp条带阳性而570bp条带阴性；第4泳道的1870bp条带阳性而3094bp条带阴性；第3泳道的5356bp条带阳性而1613bp条带阴性；第2泳道的PCR扩增产物杂交阳性。
图3 pLN-HPV Southern杂交鉴定图
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讨 论
HPV至今不能体外培养。HPV16或18型E6E7为目前国内外学者研究最多的一对基因[5，6]。因为，①这2型E6E7能完整地整合入宫颈癌细胞内 ，并能稳定传代；②E6E7的mRNA在宫颈癌中呈高水平表达，其合成的蛋白能与细胞中的肿瘤抑 制基因产物p53蛋白或p105Rb蛋白结合，参与细胞转化和肿瘤发生[7，8] ；③在HPV所致皮肤、粘膜良性病变中，E6E7与维持病毒DNA在染色体外高拷贝数有 关[9]。为进一步证实E6E7的作用，以及探索是否能通过反义技术 调控E6E7 基因的表达，我们首先研究了HPV18型E6E7反义RNA表达重组体的构建。本研究使用PCR技术和基因克隆技术获取了pLN-HPV E6E7重组体，其逆转录病毒载体pLNSX采用的是基因库中的SYNMMLPLN2号序列，基因片段为6149bp，与以往我们使用的载体pzip-neoSV(X)比较[10]，其可供选择的酶切位点增加，基因序列了解更清楚，致肿瘤性减少，因此，是新一代载体；限制性内切酶可精确地识别DNA链上酶切位点，酶切产生若干 大小不同的核酸片段，电泳后进行测定，即可确定插入方向，本文图2的实际酶切结果完全 与理论计算值相符，证实所筛选的重组体就是反义RNA重组体。本研究中Southern核酸杂交 以目的基因片段为探针，进一步证实了重组体中目的基因的存在，图3可见凡含目的基因片 段出现杂交阳性带，与图2比较，不含目的基因片段出现杂交阴性(缺失)。我们使用限制性内切酶鉴定结合Southern核酸杂交法，起到了互为补充、互相证实的作用。
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参 考 文 献
1 Higgines GD, Uzelin DM, Phillips GE, et al. Pres ence and distribution of HPV sense and antisense RNA transcripts in genital canc ers. J Gen Virol, 1991,72∶885-895.
2 Tzant JG, Weintraub H. Constitutive and conditional suppression of exog enous and endogenous genes by anti-sense RNA. Science, 1985,229∶345-352.[ ZK)
3 Wilson JM, Jefferson DM, Chowphury JR, et al. Retrovirus-media ted tran sduction of adult hepatocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85∶3014-3018.
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4 米庆胜, 周丽综述. 反义技术与病毒性皮肤病. 国外医学皮肤性病学分 册, 1996,22∶26-28.
5 Watanabe S, Kanda T, Yoshiike K. Growth dependence of HPV16 DNA -positive cervi cal cancer cell lines and HPV16-transformed human and rat cells on the viral on coproteins. Int J Cancer, 1993,84∶1043-1049.
6 B
hm S, Wilczymski SP, Pfister H, et al. The predomin ant mRNA class i n HPV16-infected genital neoplasias does not encode the E6 or the E7 protein. I nt J Cancer, 1993,55∶791-798., 百拇医药
7 Hu G, Liu W, Hanania EG, et al. Suppression of tumorigenesis by transcription u nits expressing the antisense E6 and E7 mRNA for the transforming proteins of HP V and the sense mRNA for the retinoblastoma gene in cervical carcinoma cells. Ca ncer Gene Ther, 1995,2∶19-32.
8 Munger K, Phelps WC, Bubb V, et al. The E6 and E7 genes of the HPV16 together a re necessary and sufficient for transformation of primary human kerationcytes. J Virol, 1989,10∶4419-4421.
9 侯云德. 分子病毒学. 北京: 学苑出版社, 1990.187-196.
10 王斌, 曹丽萍, 杨斌, 等. 构建人CD23及其反义RNA的逆转录病毒表达重组体. 中山医科大学学报, 1996,17∶91-94.
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